Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Om een enkel eiwit op meerdere subcellulaire organellen richten, planten typisch dupliceren de relevante genen, en een automatische elk gen afzonderlijk met behulp van complexe regulerende strategieën, inclusief differentiële promotors en / of signaal sequenties. Metabole ingenieurs en synthetische biologen vindt het richten enzymen een bepaalde organel staan voor een uitdaging voor een eiwit dat moet worden gelokaliseerd in meer dan een organel, moet de technicus hetzelfde gen klonen meerdere keren. Dit werk brengt een oplossing voor deze strategie: evaluatie van alternatieve splitsing van mRNA. Deze technologie maakt gebruik van gevestigde chloroplast en peroxisoom targeting sequenties en combineert ze tot een enkel mRNA dat alternatieve wijze wordt gesplitst. Sommige splice varianten naar de chloroplast, wat het peroxisoom en genen tot het cytosol. Hier het systeem is ontworpen voor meerdere organel richt met alternatieve splicing. In dit werk werd GFP verwacht expr zijnEssed in de chloroplast, cytosol en peroxisomen door een reeks van rationeel ontworpen 5 'mRNA tags. Deze tags hebben het potentieel om de hoeveelheid klonen vereist wanneer heterologe genen moeten worden uitgedrukt in verschillende subcellulaire organellen verminderen. De constructen werden ontworpen eerder werk 11 en werden gekloneerd middels Gibson samenstel, een ligatie onafhankelijke klonen methode die restrictie-enzymen vereist. De resulterende plasmiden werden geïntroduceerd in Nicotiana benthamiana epidermale blad cellen met een gemodificeerd Gene Gun protocol. Tenslotte werden getransformeerd bladeren waargenomen met confocale microscopie.
Inleiding
Dit werk is een metabole engineering / synthetische biologie project waarin plantencellen zijn ontworpen om een reporter eiwit tot expressie in meerdere organellen, maar met slechts een enkele DNA-construct.
Een benadering om eiwitten te richten op meerdere locaties omvat klonen meerdere genetische kopieën, die elk een andere lokalisatie peptide. Elk exemplaar moet worden ingevoerd door de opeenvolgende retransformation, of als alternatief, door terugkruisen enkele transformaties 1. Dit houdt extra klonen, en wordt beperkt door een lokalisatie tag per eindpunt.
Een andere manier om een proteïne te....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Ontwerp van alternatief-gesplitst Sequences voor Multiple Organel Targeting
- Bepaal de locaties voor uiteindelijke eiwitexpressie. Voor dit werk, de rente is de gerichtheid op de chloroplasten, peroxisomen, en cytosol.
- Gebruik de literatuur om eiwitten en DNA-sequenties bekend om proteïnen te richten op organellen van belang vast te stellen. In dit geval een chloroplast-gerichte sequentie van Arabidopsis thaliana L-isoaspartate methyltransferase 6,15 en een peroxisoom targeting sequentie van Arabidopsis thaliana transthyretine-als S-allantoïne synthase 16,17 bepaald.
- Identificee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het ontwerp inspanning was een gevolg van aanzienlijke planning. Novel dit project is het gebruik van alternatieve splicing van een pre-mRNA dat vertaald in differentieel tot expressie gebrachte eiwitten te creëren. Deze eiwitten worden uitgedrukt in verschillende organellen, in dit geval de chloroplast, peroxisoom en / of cytosol. Wij aangepast natuurlijke Arabidopsis gen dat alternatieve wijze wordt gesplitst 6 en geplaatste bekende chloroplast 6 en peroxisoom 17 targeting seq.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie worden eenvoudige strategieën beschreven voor het lokaliseren van een transgeen eiwit meerdere cellulaire compartimenten in planten. Het doel was construct dat een gen tot expressie zou meer dan een organel in Nicotiana benthamiana ontwerpen. Strategieën omvatten rationeel ontwerp van GFP-gebaseerde DNA-constructen, Gibson montage, levering van de plasmiden te bladcellen met de Gene Gun, en observatie van de resultaten met confocale microscopie.
Drie verschillende kor.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag Jen Sheen van het Massachusetts General Hospital bedanken voor de gulle donatie van Nicotiana benthamiana zaailingen. Jen Bush hielp ons sterk in advies op het kweken van planten en het opzetten van een kweekkamer gebied. Tom Ferrante van de Wyss Institute aangeboden cruciale hulp bij confocale microscopie. De auteurs willen het vooral leuk om Don Ingber van Children's Hospital Boston en de Wyss Instituut voor de gulle donatie van een Gene Gun en bijbehorende supplies bedanken. De financiering voor dit project werd verstrekt door middel van een samenwerkingsovereenkomst met het ministerie van Energie Advanced Research Projects Age....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically voor construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotiden |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Gebruikt om PCR-producten te zuiveren |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Gebruikt om kloning-geschikte hoeveelheden plasmide voor te bereiden |
| Phusion Master Mix met GC Buffer | NEB | M0532S | Gebruikt om het gen van belang te PCR-amplificeren |
| Gibson assembly reactiemix | NEB | E2611L | Mastermix van de volgende 9 ingrediënten |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website om berekeningen te vereenvoudigen | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Gebruikt om DNA voor gene gun kogels voor te bereiden |
| Gene Gun systeem | BioRad | 165-2451 | Bevat alle noodzakelijke onderdelen |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift van Jen Sheen, MGH |
| Confocale microscoop | Leica | SP5 X MP | Beeldvorming van resulterende cellen |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Gebruikt voor confocale beeldvorming |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
Referenties
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
