Hier beschrijven we het proces van gehele immunologische kleuring van Drosophila-antennes, waardoor we de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de diversificatie van olfactorische receptorneuronen (ORN's) beter kunnen begrijpen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hele Mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Odorant moleculen binden aan hun doel receptoren in een precieze en gecoördineerde manier. Elke receptor herkent een specifiek signaal en stuurt deze informatie naar de hersenen. Als zodanig bepaalt hoe olfactorische informatie wordt naar de hersenen, modificeren zowel perceptie en gedrag verdient onderzoek. Interessant ook wordt steeds duidelijker dat cellulaire transductie en transcriptiefactoren betrokken bij de diversificatie van reukreceptor neuron. Hier bieden wij een robuust geheel monteren immunologische etikettering methode om in vivo reukreceptor neuron organisatie assay. Met deze methode identificeerden we allemaal reukreceptor neuronen met anti-Elav antilichaam, een bekende pan-neurale marker en Or49a-mCD8 :: GFP een reukreceptor neuron specifiek uitgedrukt in NBA neuron met anti-GFP antilichaam.
Inleiding
Het olfactorische systeem wordt onderscheid gemaakt tussen een enorme verscheidenheid van geurmoleculen en vervolgens de verkregen informatie naar de hogere hersencentra. Deze ingang wordt gebruikt om fundamentele dierlijke gedrag, zoals voeding en paring 1-6 nauwkeurig te regelen. Zoals elk olfactorische soort neuron is gekoppeld aan een specifieke set van geuren, de diversificatie van de olfactorische receptor neuronen (ORN) s is essentieel voor een goede olfactorische systeem functioneren 7.
Drosophila genetica stelt ons in staat om enkele cel niveau onderzoek bij moleculaire mechanismen geassocieerd met ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereid appel plaat
- Meng 12,5 g agar, 125 ml 100% in de handel verkrijgbaar appelsap, 12,5 g glucose, en 375 ml H 2 O. Magnetron het mengsel gedurende 1 tot 2 minuten en giet de 3 cm celkweekschaal. Bewaren bij 4 ° C.
2. Genetische kruis
- Gebruik de volgende representatieve genetische kruis:
Or49a-mCD8 :: GFP / cyo x w 1118
3. Dissection en kleuringsprotocol
- Verdoven van de vlieg en snijd de vlieg hoofd verticaal door vast te houden met behulp van een pincet.
- Plaats de antennes bevattende gedeelt....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Ervoor zorgen dat zowel de dissectie en fixatie snel worden uitgevoerd is een belangrijke factor in het bereiken van succes met dit protocol. Met behulp van fijne schaar en pincet is ook van cruciaal belang. Na immunokleuring werden fluorescent gelabeld antennes onderzocht onder een confocale microscoop. We normaal gesproken 1 uM secties met behulp van een 20x lens. We gelabeld NBA 7 ORNs behulp Or49a-mCD8 :: GFP en telde het aantal NBA ORNs in wild-type antenne. De mCD8-GFP reporter wordt celmembraan gelokal.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ontleding van de Drosophila antenne beschrijven we is eenvoudig en in een laboratorium omgeving. Om een succesvolle dissectie te garanderen, is het essentieel om fijne kanten schaar gebruiken. Terwijl de immunokleuring ontleed antenne, is het belangrijk te incuberen in een vocht gevulde container verdamping van de antilichaamoplossing voorkomen. De ontleed antenne heeft de neiging te zweven in de oplossing. Met 0,1% Triton in PBS gedurende de fixatie verhinderde stappen zullen verzinken van de antenne verg.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door MEXT gesteund programma voor de Strategic Research Foundation bij Private universiteiten en JSPS Young Scientist B subsidie voor HT Wij willen Ohtake Norihito bedanken om de videoclips te bewerken.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Stemi DV4 dissectiemicroscoop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Kweekschotel met glazen bodem | MatTek Corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissectie schaar | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Verdunning 1:200 |
| Muis anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Verdunning 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Verdunning 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Verdunning 1:200 |
Referenties
- Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
