De Ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom Microspotter

Samenvatting

Deze 3D microfluïdische printtechnologie drukt arrays van cellen op ondergedompelde oppervlakken af. We beschrijven hoe arrays van cellen microfluïdisch in 3D-stroomcellen op ondergedompelde oppervlakken worden afgeleverd. Door op ondergedompelde oppervlakken te printen, werden celmicroarrays geproduceerd die geneesmiddelscreening en cytotoxiciteitsbeoordeling mogelijk maken op een veelvoud van gebieden.

Samenvatting

Het afdrukken van cellen voor microarray-toepassingen brengt aanzienlijke uitdagingen met zich mee, waaronder het probleem van het behouden van een fysiologisch relevante celfenotype na het afdrukken, slechte organisatie en verspreiding van gewenste cellen, en de onmogelijkheid om medicijnen en/of voedingsstoffen af te leveren op doelgerichte gebieden in de array. Onze 3D-microfluïdische afdruktechnologie is uniek in staat om arrays van cellen op een geautomatiseerde en multiplexe manier op ondergedompelde oppervlakken af te drukken en te verzegelen. Het ontwerp van de microfluïdische celarray (MFCA) 3D-fluidics maakt het mogelijk om de printkoppunt in een met vloeistof gevulde kuip of schaal te laten zakken en tegen een oppervlak te drukken om een afdichting te vormen. De zachte siliconen punt van de printkop gedraagt zich als een pakking en kan een omkeerbare afdichting vormen door druk uit te oefenen of terug te trekken. Andere celprinttechnologieën, zoals pen- of inkjetprinters, zijn niet in staat om in ondergedompelde toepassingen af te drukken. Ondergedompeld oppervlakteafdrukken is essentieel om fenotypen van cellen te behouden en deze cellen op een oppervlak te monitoren zonder de materiaaloppervlaktekenmerken te verstoren. Door op ondergedompelde oppervlakken af te drukken, worden celmicroarrays geproduceerd die geneesmiddelenscreening en cytotoxiciteitsbeoordeling mogelijk maken op een veelvoud van gebieden, waaronder kanker, diabetes, ontsteking, infecties en hart- en vaatziekten.

Inleiding

Recente ontwikkelingen in de farmaceutische industrie hebben geleid tot een toegenomen belangstelling voor het gebruik van cellulaire microarrays in de drug discovery proces voor drug discovery en cytotoxicological analyse ^1,2,3. De ontwikkeling van in vitro high-throughput testen en screening methoden met behulp van microarrays cel zou de snelle en kosteneffectieve ontwikkeling van kandidaat-geneesmiddelen, alsook van tevoren het fundamenteel begrip van de cel ^1,4 vergemakkelijken. De traditionele benadering van screening met cellen maakt gebruik van conventionele goed plaat platforms; maar deze benadering is beperkt vanwege de hoge kosten, beperkte verwerkingscapaciteit en beperkt vermogen om kwantitatieve informatie over celfunctie ^1,5. Vanwege deze beperkingen, is het onderzoek in cellulaire microarray technologie ontluikende voor moleculair biologische karakterisering, tissue engineering, en drug screening ^1,6. De voordelen van cellulaire microarrays omvatten kleinere steekproef gebruik, minimale effecten vancellulaire fenotype heterogeniteit maskeren informatie, en vooral de mogelijkheid om te testen automatiseren voor meer high-throughput toepassingen ^1,7,8.

De farmaceutische industrie maakt gebruik momenteel high-throughput-cel-gebaseerde Screeningtesten met 2D cel monolaagculturen voor drug discovery in microtiterputje platen ^9. Multiplexing cellen in putjes van microtiterplaten biedt het potentieel voor hogere doorvoer met unieke experimenten opties. Verder zijn de huidige technologieën voor cellulaire microarrays laat de cellen drogen die drastisch kunnen wijzigen fenotype van de cellen van in vivo ^10,11. Om deze problemen te overwinnen, werd de MFCA ontworpen en wordt getoond in Figuur 1. Het ontwerp van de MFCA 3D fluïdica kan de printkop punt in figuur 1 worden neergelaten in een bad en samengeperst tegen een oppervlak om een afdichting te vormen. De zachte siliconen tip van de printkop zich gedraagt ​​als eenpakking en vormt een omkeerbare afdichting. De MFCA technologie is uniek geschikt om met ondergedompelde oppervlakken, die nodig is voor zowel celculturen en weefselplak systemen en moeilijk of onmogelijk met de meeste andere benaderingen. Pinnen of inkt-jet printen zal niet werken, en 2D microfluïdische apparaten zijn niet geschikt voor afzetting of interfacing met grote arrays van discrete plekken. Verder, door miniaturisering en lokaliseren van het experiment - de cellulaire microarray - de MFCA overwint de belangrijkste problemen geassocieerd met high-throughput cel-gebaseerde screeningtesten.

De CFM maakt gebruik van 3D-kanaal netwerken te fietsen klein volume vloeistof monsters na microscopisch spot locaties op een oppervlak ^12,13. Door druk met stroom worden biomoleculen, cellen en andere reagentia gehandhaafd in een vloeibare omgeving gedurende het printproces, waardoor de drukken van gevoelige biomoleculen en cellen zonder blootstelling aan lucht, waarbij de huidige cel druktechnieken belemmert. Het is ook mogelijk om afdrukken uit ruw materiaal zoals hybridoma supernatanten of mits er een opname mechanisme op de array oppervlak. Het doel van dit manuscript is in detail de ondergedompelde drukken van twee celtypen op een oppervlak.

Protocol

1. Celcultuur Voorbereiding

1. Slaan NIH/3T3 cel voorraden in vloeibare stikstof tot aan gebruik.
2. Bereid complete media voor NIH/3T3-cellen met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 10 mM HEPES buffer, 50 eenheden / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine.
3. Ontdooi cellen gedurende 2-3 minuten in een schuddend waterbad bij 37 ° C.
4. Resuspendeer cellen in 5 ml compleet medium en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 3 minuten.
5. De cel bovenstaande vloeistof zonder de celpellet.
6. Resuspendeer de cellen in 5 ml medium en cellen tellen met een hemocytometer.
   1. Verwijder 10 pi van de celsuspensie en plaats in een 0,5 ml microcentrifugebuis.
   2. Voeg 10 ul van trypan blauw aan de celsuspensie en roer met de punt van de pipet.
   3. Pipetteer 10 ul van de gekleurde cellen in een hemocytometer kamer.
   4. Tellen cellen hemocytometer 10xvergroting.
      1. Tel de levende cellen (kleine, witte ballen) voor 4 van de 9 grote pleinen. Tellen alleen de levende cellen die niet donkerblauw van de trypaanblauw vlek lijken.
      2. Bereken het gemiddelde aantal cellen per vierkante, waardoor het aantal cellen x 10 ⁴ cellen / ml in de oorspronkelijke celsuspensie.
      3. Zaad cellen bij een dichtheid van 1 x 10 ⁵ cellen / ml met een totaal van 5 ml per T25 fles.
   5. Kweekcellen tussen 70% en 80% confluentie voor het begin experimenten. Vernieuwen media om de 2-3 dagen of naar vereist.

2. Printing Voorbereiding van de oppervlakte

1. Markeer een rechthoek met markering op de bodem van een tissue-cultuur behandeld polystyreen (TCTPS) 12 wells plaat van de grootte van de printkop (7 mm x 19 mm).
2. Pipetteer 50 ul foetaal runderserum in de rechthoekige stippellijn verspreiden over het gehele gebied van de punt.
3. Laat de petrischaalin een steriele bioveiligheid kap O / N om het serum plek volledig drogen. Deze platen worden bereid maximaal 2 dagen vóór gebruik.

3. Ondergedompeld Printing

1. Spoel de printkop uit met gedestilleerd water.
   1. Vul een 60 mm petrischaal met gedestilleerd water en dock de printkop op het oppervlak.
   2. Flow gedestilleerd water door elk van de leidingen gedurende 2 min bij 150 gl / min met behulp van een pneumatische pomp.
   3. Gooi het water uit de petrischaal en vul het met schoon water.
   4. Verplaats de printkop op en neer in het water 3 keer.
2. Dock de printkop centrum over de serum-gecoate plek in de pre-bereid 12 well plaat.
3. Prime de printkop met voorverwarmd complete media, 300 ul per kanaal.
4. Print gesuspendeerde cellen bij een concentratie van 50.000 cellen / ml op het oppervlak en 60 pl / min, 100 ul per kanaal.
5. Plaats de printkop, links gedokt tegen deoppervlak en het verdeelstuk in een celkweek incubator ingesteld op 5% _CO2 en 37 ° C gedurende 2 uur.
6. Na de 2 uur incubatie, verwijder de printkop en leg het deksel op de cultuur schotel. Het tijdstip waarop de printkop verwijderd wordt beschouwd als de 0 uur tijdstip.

4. Standaard Cell Culture

1. Voeg 1 ml voorverwarmde media om een ​​van de serum-spotted TCTPS 12-well plaat bereid in stap 2.
2. Neem 1 ml van de resterende celsuspensie uit stap 2 en pipet in een enkel putje van een 12-wells plaat TCTPS. Dit zal een kweek die 50.000 cellen in de schaal te produceren.
3. Plaats de celkweek plaat in een incubator bij 37 ° C gedurende 2 uur.
4. Na de 2 uur incubatie beginnen timing; voor samenhang tussen gedrukte en zaaien monster, die wordt beschouwd als de 0 uur tijdstip.

5. Cultuur Visualisatie

1. Na 0, 2, 24 en 48 uur nemen cellen van elk van de twee methoden described boven en afbeelding met behulp van een standaard omgekeerde microscoop.
   1. Vlekken op de cellen met propidiumjodide, een fluorescerende vlek die alleen wordt opgenomen in de kern van dode cellen.
      1. Voorzichtig Spoel de cellen 3 maal met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (PBS + +) om vuil te verwijderen.
      2. Voeg 1 ml voorverwarmde PBS + + aan elke kweekvat.
      3. Voeg 1 ul propidiumjodide stockoplossing (1 mg / ml) aan elk kweekvat.
      4. Incubeer de cellen gekleurd met propidium jodide bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
   2. Beeld de cellen met behulp van een omgekeerde microscoop bij 10x en 40x vergroting.
2. Gooi de cellen in een geschikte biohazard container.

Resultaten

De fibroblastcellijn NIH/3T3-cellen werden afgedrukt of gezaaid op een verzonken oppervlak. De cellen werden gekweekt tot een dichtheid van 5 x 10 ⁴ cellen per ml. Cellen werden gezaaid met behulp van traditionele celcultuur technieken. Cellen werden afgedrukt met een groot-formaat, twaalf-flow cell printkop waar de kanalen zijn groter (~ 500 micrometer) dan de CFM gebruikt voor eiwitten en andere biomoleculen. De cellen werden afgedrukt of geënt op een oppervlak serum gecoat. Het drukproces wordt getoond in ...

Discussie

De 3D microfluïdische printtechnologie hier beschreven is uniek in staat microfluidically drukken arrays van cellen in een vloeistof goed gevuld, dat wil zeggen een verzonken oppervlak. Door drukken op oppervlakken onder water kunnen microarrays cellen worden geproduceerd die de fysiologisch relevante cellulaire fenotype van cellen en het vermogen om cellen multiplexen in de bodem van een put Figuur 4 behouden. De resultaten van deze studie tonen aan dat microfluidically druktechnieken cellen r...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Continuous flow microspotter	Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cellen	ATCC	CRL-1658
Dubbleco's Gemodificeerd Eagle Medium	Invitrogen	11965-092	Basismedium voor cellen
HEPES buffer	Invitrogen	15630-080	Additief voor celmedium (controle pH)
Natriumpyrovaat	Invitrogen	11360-070	Additief voor celmedium
Penicilline-streptomycine	Invitrogen		Additief voor celmedium
Trypanblauw	Invitrogen	15250-061	Kleuren van cellen voor telling
Hemocytometer	Fisher	267110	Cellenkamer voor het tellen van cellen
Nikon Eclipse TS100	Nikon		Gebruikt om cellen te controleren
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		Gebruikt voor het verzamelen van afbeeldingen
Fosfaat gebufferd zout (met calcium en magnesium)	Invitrogen	14040-133	Cellen spoelen voor het passeren en voor het kleuren met PI
TrypLE Express	Invitrogen	A12177-01	Gebruikt om cellen van het oppervlak te verwijderen