Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

Samenvatting

Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.

Samenvatting

Om een ​​enkel eiwit op meerdere subcellulaire organellen richten, planten typisch dupliceren de relevante genen, en een automatische elk gen afzonderlijk met behulp van complexe regulerende strategieën, inclusief differentiële promotors en / of signaal sequenties. Metabole ingenieurs en synthetische biologen vindt het richten enzymen een bepaalde organel staan ​​voor een uitdaging voor een eiwit dat moet worden gelokaliseerd in meer dan een organel, moet de technicus hetzelfde gen klonen meerdere keren. Dit werk brengt een oplossing voor deze strategie: evaluatie van alternatieve splitsing van mRNA. Deze technologie maakt gebruik van gevestigde chloroplast en peroxisoom targeting sequenties en combineert ze tot een enkel mRNA dat alternatieve wijze wordt gesplitst. Sommige splice varianten naar de chloroplast, wat het peroxisoom en genen tot het cytosol. Hier het systeem is ontworpen voor meerdere organel richt met alternatieve splicing. In dit werk werd GFP verwacht expr zijnEssed in de chloroplast, cytosol en peroxisomen door een reeks van rationeel ontworpen 5 'mRNA tags. Deze tags hebben het potentieel om de hoeveelheid klonen vereist wanneer heterologe genen moeten worden uitgedrukt in verschillende subcellulaire organellen verminderen. De constructen werden ontworpen eerder werk ¹¹ en werden gekloneerd middels Gibson samenstel, een ligatie onafhankelijke klonen methode die restrictie-enzymen vereist. De resulterende plasmiden werden geïntroduceerd in Nicotiana benthamiana epidermale blad cellen met een gemodificeerd Gene Gun protocol. Tenslotte werden getransformeerd bladeren waargenomen met confocale microscopie.

Inleiding

Dit werk is een metabole engineering / synthetische biologie project waarin plantencellen zijn ontworpen om een ​​reporter eiwit tot expressie in meerdere organellen, maar met slechts een enkele DNA-construct.

Een benadering om eiwitten te richten op meerdere locaties omvat klonen meerdere genetische kopieën, die elk een andere lokalisatie peptide. Elk exemplaar moet worden ingevoerd door de opeenvolgende retransformation, of als alternatief, door terugkruisen enkele transformaties ^1. Dit houdt extra klonen, en wordt beperkt door een lokalisatie tag per eindpunt.

Een andere manier om een proteïne te lokaliseren op meerdere locaties is door alternatieve splicing ^2-5. RNA wordt getranscribeerd vanaf een enkel gen, maar verschillende exemplaren van het transcript verschillend verwerkt, vaak meer dan een manier per cel. Dit kan leiden tot meer dan een boodschapper-RNA in de cel getranscribeerd uit een gen. Deze verschillende messenger RNA kan coderen voor verschillende isovormen van hetzelfde eiwit of in het geval van een frameshift, een ander eiwit helemaal. Hoewel alternatieve splicing is in de literatuur beschreven voor vele jaren, de werkingsmechanismen en geconserveerde donor en receptor splice sites worden alleen wordt meer recent opgehelderd ^6. Omdat deze sites worden beter beschreven, zij schept kansen voor engineering.

Plant metabole ingenieurs staan ​​voor een uitdaging bij een eiwit tot expressie in meerdere organellen. Voor een eiwit dat moet worden gelokaliseerd meerdere organel, moet de technicus hetzelfde gen klonen meerdere malen, elk met een aparte signaalsequentie richten aan het organel plaats. Voor een enkel gen in drie organellen, dit gewoon drie genen. Maar voor een zes-gen metabole route, dit uitgebreid tot 18 genen, een aanzienlijke inspanning klonen. Combineren van meerdere lokalisatie sequenties in een enkele, alternatief-gesplitste gen tekenificantly vermindert deze inspanning. Bijvoorbeeld, re-engineering fotorespiratie ^7,8 en isoprenoide synthese ^9,10 omvat zowel de chloroplasten en peroxisomen. In ons geval hebben we geprofiteerd van spliceplaatsen zoals waargenomen in een natuurlijke Arabidopsis thaliana systeem eerder beschreven ^6. We rationeel herontworpen de mRNA-sequentie alleen achter de natuurlijke splitsingsplaatsen, maar geplaatst sequenties die chloroplast-of peroxisoom targeting markeringen zouden coderen in de alternatieve splicing introns (Figuur 1). Het tot expressie gebrachte eiwit kan al dan niet een label, naargelang de pre-mRNA dat gecodeerd werd uitgesneden als een intron (figuren 1g en 1h). Voor meer informatie over het ontwerp van de constructies die in dit werk, zie het begeleidend artikel ^11.

Omdat dit nog steeds een aanzienlijke inspanning klonen, Gibson samenstel, een nieuwe methode voor het kloneren van DNA-constructen, is used in de bouw. De Gibson werkwijze kan worden gebruikt voor elke sequentie, ongeacht restrictieplaatsen (figuur 2) ^12-14. De specifieke combinatie van enzymen maakt een stap isotherm montage. Bij deze werkwijze worden meerdere dubbelstrengs lineaire DNA delen, dat zij overlappende sequenties van ~ 50 bp gemaakt. De Gibson assemblage enzym mix gedeeltelijk verteert het lineair DNA delen, het blootstellen van enkele strengen van homologe sequenties. Deze gedeeltelijke enkelstrengs sequenties worden opnieuw gegloeid in het reactiemengsel, waardoor een snelle, een-stap sequentie-onafhankelijke ligatie vrij subklonering reactie.

Dit werk beschrijft 1) rationeel ontwerp alternatief verbonden constructen voor expressie in planten chloroplasten, peroxisomen, en cytosols, 2) hun klonen met behulp van de nieuwe-ligatie vrije methode van Gibson assemblage, 3) de levering ervan in tabaksbladeren cellen met de Gene Gun, en 4) resultaten tonen organel targeting, zoals waargenomen met GFPen confocale microscopie.

Protocol

1. Ontwerp van alternatief-gesplitst Sequences voor Multiple Organel Targeting

1. Bepaal de locaties voor uiteindelijke eiwitexpressie. Voor dit werk, de rente is de gerichtheid op de chloroplasten, peroxisomen, en cytosol.
2. Gebruik de literatuur om eiwitten en DNA-sequenties bekend om proteïnen te richten op organellen van belang vast te stellen. In dit geval een chloroplast-gerichte sequentie van Arabidopsis thaliana L-isoaspartate methyltransferase ^6,15 en een peroxisoom targeting sequentie van Arabidopsis thaliana transthyretine-als S-allantoïne synthase ^16,17 bepaald.
3. Identificeer een-alternatieve splicing regime dat de eiwitten van belang moet richten op de juiste organellen. Voor dit werk, splicingplaatsen zoals waargenomen in een natuurlijke Arabidopsis systeem ^6. De mRNA-sequentie werd herontworpen nalatende het natuurlijk splice sites, maar sequenties werden geplaatst codering chloroplast-of peroxisomenome-targeting-tags binnen het alternatief-splicing introns (figuur 1).

2. Gibson Vergadering van DNA Parts

Zie ook figuur 2.

De Gibson montagemethode is afhankelijk van de werking van verschillende enzymen in een vooraf gemaakte mengsel 1) gedeeltelijk verteren de uiteinden van het dubbelstrengs DNA met enkelvoudige strengen en 2) gloeien gratis basenparen van DNA naburige onderdelen. Dit maakt klonering van DNA-fragmenten niet de specifieke restrictieplaatsen.

1. Kies een volgorde van de elementen in het DNA-plasmide-construct. Als voorbeeld TriTag-1 heeft elementen: a) een plasmide vector (porie met een GFP-construct bekend te werken in planten, een kanamycine resistentie merker, en oorsprong van replicatie voor E. coli en Agrobacterium tumefaciens systemen), b) een promotersequentie (P _ENTCUP2 getoond constitutief te zijn in planten), C) een chloroplast-gerichte sequentie (CTS), c) een peroxisoom targeting sequentie (PTS), en d) een aantal splitsingsplaatsen zoals eerder beschreven ^6.
2. Ontwerpen van het construct base-voor-base met in silico ontwerpsoftware. ApE is een open source freeware pakket nuttig is voor dit werk.
   Opmerking: TriTag-1, heeft de volgorde: plasmidevector, promoter, ATG, splitsingdonorplaats, chloroplast doelsequentie splitsingdonorplaats, neutraal site splice acceptor site peroxisoom doelsequentie, splice acceptor site GFP vervat in plasmidevector .
   1. Het ontwerp van de in silico DNA-construct, zodanig dat er een 50-bp overlap tussen de stukken bij het ​​bestellen van primers voor PCR. Het is mogelijk om de 50 bp overlap als primers gebruikt: 25 bp beide richtingen.
      1. Zorg ervoor dat u bij te houden van de oorsprong van elk van de reeks stukken. Is als: een plasmide worden gekweekt en miniprepped; een lineaire reeks die kan worden gebruikt als PCR-matrijs; of een sequentie die zal moeten wordencommercieel gesynthetiseerd? Verschillende bedrijven bieden goedkope DNA-synthese diensten voor fragmenten <500 bp. In dit geval, de TriTag zelf is 437 bp dus het voordelig het commercieel bestellen.
      2. De beste resultaten komen als alle fragmenten PCR-geamplificeerd en gezuiverd uit de matrijs DNA. De weerstand marker is een goede plek om deze grote DNA te splitsen in twee kleinere sjablonen die gemakkelijker PCR-versterkt zijn.
      3. Restrictie restrictie-enzymen DpnI knipt gemethyleerd DNA. Als de PCR-matrijs was een miniprep van E. coli, zal DpnI behandeling de verontreinigende template DNA te verwijderen.
3. Zuiveren van alle DNA-sequenties apart en elueren in water, TE of Buffer EB.
   1. Pore ​​vector deel 1, ~ 3000 bp (groene pijlen). PCR geamplificeerd en Dpnl behandeld.
   2. Pore ​​vector deel 2, ~ 3000 bp (zwarte pijlen). PCR geamplificeerd en Dpnl behandeld.
   3. TriTag insert, 437 bp (blauwe pijlen). Commercieel besteld. Resuspend in DDH ₂ O.
   4. P _ENTCUP promotor, ~ 750 bp (oranje pijlen). PCR-geamplificeerd en Dpnl behandeld.
4. Meet de concentratie van elk van de DNA delen. Streven naar 150 ng / ul van de vector stukken.
5. Neem een ​​hoeveelheid van de Gibson assemblage mix uit de vriezer en ontdooien op ijs. Dit is in de handel verkrijgbaar, maar ook eenvoudig te maken in het lab ^12-14.
   1. Er zijn twee stappen om dit recept: een stroperige 5x master mix en 15 ul reactie-formaat 1,33 x porties. De 5x master mix bevat: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 ul 1 M _MgCl2, 600 pi 10 mM van elk dNTP, 300 ul 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD, en DDH ₂ O 6 ml. Bereid 320 ul aliquots (18) en vries na alle bij -20 ° C. De oplossing zal heel viskeus. Label deze "5X isotherm buffer"
   2. Aan de ene resterende (320 pl), voeg 1,2 pl T5 Exonuclease, 20 pl Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, 160 ul Taq DNA Ligase en 700 ul DDH ₂ O. Bereid 15 pi aliquots (~ 80) op ijs in PCR buizen en bewaar bij -20 ° C.
6. Bepaal volumes equimolaire hoeveelheden van elk van de fragmenten. Er zijn een paar online calculators, waaronder Gibthon.org. Er moet een totaal van 5 ul van de DNA delen worden. Voeg ze toe aan de 15 ul Gibson mix aliquot. Indien vereist volumes te klein om pipet verdunnen DNA fragmenten en / of gebruiken meer dan een aliquot.
   1. Vergeet niet om een controle van de vector DNA alleen voor te bereiden (bijvoorbeeld het DNA-deel dat de resistentie tegen antibiotica marker) en vul aan met water.
7. Incubeer de buizen in een thermische cycler bij 50-55 ° C gedurende 30-60 minuten. Vervang op ijs en transformeren in E. coli via warmte-shock chemisch competente cellen. Gebruik geen elektrocompetente cellen. De hoge zoutconcentratie en de relatief lage DNA concentratiekan de cellen boog.
   1. Breng alle 20 ul van een commerciële bereiding van 200 pl calciumchloride competent E. coli.
      Incubeer op ijs 30 min en hitteschok 60 sec bij 42 ° C
   2. Terug naar ijs 2 minuten, de 750 pi SOC of LB-medium en terug te schudden in een microcentrifugebuis 30 minuten bij 37 ° C. Plaat van het mengsel en geschikte verdunningen op LB + Kan (of andere geschikte antibiotica). Dit kan resulteren in hogere achtergrond (en een hoger aantal niet-doelwit recombinatie) dan traditionele-ligatie gebaseerde klonen maar verdient het aanbeveling scherm ongeveer 10 kolonies.
8. Bevestig kloon via sequentie en slaan een monster bij -80 ° C

3. Biolistische Transfectie van tabak met de Gene Gun

Dit is een techniek die wordt opgericht in Jupiter ^18,19. De belangrijkste stappen en verschillen worden hierna beschreven.

1. Groeien 50-100 ml E. coli of 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep de cultuur. Een concentratie van ongeveer 1500 ng / ul moet gaan.
2. Bereid gen kogels zoals eerder beschreven. Plaats ze in de Gene Gun.
3. Voor transfectie van Nicotiana benthamiana tabaksblad epidermale weefsel, kiest een groot blad dicht bij de basis van een 3 maanden oude plant. Snijd het zorgvuldig en leg het ondersteboven neer op nat papier handdoeken in een 15 cm petrischaal.
4. Stel de He druk voor de Gene Gun 200-250 psi.
5. Doel voorzichtig Gene Gun tussen ribben op de onderzijde van een blad, ongeveer 3-5 cm erboven. Laat de veiligheid en leveren de deeltjes aan het blad. Elke kogel kan tweemaal worden gebruikt op dezelfde plaats op het blad. Als het blad explodeert, weggooien en een nieuw blad-er enige variatie in blad taaiheid door groeiomstandigheden zoals leeftijd, vocht, enz. Voor een 12-cm blad verwachten ongeveer 6 opnamen passen.
6. Sla het blad, bedekt met de bovenkant van eenPetrischaal voor 2-3 dagen bij weinig licht op de bank.
7. Onderzoek het blad in een dissectiemicroscoop uitgerust met UV-fluorescentie, en zoeken naar individuele cellen die GFP. Ontleden 5-10 mm delen van blad.
8. Dompel het blad in een diepe put microscoop dia onder ~ 200 ul 0,1% Triton X-100. Het wasmiddel voorkomt luchtbellen vormen op het oppervlak, en deepwell objectglaasje maakt een groter weefsel beeldgebied.

4. Confocale microscopie van Getransfecteerde Tissue

Deze instructies variëren voor elk instrument, dus is het essentieel om goed getraind.

1. Voor fluorescentie detectie experimenten, stelt de excitatie laser 489 nm, en stel de photomultiplier detectoren 500-569 nm voor GFP-fluorescentie en 630-700 nm voor chlorofyl auto-fluorescentie. Afbeelding cellen met behulp van een 40x water-immersie objectief.

Resultaten

Het ontwerp inspanning was een gevolg van aanzienlijke planning. Novel dit project is het gebruik van alternatieve splicing van een pre-mRNA dat vertaald in differentieel tot expressie gebrachte eiwitten te creëren. Deze eiwitten worden uitgedrukt in verschillende organellen, in dit geval de chloroplast, peroxisoom en / of cytosol. Wij aangepast natuurlijke Arabidopsis gen dat alternatieve wijze wordt gesplitst ⁶ en geplaatste bekende chloroplast ⁶ en peroxisoom ¹⁷ targeting seq...

Discussie

In deze studie worden eenvoudige strategieën beschreven voor het lokaliseren van een transgeen eiwit meerdere cellulaire compartimenten in planten. Het doel was construct dat een gen tot expressie zou meer dan een organel in Nicotiana benthamiana ontwerpen. Strategieën omvatten rationeel ontwerp van GFP-gebaseerde DNA-constructen, Gibson montage, levering van de plasmiden te bladcellen met de Gene Gun, en observatie van de resultaten met confocale microscopie.

Drie verschillende kor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Oligonucleotide primers	IDT	(custom)	Design specifically voor construct
GeneBlocks	IDT	(custom)	500 bp oligonucleotiden
ApE software	U Utah	(download)	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit	Qiagen	28004	Gebruikt om PCR-producten te zuiveren
QIAprep spin miniprep kit	Qiagen	27104	Gebruikt om kloning-geschikte hoeveelheden plasmide voor te bereiden
Phusion Master Mix met GC Buffer	NEB	M0532S	Gebruikt om het gen van belang te PCR-amplificeren
Gibson assembly reactiemix	NEB	E2611L	Mastermix van de volgende 9 ingrediënten
1 M Tris-HCl pH7.5	Teknova	T1075	Gibson assembly mix
1 M MgCl2	G Biosiences	82023-086	Gibson assembly mix
dNTP mix	Fermentas	R0192	Gibson assembly mix
1 M DTT	Fermentas	R0861	Gibson assembly mix
PEG-8000	Affymetrix	19966	Gibson assembly mix
NAD	Applichem	A1124,0005	Gibson assembly mix
T5 exonuclease	Epicentre	T5E4111K	Gibson assembly mix
Phusion polymerase	NEB	F530S	Gibson assembly mix
Taq DNA ligase	NEB	M0208L	Gibson assembly mix
Gibthon.org			Website om berekeningen te vereenvoudigen
Plasmid PLUS Maxi kit	Qiagen	12963	Gebruikt om DNA voor gene gun kogels voor te bereiden
Gene Gun systeem	BioRad	165-2451	Bevat alle noodzakelijke onderdelen
Nicotania benthamiana	(n/a)	(n/a)	Gift van Jen Sheen, MGH
Confocale microscoop	Leica	SP5 X MP	Beeldvorming van resulterende cellen
Deep well slides	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Gebruikt voor confocale beeldvorming
A Plasmid Editor (ApE)	University of Utah		http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator			http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/