Methodenartikel

Een verbeterde methode voor nauwkeurige en snelle meting van Vliegprestaties in Drosophila

DOI:

10.3791/51223

⸱

13 februari 2014

 , 
1Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een methode voor een snelle en nauwkeurige meting van vliegprestaties in Drosophila, waardoor high-throughput screening.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila heeft bewezen een bruikbaar model systeem voor de analyse van het gedrag, met inbegrip van de vlucht zijn. De eerste vlucht tester betrokken dropping vliegt in een geoliede maatcilinder; landing hoogte aanwezig is een maat voor de vliegprestaties door het beoordelen hoe ver vliegen zal vallen voordat het produceren van voldoende stuwkracht om contact met de wand van de cilinder te maken. Hier beschrijven we een bijgewerkte versie van de vlucht tester met vier belangrijke verbeteringen. Eerst voegden we een "drop tube" zodat alle vliegen alstublieft de cilinder vlucht op een vergelijkbare snelheid tussen processen, waardoor variabiliteit tussen gebruikers. Ten tweede, we vervangen de olie coating met uitneembare kunststof platen bekleed in Tangle-Trap, een lijm ontwikkeld om levende insecten vangen. Ten derde gebruiken we een langere cilinder om meer accurate discriminatie vlucht vermogen mogelijk te maken. Vierde gebruiken we een digitale camera en imaging software om het scoren van vliegprestaties automatiseren. Deze verbeteringen zorgen voor de rapid, kwantitatieve beoordeling van vlieggedrag, handig voor grote datasets en grootschalige genetische screens.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila is lange tijd gebruikt om de genetische basis van het gedrag 1 te bestuderen, en onderzoekers hebben een aantal manieren om verschillende gedragingen 2-6 analyseren ontwikkeld. Vliegen zijn bijzonder nuttig bij het ​​verstrekken van bruikbare modellen van neuromusculaire aandoeningen 7 geweest. Een veel voorkomende test gebruikt om motorische gedrag te bestuderen is vliegprestaties. De oorspronkelijke vlucht tester is nuttig voor het identificeren vlucht defecte mutanten en voor de kwantitatieve beoordeling van de vlucht het vermogen 1, maar het heeft een aantal tekortkomingen die zijn aanvraag voor high throughput schermen beperken: het gebruik van geoliede cilinders is rommelig en omslachtig, bepaalde functies zoals de lengte van de cilinder en invoering van ongedierte in de buis met variabele kracht kunnen kwantitatieve nauwkeurigheid, en het is moeilijk om levende vliegen herstellen van de tester. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we de vlucht tester gemodificeerd om een ​​aantal verbeteringen. We voegden een "drop tuworden "om vliegen de variabiliteit tussen experimenten en gebruikers elimineren introduceren. We maken gebruik van verwijderbare acryl platen bekleed met een kleefstof die zorgt voor eenvoudiger opruimen en herstel van individuele vliegen. We hebben de lengte van de vlucht buis verhoogd tot kwantitatieve nauwkeurigheid en betrouwbaarheid te verbeteren. Tenslotte maken we gebruik van een digitale camera en imaging software om de landing hoogten van vliegen te berekenen. Wij geloven dat deze verbeteringen zullen nuttig zijn in elk laboratorium geïnteresseerd in het uitvoeren van grootschalige genetische screens voor gebreken in vliegprestaties zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Monteer Flight Tester

  1. Veilige vlucht cilinder Ring Stand 1 behulp kettingklemmen. (Laat ongeveer 3 cm onder de cilinder voor wegen gerecht.)
    (Opmerking: De vlucht cilinder we gebruiken is 90 cm lang met een diameter van 13,5 cm.)
  2. Plaats Weeg met een dun laagje minerale olie onder de cilinder vlucht.
  3. Secure trechter Ring Stand 2 met behulp van een ring klem en klauw klem. De hoogte van de trechter, zodat de onderkant van de trechter gelijk ligt met de bovenkant van de cilinder vlucht. (Opmerking: de tip diameter van de trechter moet kleiner zijn dan de buitendiameter van flacons geplaatst in de zaaipijp zodat de injectieflacons niet door zal vallen zijn.)
  4. Steek hangende buis in de bovenkant van de trechter en vast met een klauw klem.
    (Opmerking: We maken gebruik van een druppel buis die is 25 cm lang Dropping fly-bevattende flesjes uit deze hoogte maakt consistente uitwerpen van alle vliegen met uniforme kracht De binnendiameter van de valpijp moet sligh zijn..tgevoerd groter dan de buitendiameter van de flacon om de flacon vrij vallen.)
  5. Snijd polyacrylamide vel (len) naar de juiste grootte. (Opmerking: Om te helpen bij het plaatsen en verwijderen van de plaat, moet de breedte iets kleiner dan de binnenste omtrek van de cilinder vlucht zijn).
  6. Breng een dun laagje van Tangle-Trap naar de plaat. Laat zitten 1 uur voor gebruik. (Let op: Laat voldoende ruimte vrij aan de bovenkant en onderkant van het vel (ongeveer 3 cm) ongecoat om het laken voor het inbrengen / verwijderen begrijpen.)
  7. Plaats de polyacrylamide blad in de cilinder vlucht.
  8. Monteer de camera track met grenen steunbeugels. (Let op: zorg ervoor dat de onderkant van de baan de camera kan ondersteunen zonder het blokkeren van de lens zie figuur 1B..)
  9. Stoppers toevoegen en vastschroeven. (Let op: plaats de stoppers op locaties waarmee de camera om de hele kunststof plaat in panoramische modus te bekijken.)

2. Run Experiment

  1. Verzamel flacons van vliegen te testen. Voor het beste resultaat, gebruik niet meer dan 20 vliegen / flacon.
  2. Tik voorzichtig vliegen naar onderkant van flesje, loskoppelen en vervolgens invoegen in valpijp en laat flacon.
    (Opmerking: Het flesje naar beneden valt de daling buis totdat hij de smalle trechter opening raakt Wanneer de flacon raakt de trechter, worden de vliegen uitgeworpen in de cilinder vlucht..)
  3. Til de druppel buis naar de lege flacon te verwijderen.
    (Opmerking: Meerdere flacons van vliegen van dezelfde testgroep kan worden getest op een polyacrylamide vel We vinden dat tot 200 vliegen (10 flacons van 20 vliegen per stuk) kunnen worden getest en gemakkelijk afgebeeld op een vel..
  4. Verwijder het plastic en leg het op een vlakke witte ondergrond.
    (Opmerking: wit poster boord mogen worden gebruikt als bankje tops zijn donker gekleurd.)
  5. Monteer de camera spoor over de plastic plaat. De camera moet voldoende hoog boven het blad aan zowel de boven-en onderkant van het blad in het gezichtsveld hebben.
  6. Schuif de camera langs the spoor terwijl de "capture"-knop ingedrukt om een ​​panoramisch beeld te verwerven.
  7. Het aantal vliegen de landing in de olie kan handmatig worden geteld voor elk onderzoek.
  8. Herhaal stappen 2.2-2.7 alle omstandigheden in een bepaald experiment. De vliegen worden verwijderd van de plaat tussen elke proef. Alternatief kunnen meerdere bladen worden gebruikt, een nieuw vel voor elk onderzoek.

3. Data Collection

  1. Beeldbestanden opent met behulp van ImageJ software.
  2. Gewas beelden indien nodig alleen de landing oppervlakte omvatten. (Dit is het gebied bedekt met Tangle-Trap.)
  3. Beelden omzetten naar 8-bits grijsschaal.
  4. Maak een "drempel" om te filteren op de witte achtergrond.
    (Afbeelding → Pas → Threshold).
  5. Stel de parameters voor elke vlieg met het menu "deeltjes te analyseren" te identificeren.
    (Analyze → Analyseer Particles) Definieer de parameters die worden gebruikt om een ​​deeltje te identificeren. Met onze opgezet, vinden we dat het gebruik van eengebied van 5-90 pixels 2 en een circulariteit van 0,4-1,0 zal nauwkeurig te identificeren alle monsters.
  6. Meet de locatie van elke vliegen met de gegenereerde lijst coördinaten voor elk deeltje. De x-coördinaat in pixels worden omgezet in centimeter tot de overloop hoogte berekenen.
  7. Importeer tabel in een spreadsheet (zoals Microsoft Excel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1A toont een schema van de bijgewerkte vlucht tester montage. Figuur 1B illustreert het spoor ontwerp laat de camera een panoramisch beeld te nemen zonder het blokkeren van het gezichtsveld. Representatieve resultaten worden getoond in Figuur 2, waar de prestaties van slowpoke mutantvliegen, die een bekende vlucht defect 8-10 hebben vlucht, vergeleken met wildtype Canton-S vliegt. Controle vliegt vaste land nabij de bovenkant va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de hier beschreven methoden, zijn we in staat om vliegprestaties van een groot aantal van Drosophila mutanten snelle beoordeling, waardoor een grotere efficiëntie dan voorheen mogelijk was. Voor onze experimenten hebben we routinematig scheiden mannen en vrouwen en hen op te voeden bij lage dichtheid (minder dan 20 vliegen / flacon) om agressie die vleugels kunnen beschadigen beperken. Een andere belangrijke overweging is om goed te controleren voor verschillen in vliegprestatie gevolg van versch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent F32 NS078958 (DTB) en R01 AG033620 (BG).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Putty knifeHome Depot630147www.homedepot.com
Pine back band moulding (2x)Home Depot156469www.homedepot.com
Furring Strip BoardHome Depot164704www.homedepot.com
Tangle-Trap Insect Trap CoatingBioControl Network268941www.biconet.com
Laptop Computer Applewww.apple.com/mac/
Mineral oilFisher ScientificBP26291www.fishersci.com
White poster boardStaples247403www.staples.com
Polystyrene weighing dishFisher ScientificS67091Awww.fishersci.com
ImageJ SoftwareNational Institutes of Healthhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Digital cameraSonyDSC-TX7www.store.sony.com
Fine forcepsFine Science Toolswww.finescience.com
Polycarbonate cylinder (drop tube)McMaster-Carr8585K62www.mcmaster.com
Flight cylinder (acrylic)McMaster-Carr8486K943www.mcmaster.com
Polycarbonate sheetsMcMaster-Carr85585K25www.mcmaster.com
ring stand (2x)Fisher ScientificS47808www.fishersci.com
Ring supportFisher ScientificS47791www.fishersci.com
Three-prong extension clamps (x2)Fisher Scientific05-769-7Qwww.fishersci.com
FunnelFisher Scientific10-500-3www.fishersci.com
chain clamps (2x)VWR21573-275www.vwr.com
Glass vialsVWR66020-198www.vwr.com

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
  2. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504(2011).
  3. de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192(2013).
  4. Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155(2007).
  5. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795(2012).
  6. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193(2007).
  7. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
  8. Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
  9. Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
  10. Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
  11. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
  12. Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
  13. Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vliegprestaties van DrosophilavliegtestervalbuisTangle Trap lijmdigitale camera beeldvormingImage J softwaremeting van de landingshoogtehigh throughput screeninganalyse van de vliegspierenneuromusculaire junctie

Gerelateerde artikelen