Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Aanpassing van semiautomated doorgeven Tumor Cell (CTC) Testen voor Klinisch en preklinisch onderzoek naar toepassingen

15.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51248

⸱

28 februari 2014

 ,  ,  , 
1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine and Dentistry, Western University, 3Special Hematology/Flow Cytometry, London Health Sciences Centre, 4Lawson Health Research Institute, 5Department of Oncology, Western University

In dit artikel

Samenvatting

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn prognostische in verschillende uitgezaaide tumoren. Dit manuscript beschrijft de gouden standaard CellSearch systeem (CSS) CTC opsomming platform en hoogtepunten gemeenschappelijke misclassificatie fouten. Daarnaast worden twee aangepast protocollen beschreven gebruiker gedefinieerde marker karakterisering van CTCs en CTC opsomming in preklinische muismodellen van metastase met deze technologie.

Samenvatting

De meerderheid van kanker-gerelateerde sterfgevallen na de ontwikkeling van gemetastaseerde ziekte. Deze zeer letale ziektestadium wordt geassocieerd met de aanwezigheid van circulerende tumorcellen (CTCs). Deze zeldzame cellen aangetoond van klinisch belang metastatische borst-, prostaat-en colorectale kankers. De huidige gouden standaard in klinische CTC opsporen en kwantificeren is de FDA goedgekeurd CellSearch systeem (CSS). Dit handschrift worden de standaard protocol gebruikt door dit platform en twee aanvullende protocollen aangepast dat de gedetailleerde proces door de gebruiker gedefinieerde marker optimalisatie voor eiwit karakterisering van CTCs patiënt en een vergelijkbaar protocol voor CTC registratie in zeer lage hoeveelheden bloed te beschrijven, middels standaard CSS reagentia, voor het bestuderen van in vivo preklinische muismodellen van metastase. Daarnaast verschillen in CTC kwaliteit tussen gezonde donor bloed waaraan cellen uit weefselkweek versus patiënt bloed samples worden gemarkeerd. Tot slot, diverse veelgebruikte discrepant items die kunnen leiden tot CTC misclassificatie fouten worden geschetst. Tezamen zullen deze protocollen een nuttige bron voor gebruikers van dit platform geïnteresseerd in preklinisch en klinisch onderzoek met betrekking tot metastase en CTC.

Inleiding

In 2013 wordt geschat dat 580.350 mensen sterven aan kanker en 1.660.290 nieuwe gevallen van deze ziekte in de Verenigde Staten alleen 1 worden gediagnosticeerd. De meerderheid van deze sterfgevallen na ontwikkeling van metastatische ziekte 2. Het huidige gebrek aan effectieve therapieën bij de behandeling van metastasen en een beperkt begrip van de metastatische cascade maakt dit stadium van de ziekte zeer dodelijk. De aanwezigheid van circulerende tumorcellen (CTCs) in de bloedbaan is aangetoond dat correleert met metastasen 3. Deze cellen zijn uiterst zeldzaam en hun detectie is een indicatie van de totale overleving bij uitgezaaide borst-4-, prostaat-5, 6 en colorectale kanker. Bij deze patiënten de aanwezigheid van ≥ 5 (borst en prostaat) of ≥ 3 (colorectaal) CTCs in 7,5 ml bloed wijst op slechtere prognose in vergelijking met patiënten met minder of geen detecteerbare CTCs bij de same bloedvolume. Bovendien is de verandering in CTC aantal tijdens of na therapeutische interventie aangetoond bruikbaar als een voorspeller van behandelrespons vaak sneller dan momenteel toegepast technieken 7-10 zijn.

Er wordt geschat dat in metastatische kanker, CTCs optreden met een frequentie van ongeveer 1 per CTC 10 7 5 -10 mononucleaire cellen bij patiënten met gelokaliseerde ziekte, kan deze frequentie nog lager (~ 1 10 8). Het zeldzame aard van deze cellen kan het moeilijk om nauwkeurig en betrouwbaar detecteren en analyseren CTCs 11. Verschillende methoden (voorheen 12-14 beoordeeld) zijn gebruikt om te verrijken en op te sporen deze cellen door te profiteren van eigenschappen die hen onderscheiden van omliggende bloedcomponenten. In het algemeen CTC opsomming is een tweeledig proces dat zowel een verrijkingsstap en een detectiestap vereist. Traditioneel verrijking stappen rekenen op verschillen in Physische eigenschappen van CTC (celgrootte, dichtheid, vervormbaarheid) of op eiwitmerker expressie (dwz epitheliale celadhesiemolecuul [EpCAM], cytokeratin [CK]). Na verrijking kan CTC detectie worden uitgevoerd in een aantal verschillende manieren, de meest voorkomende daarvan zijn nucleïnezuur gebaseerde assays en / of cytometrische benaderingen. Elk van deze strategieën unieke heeft duidelijke voordelen en nadelen, maar ze allemaal niet gestandaardiseerd, een noodzaak voor ingang in de klinische setting. De CellSearch systeem (CSS) werd daarom ontwikkeld om een gestandaardiseerde methode voor de detectie en telling van zeldzame CTCs in menselijk bloed met behulp van fluorescentie microscopie en antilichaam-gebaseerde technieken 4-6 bieden. Dit platform wordt momenteel beschouwd als de gouden standaard in CTC opsomming en is de enige techniek die door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurd voor gebruik in de kliniek 15.

De CSS is een twee componenten platform consisting, (1) het CellTracks autoprep systeem (hierna het preparaat instrument), die de bereiding van menselijke bloedmonsters en (2) het CellTracks Analyzer II (hierna het analyseapparaat), waarin deze scant automatiseert monsters na de bereiding. Om CTC onderscheiden van besmetting van leukocyten de voorbereiding instrument bevat een antilichaam-gemedieerde,-ferrovloeistof gebaseerde magnetische scheiding aanpak en differentiële fluorescentie kleuring. In eerste instantie het systeem etiketten CTC's met behulp van anti-EpCAM antilichamen geconjugeerd aan ijzeren nanodeeltjes. Het monster wordt vervolgens geïncubeerd in een magnetisch veld, en al ongelabelde cellen opgezogen. Geselecteerde tumorcellen geresuspendeerd en geïncubeerd in een differentiële fluorescentie vlek, bestaande uit fluorescent gemerkte antilichamen en een nucleaire kleuring reagens. Tenslotte wordt het monster overgebracht naar een magnetisch patroon, zogenaamde magnest (hierna de magnetische apparaat) en scanned behulp van het analyse-instrument.

Het analyseapparaat wordt gebruikt om uitgewerkte voorbeelden scannen met verschillende fluorescentie filters, elk geoptimaliseerd om de passende fluorescerende deeltjes, met een 10X objectief. CTCs worden geïdentificeerd als cellen die gebonden zijn aan anti-EpCAM, anti-pan-CK-phycoerythrine (PE) (CK8, 18 en 19), en de nucleaire vlek 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). Omgekeerd besmetten leukocyten geïdentificeerd als cellen die zijn gebonden door anti-CD45-allofycocyanine (APC) en DAPI. Na scanning worden computers gedefinieerd potentiële tumorcellen gepresenteerd aan de gebruiker. Van deze beelden, moet de gebruiker een kwalitatieve analyse in dienst met behulp van de gedefinieerde parameters en differentiële kleuring hierboven besproken om te bepalen welke gebeurtenissen zijn CTC.

Naast het verschaffen van een gestandaardiseerde werkwijze voor CTC opsomming, de CSS zorgt voor moleculaire karakterisering van CTCs basis van eiwit markers plaats. Deze ondervraging cEen worden uitgevoerd in eencellige niveau met een fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) fluorescentiekanaal niet vereist CTC identificatie 16. Hoewel dit platform biedt de capaciteit voor de moleculaire karakterisatie, het gedetailleerde proces van het protocol ontwikkeling en optimalisatie is niet goed gedefinieerd. Drie beschikbare merkers zijn ontwikkeld door de fabrikant om de CSS, zoals epidermale groeifactor receptor (EGFR), humane epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) en insuline-like growth factor 1 receptor (IGF-1R). HER2 analyse, in combinatie met de CSS, is gebruikt door verschillende groepen aan de mogelijke CTC karakterisering illustreren klinische besluitvorming kennis en bestaande richtlijnen behandeling mogelijk veranderen. Bijvoorbeeld Fehm et al.. 17 aangetoond dat ongeveer eenderde van borstkankerpatiënten met HER2-primaire tumors HER2 CTCs. Bovendien, Liu et al..18 meldde onlangs dat tot 50% van de patiënten met HER + gemetastaseerde borstkanker had geen HER2 + CTC. Herceptin, een HER2 receptor storende monoklonaal antilichaam aangetoond veel baat hebben patiënten met tumoren uiten voldoende niveaus van HER2, is een algemeen gebruikte behandeling voor patiënten met HER2 + primaire tumoren 19-21. Echter, deze studies suggereren dat Herceptin sub-optimaal benut en dat CTC karakterisering kan helpen bij het voorspellen van respons op de behandeling kan zijn. Uiteindelijk kan CTC karakterisering het potentieel om persoonlijke zorg te verbeteren.

CTC onderzoek is uniek omdat het grotendeels is gebruik gemaakt van een bed naar benchtop benadering. Deze methode, in tegenstelling tot tafelmodel to bedside onderzoek, die vaak jaren duren om de patiëntenzorg te beïnvloeden, heeft het mogelijk CTC snel ingang in de klinische setting. Maar artsen zijn huiverig om de resultaten van CTC analyse gebruiken bij de behandeling van patiënten besluitvorming making door een gebrek aan begrip van de onderliggende biologie. Daarom passend preklinische muismodellen van metastase en complementaire CTC analyse technieken moeten worden gebruikt om deze openstaande vraagstukken te onderzoeken. In het algemeen zijn er twee typen preklinische modellen gebruikt om de metastatische cascade te bestuderen (1) spontane metastase modellen die kunnen worden bestudeerd van alle stappen van de metastatische cascade, en (2) experimentele metastase modellen, die alleen mogelijk maken de studie van de latere stappen in het metastatische proces, zoals extravasatie en secundaire tumorvorming 22. Spontane metastase modellen omvatten tumorcel injectie in geschikte orthotope bestemmingen (bijvoorbeeld injectie van prostaatkankercellen in de prostaat voor de studie van prostaatkanker). Cellen worden vervolgens de tijd om primaire tumoren en vormen spontaan uitzaaien naar secundaire plaatsen zoals bot, long en lymfeknopen. InDaarentegen experimentele metastase modellen een rechtstreekse injectie van tumorcellen in de bloedsomloop (bijv. via staartader of intracardiale injectie doelcellen op specifieke locaties) en derhalve de eerste stappen van intravasation en verspreiding doorgaan naar secundaire organen 22. Tot zover de meerderheid van de CTC analyse in vivo modelsystemen is uitgevoerd met behulp van-cytometrie basis 23 of aangepast mens gerichte CTC technieken (bijv. AdnaTest) 24. Hoewel nuttig, geen van deze technieken voldoende weergeven CTC opsomming met de gouden standaard CSS. Gebaseerd op de klinische goedkeuring gestandaardiseerde aard en wijdverspreide gebruik van de CSS, zou de ontwikkeling van een CTC vangen en detectietechniek voor in vivo modellen die gelijkwaardig monster bereiding, verwerking gebruikt en identificatie criteria voordelig zijn als uitslagen vergelijkbaar zijn zou verkregen van patiënten monsters. Vanwege het volume requirements van het preparaat instrument is het niet mogelijk om kleine hoeveelheden bloed met deze automatische platform verwerken. . Daarnaast heeft eerder werk van Eliane et al. 25 aangetoond dat contaminatie van monsters met muizen epitheelcellen (die overigens aan de standaard CTC definitie [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) kan leiden tot misclassificatie van muizen squameuze epitheelcellen CTC. Om deze problemen een aangepaste techniek die het gebruik van de CSS CTC kitreagentia gecombineerd met een handmatige scheiding procedure ontwikkeld. De toevoeging van een FITC gemerkte menselijke leukocyt antigeen (HLA) antilichamen tegen de assay kan humane tumorcellen te onderscheiden van muizen geschubde epitheelcellen.

Dit manuscript beschrijft de standaard, in de handel ontwikkeld en geoptimaliseerd CSS protocol voor de behandeling van patiënten bloedmonsters en valkuilen die kunnen worden aangetroffen, waaronder discrepant items die kunnen leiden tot CTC misclassificatie fouten. Daarnaast is aanpassing van het CSS test om de gebruiker gedefinieerde eiwitkenmerken van gevangen CTC en een vergelijkbare aangepaste CSS techniek die het mogelijk maakt voor de verrijking en detectie van CTC's van kleine hoeveelheden bloed in preklinische muismodellen van metastase onderzoeken worden beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle menselijke studies in dit manuscript beschreven werden onder protocollen door Western University Human Research Ethics Board goedgekeurd uitgevoerd. Alle dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Canadese Raad over Animal Care, onder protocollen door de Western University dierproeven subcomite goedgekeurd.

1. Standaard CTC opsomming van patiënt Bloed monsters met behulp van de CSS

1. Menselijk bloed Monstername en voorbereiding voor verwerking op de voorbereiding Instrument

  1. Met behulp van standaard aseptische technieken flebotomie opneming minste 8,0 ml humaan bloed in een 10 ml buis CellSave (hierna de CTC conserveermiddel buis), die ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en een eigen cellulaire conserveermiddel bevat. Keren de buis 5x om de bloedstolling tegengaan. Monsters kunnen direct worden verwerkt of bewaard bij kamertemperatuur gedurende maximaal 96 uur.
  2. Remove CSS reagentia uit de koelkast en laat ze op kamertemperatuur komen alvorens het te gebruiken.
  3. Met behulp van een disposable 10 ml pipet en geautomatiseerde pipet, het verzamelen van 7,5 ml bloed uit de CTC conserveringsmiddel buis en langzaam afzien bloed in van een geschikt gemerkte voorbereiding instrument verwerking buis.
  4. Voeg 6,5 ml verdunning buffer aan elk monster. Meng door de steekproef 5x. Centrifugeer steekproef bij 800 xg gedurende 10 minuten met de rem in de stand "off". Volg de instructies op het scherm op de voorbereiding instrument om alle patiënten monsters laden op het systeem voor de verwerking. Monsters moeten worden verwerkt binnen 1 uur na bereiding.

2. Controle Voorbereiding voor verwerking op de voorbereiding Instrument

  1. Voorzichtig vortex de controle flesje en keer 5x te mengen.
  2. Verwijder voorzichtig de dop van de controle flesje en leg een omgekeerde voorbereiding instrument verwerking buis bovenop de afgetopte flacon. In een snelle beweging, keren decontrole flesje en giet de inhoud in de verwerking buis. Tijdens omgekeerde voorzichtig flick de zijkanten van de controle injectieflacon resterende inhoud vrijgeven.
  3. Verwijder voorzichtig de omgekeerde controle flesje uit de verwerking wordt voorkomen, zodat geen vloeistof verloren gaat en leg opzij. Met behulp van een 1000 ui pipet, verzamel alle resterende inhoud van het flesje en het deksel en voorzichtig pipet in de verwerking buis.
  4. Volg de instructies op het scherm op de voorbereiding instrument om de controle te laden op het systeem voor de verwerking.

3. Monster Scannen op het analyseapparaat

  1. Volg de instructies op het scherm op de voorbereiding instrument om alle monsters te lossen uit het systeem. Losjes cap elk magnetisch apparaat cartridge en tik op de magnetische apparaat met behulp van handen of lab bank om eventuele luchtbellen die vastzitten aan de randen van de cartridge te ontgrendelen. Zodra alle bubbels zijn verwijderd, stevig dop op de cartridge, lag het magnetisch apparaat vlak, en ikncubate in het donker gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Monsters moeten worden gescand binnen 24 uur na bereiding.
  2. Zet de analyse-instrument en initialiseren van de lamp. Eenmaal opgewarmd (~ 15 min), laadt u de controle van het systeem cartridge op de analyse-instrument en selecteer het tabblad QC Test. Volg de instructies op het scherm om de nodige kwaliteitscontrole maatregelen uit te voeren.
  3. Plaats een monster op het analyse-instrument en selecteer het tabblad Patiënttest. Alle opgeslagen gegevens van de voorbereiding instrument worden weergegeven. Klik op Start om sample scannen initialiseren. Het systeem zal een grove focus en randdetectie voeren op het magnetisch apparaat cartridge.
  4. Pas alle randen indien nodig met de richtingstoetsen. Selecteert u Accept. Het systeem zal een fijne scherpstelling uitvoeren en beginnen sample scannen.
  5. Na controle scannen van de resultaten moeten worden gevalideerd met behulp van de gedefinieerde criteria voor cellen spiked bij hoge (CK + DAPI + CD45 - APC +) en lage (CK + DAPI + CD45 - FITC +) concentraties. Volgende patiënt monster scannen van de resultaten moeten worden beoordeeld voor vastgelegde CTC met gebruikmaking van de CTC criteria (CK + DAPI + CD45 -).

2. CTC Karakterisering voor de gebruiker gedefinieerde Markers met behulp van de CSS

1. Voorbereiding van de gebruiker gedefinieerde Markers en Instrument initialisatie

  1. Verdun het antilichaam van belang met Bond Primary Antibody Diluent de gewenste concentratie in een marker reagens beker met behulp van de volgende formule, waarin de werkende concentratie de concentratie van het antilichaam na toevoeging aan het monster en de voorraad concentratie de concentratie van antilichaam in de reagens beker. Voor meerdere monsters, past het antilichaam volumes zoals beschreven in Tabel 1. Zet de aanwijzer reagens beker in positie 1 in het reagens cartridge en load de cartridge op CSS.
    Stock Concentratie = (Werken Concentratie x 850 pi) / 150 pl
  2. Verzamel bloed, monsters te bereiden, en laad de voorbereiding instrument zoals beschreven in het bovenstaande Standard CTC opsomming van patiënt bloedmonsters met behulp van de CSS-protocol. Om aangepaste markering Daarnaast inschakelen, selecteert u User Defined Test als daarom wordt gevraagd door de voorbereiding instrument. Voer de naam marker en selecteer Opslaan. Als monsters op het toestel zijn geladen, zal de operator gevraagd om aan te geven welke aangepaste markering moeten krijgen door zo nodig het selecteren van Ja of Nee.

2. Voorbeeld Het scannen van de gebruiker gedefinieerde Markers op de analyse-instrument

  1. Zet de analyse-instrument, initialiseren van de lamp, en het uitvoeren van kwaliteitscontrole en controle van het systeem zoals beschreven in paragraaf 3.2 van de standaard CTC opsomming van patiënt bloedmonsters met behulp van de CSS protocol.
  2. Plaats een monster op het analyse-instrument en selecteer het tabblad Setup. Om de FITC kanaal initialiseren, selecteert CellSearch CTC als de Kit-ID in de sectie Test protocollen. Vanuit dit menu, selecteer CTC onderzoek, klikt u op de knop Bewerken en stel de belichtingstijd naar wens. Het wordt aanbevolen dat een belichtingstijd van 1,0 sec niet worden overschreden bij gebruik van de CSS CTC kit zoals deze door-bloeding in andere fluorescerende kanalen gebruikt voor CTC identificatie kan verhogen.

3. Aanpassing van de norm CSSProtocol voor gebruik in preklinisch muismodellen

** Aangepast van Veridex Mouse / Rat CellCapture Kit (niet meer in de handel verkrijgbaar)

1. Muis Bloedafname en-opslag

  1. Vóór bloedafname, lopen ~ 30 gl 0,5 M EDTA heen en weer door een 22 G naald, waardoor een kleine hoeveelheid EDTA in de naaf.
  2. Verzamel minimaal 50 ui muizen bloed van muizen die vooraf geïnjecteerd met humane tumorcellen via orthotope, staartader of intracardiale routes. Verzamelen bloed uit de vena ader (voor seriële CTC analyse) of door hartpunctie (voor terminal CTC analyse). Verwijder de naald en afzien van bloed in een 1 ml EDTA microtainer bloedafnamebuis. Meng door inversie of het zachtjes buisje tikken om de bloedstolling tegengaan. Bloed kan direct worden verwerkt of bewaard bij kamertemperatuur tot 48 uur na toevoeging van een gelijk volume CytoChex cellulaire conserveermiddel.

2. CTC Verrijking

  1. Verwijder CSS reagentia uit de koelkast en laat ze op kamertemperatuur komen alvorens het te gebruiken.
  2. Breng het equivalent van 50 pl vol bloed op een 12 mm x 75 mm flowcytometrie buis. Voeg 500 pl verdunningsbuffer aan elk monster, wassen neer geen bloed dat aan de zijkanten van de buis blijft. Indien nodig, een korte centrifuge centrifugerenkunnen worden gebruikt om de resterende verzamelen van bloed.
  3. Voorzichtig geschud anti-EpCAM ferrovloeistof en voeg 25 ul aan elk monster door de punt van de pipet direct in het monster. Voeg 25 ul van Capture Enhancement reagens en vortex voorzichtig te mengen. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  4. Plaats monster buizen in de magneet en incubeer gedurende 10 minuten. Terwijl de monsterbuizen nog in de magneet gebruikt een glazen pipet om de resterende vloeistof voorzichtig zuigen zonder het wand van de buis naast de magneet en gooi.

3. CTC kleuring

  1. Verwijder de monsterbuizen van de magneet en resuspendeer in 50 pl nucleïnezuur Dye, 50 pi van de kleurstof 1,5 gl anti-muis CD45-APC, 5,0 pl anti-humaan HLA-Alexa Fluor 488 en 100 ul permeabilisatie Reagens. Voor meerdere monsters kunnen deze reagentia worden voorgemengd en 206,5 ul van het mengsel kan worden toegevoegd aan elke buis. Vortex voorzichtig te mengenen incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  2. Voeg 500 pl verdunningsbuffer, wervel voorzichtig plaats voorbeeld buizen in de magneet en incubeer gedurende 10 minuten. Terwijl de monsterbuizen nog in de magneet gebruikt een glazen pipet om de resterende vloeistof voorzichtig zuigen zonder het wand van de buis naast de magneet en gooi. Verwijder het monster buizen uit de magneet en resuspendeer in 350 pl verdunningsbuffer. Vortex voorzichtig te mengen.

4. Magnetisch wordt geladen

  1. Met behulp van een gel laad-tip, zorgvuldig het gehele volume van het monster buis over in een cartridge in het magnetisch apparaat. Begin aan de onderkant van de cartridge en langzaam trekt de tip als het monster wordt afgegeven.
  2. Nadat het gehele monster is overgedragen, losjes cap het magnetisch apparaat cartridge en tik op de magnetische apparaat met behulp van handen of lab bank om eventuele luchtbellen die vastzitten aan de randen van het patroon zoals beschreven in Afdeling vrijgevenn 3.1 van de standaard CTC opsomming van patiënt bloedmonsters met behulp van de CSS.
  3. Pop eventuele luchtbellen met behulp van een steriele 22 G naald door ze te vangen tussen de schuine en de rand van de cartridge. Zodra alle bubbels zijn verwijderd, stevig dop op de cartridge, lag het magnetisch apparaat vlak, en incubeer in het donker gedurende minstens 10 minuten. Monsters moeten worden gescand binnen 24 uur na bereiding.

5. Het scannen van handmatig Gescheiden monsters op het analyseapparaat

  1. Zet de analyse-instrument, initialiseren van de lamp, en het uitvoeren van kwaliteitscontrole en controle van het systeem zoals beschreven in paragraaf 3.2 van de standaard CTC opsomming van patiënt bloedmonsters met behulp van de CSS-protocol.
  2. Plaats het monster op het analyse-instrument en selecteer het tabblad Setup. Wis alle bestaande gegevens op de magnetische apparaatgegevens knoop door te klikken op de knop Format Sample. Schakel de FITC kanaal eennd stel de belichtingstijd tot 1,0 sec, zoals beschreven in paragraaf 2.2 van de CTC Karakterisering voor de gebruiker gedefinieerde Markers met behulp van de CSS.
  3. Klik op het tabblad Patiënt Test en kies Bewerken om de ingang van de steekproef informatie. Selecteer CellSearch CTC als de Kit-ID en CTC onderzoek als het testprotocol. Voer de overige noodzakelijke informatie zoals aangegeven als het sterretje. Sla de steekproef informatie en klik op Start.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Standaard CTC opsomming Assay

De gevoeligheid en specificiteit van de CSS is goed gedocumenteerd in de literatuur. Echter, om gelijkwaardige CTC herstel valideren, spiked (1000 LNCaP menselijke prostaatkankercellen) en verrijkte menselijke bloedmonsters van gezonde vrijwillige donoren werden verwerkt op de CSS met behulp van de standaard CSSCTC protocol. Zoals verwacht, verrijkte monsters waren vrij van CTC, 0,00 ± 0,00%, en CTC herstel werd aangetoond 86,9 ± 4,71% te zijn voor verrijkte monste...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ondanks de ontwikkeling van vele nieuwe CTC technologieën sinds de invoering van de CSS in 2004, deze techniek is nog steeds de enige klinisch goedgekeurde technologie op de markt van vandaag en daarom wordt beschouwd als de huidige gouden standaard voor CTC opsporen en kwantificeren. Dit manuscript heeft aangetoond dat, hoewel de CSS heeft strenge normen voor de kwaliteitscontrole kan worden onderworpen aan interpretatiebias en dat CTC identificatie in monsters van patiënten is veel verschillend van identificatie in ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur (ALA) ontvangen financiering die werd verstrekt door Janssen Oncology, waarvan de moedermaatschappij Johnson & Johnson is ook eigenaar van Janssen Diagnostics LLC, dat reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Ontario Institute of Cancer Research (# 08NOV230), de Canada Foundation for Innovation (# 13199), prostaatkanker Canada, Janssen Oncologie, de London Regional Program Cancer, en de donor steun van John en Donna Bristol door de London Health Sciences Foundation (ALA). LEL wordt ondersteund door een Frederick Banting en Charles Best Canada Graduate Scholarship Doctoral Award. ALA wordt ondersteund door een CIHR New Investigator Award en een Early Onderzoeker Award van de Ontario ministerie van Onderzoek en Innovatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA
Anti-human CD44-FITCBD Pharmigen555478
Anti-human CD44-PEBD Pharmigen555479
Anti-human HLA-Alexa Fluor 488BioLegend311415
Anti-mouse CD45-APCeBioscience17-0451-82
Bond Primary Antibody DiluentLeicaAR9352
CellSave Preservative TubesVeridex952820 (20 pack) 79100005 (100 pack)
CellSearch CTC Control KitVeridex7900003
CellSearch CTC KitVeridex7900001
CellSearch CXC Control KitVeridex7900018RUO
CellSearch CXC KitVeridex7900017RUO
Instrument BufferVeridex7901003
Streck Cell Preservative (aka CytoChex)Streck213350
1 ml Syringe
10 ml Serologische pipet
1,000 µl Pipette
1,000 µl Pipette tips
12 mm x 75 mm Flow tubes
200 µl Gel loading tips
200 µl Pipette
22 G Needle
5 3/4 in Disposible Pasteur pipetVWR14672-200
5 ml Serologische pipet
Automated pipettor
Capillary Blood Collection Tube (EDTA)BD Microtainer365974
CellSearch Analyzer IIVeridex9555Bevat magneten en verificatie cartridges
CellSearch AutoPrep SystemVeridex9541
Centrifuge
MagCellect Magnet R&D SystemsMAG997
Small Latex BulbVWR82024-550
Vortex

Referenties

  1. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. 63 (1), 11-30 (2013).
  2. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  3. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  4. Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
  5. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  6. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
  7. Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
  8. Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
  9. Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
  10. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  11. Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
  12. Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
  13. Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
  14. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
  15. Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
  16. Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
  17. Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
  18. Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
  19. Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
  20. Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
  21. Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
  22. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
  23. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
  24. Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
  25. Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
  26. White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
  27. Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
  28. Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
  29. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
  30. Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
  31. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
  32. Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
  33. Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
  34. Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
  35. Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
  36. Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
  37. Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
  38. Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Circulerende tumorcellenCell Search systeemCTC verrijkingCTC karakteriseringdoor gebruiker gedefinieerde markersmuisxenograftmodellenEpCAM positieve selectiedifferenti le kleuringflowcytometriebuismagnetische apparaatcartridge
Aanpassing van semiautomated doorgeven Tumor Cell (CTC) Testen voor Klinisch en preklinisch onderzoek naar toepassingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.