Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als In vitro Model van een beroerte

Samenvatting

We hebben hersenen slice model dat gebruikt kan worden om de moleculaire mechanismen betrokken bij-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken ontwikkeld. Deze techniek genereert levensvatbare volwassen hersenweefsel en vermindert nummers die nodig zijn voor experimenten dier, met behoud van de neuronale circuits, cellulaire interacties, en postsynaptische compartimenten gedeeltelijk intact.

Samenvatting

Onderzoeken moleculaire mechanismen betrokken bij neuropathologische aandoeningen, zoals ischemische beroerte, kan moeilijk zijn wanneer gebruik geheel dierlijke systemen. Als zodanig, primaire of 'neuronale-achtige' celkweek systemen vaak worden gebruikt. Hoewel deze systemen relatief eenvoudig om mee te werken en bruikbaar modelsystemen waarin verschillende functionele resultaten (bijvoorbeeld celdood) gemakkelijk kan worden gekwantificeerd, de onderzochte resultaten en routes in gekweekte onrijpe neuronen (bijvoorbeeld excitotoxiciteit-gemedieerde celdood routes) zijn niet noodzakelijkerwijs dezelfde als die waargenomen in volwassen hersenen, of in intact weefsel. Daarom is er de behoefte om modellen waarin cellulaire mechanismen volwassen neuraal weefsel kan worden onderzocht ontwikkelen. Wij hebben een in vitro techniek die kan worden gebruikt om een verscheidenheid van moleculaire pathways in intacte zenuwweefsel onderzoeken ontwikkeld. De hierin beschreven techniek maakt gebruik van rat corticale weefsels, maar deze techniek kan worden aangepast om weefsel te gebruikenuit diverse soorten (zoals muis, konijn, cavia en kip) of hersenen (bijvoorbeeld, hippocampus, striatum, enz.). Bovendien, een grote stimulaties / behandelingen worden gebruikt (bijvoorbeeld excitotoxische toediening van remmers, enz.). Concluderend kan de hersenen slicemodel hierin beschreven worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van moleculaire mechanismen-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken.

Inleiding

De meest voorkomende vorm van een beroerte is ischemische beroerte, die optreedt wanneer een cerebraal bloedvat wordt afgesloten. Het weefsel ischemie die het gevolg is van stopzetting van de bloedstroom veroorzaakt wijdverspreide depolarisatie van membranen, afgifte van neurotransmitters prikkelende en aanhoudende verhoging van intracellulair calcium, hetgeen leidt tot de activatie van celdood pathways ^1. Dit proces wordt genoemd "excitotoxiciteit 'en een gemeenschappelijke route betrokken bij neuronale dood door een verscheidenheid van ziekten, waaronder beroerte ^2. Remming van de signaalwegen betrokken bij excitotoxiciteit en andere neuronale celdood cascades is een aantrekkelijke benadering van neuronale schade na een beroerte te beperken.

Het identificeren van de precieze moleculaire mechanismen betrokken bij excitotoxiciteit en ischemische beroerte kan moeilijk zijn bij het gebruik van hele dieren systemen. Als zodanig primaire embryonale en 'neuronale-achtige' (bv. neuroblastoma en adenocarcinoom onsterfelijk lijnen) celkweek systemen worden vaak gebruikt. De belangrijkste voordelen van deze modellen zijn dat ze gemakkelijk te manipuleren, relatief kosteneffectief en celdood kan gemakkelijk worden gemeten en gekwantificeerd. Echter, signaalwegen worden gewijzigd door de kweekomstandigheden gebruikte ^3,4, en onvolwassen neuronen en vereeuwigd lijnen kunnen verschillende receptoren en signaalmoleculen, in vergelijking met de hersenen ^5-8 rijpen. Bovendien gekweekte neuronen alleen wordt het onderzoek van een celtype (of twee, als een gemengde cultuursysteem gebruikt), terwijl intact hersenweefsel is heterogeen, met een verscheidenheid aan celtypen die met elkaar. Organotypische slice kweeksystemen (dunne explantaten van hersenweefsel) worden ook gebruikt en deze modellen kan de studie van heterogene populaties van cellen die worden aangetroffen in vivo. Echter, slechts een beperkte hoeveelheid weefsel Van elk dier bij gebruik van deze techniek kan plakkenniet gekweekt zolang geïmmortaliseerde cellijnen en middellange tot lange termijn kweek kan leiden tot veranderingen in signaalwegen en receptoren in de segmenten. Hoewel volwassen hersenen worden gebruikt organotypische plakjes genereren segmenten van onvolwassen hersenen ontvankelijker cultuur, en meer algemeen gebruikt. Er is dan ook de noodzaak om modellen die na te bootsen of te vertegenwoordigen intacte volwassen hersenen, die gemakkelijk te gebruiken zijn, waarin neuronale signaalwegen kan worden onderzocht ontwikkelen.

Hierin wordt een in vitro techniek die intacte zenuwstelsel die kunnen worden gebruikt om moleculaire mechanismen van celdood verhelderen na excitotoxische of ischemische insult beschreven. Deze techniek vermindert het aantal benodigde dieren een experiment uitgevoerd, reproduceerbaar en genereert levensvatbaar weefsel dat zich gedraagt ​​op een metabolisch soortgelijke wijze grotere organotypische plakjes. Bovendien, de neuronale circuits, cellulaire interacties en postsynaptische compartment blijft deels intact. De fysiologische buffer gebruikt kan de celmembranen 'reseal' en stelt cellen hun oorspronkelijke membraanweerstand ⁹ herstellen. Deze brain slice model kan getrouw nabootsen responsen waargenomen na gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel ^10, en kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen betrokken bij beroerte te onderzoeken.

Protocol

Alle procedures worden uitgevoerd met instemming van de Universiteit van Newcastle Animal Care en ethische commissie, alsmede in overeenstemming met de relevante richtlijnen en regelgeving, waaronder de NSW Animal Research Act, de NSW Animal Research verordening, en de Australische Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden.

1. Dissectie van hersenweefsel

1. Sacrifice twaalf weken oude mannelijke ratten door onthoofding. Ratten kunnen ofwel worden opgeofferd door prachtige en onthoofding, of kan eerst worden verdoofd met isofluraan (5% inductie, 1,5-2% onderhoud) in 70% _N2 en 30% O _2, en vervolgens onthoofd.
2. Verwijder de hersenen uit de schedel zo snel mogelijk (idealiter, moet dit worden uitgevoerd in minder dan 2 minuten).
3. Verwijder de cortex door de vrije hand dissectie. De dissectie moeten worden uitgevoerd in de minimale tijd mogelijk, met zo weinig schade aan de hersenen mogelijk om maintain de integriteit van de segmenten.
4. Om eventuele resterende huid te verwijderen, bont, bloed, enz., dompel de hersenen in een kleine hoeveelheid (3-5 ml) van 37 ° C Krebs buffer (118 mM natriumchloride, 4,7 mM kaliumchloride, 1,3 mM calciumchloride, 1,2 mM kaliumdiwaterstoffosfaat, 1,2 mM magnesiumsulfaat, 25 mM natriumwaterstofcarbonaat, 11,7 mM glucose, 0,03 mM dinatrium-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), in evenwicht gebracht met 95% zuurstof / 5% kooldioxide (carbogen), pH 7,4).

2. Bereiding van Microslices

1. Plaats de hersenen op het podium van een McIlwain chopper waarop twee segmenten filtreerpapier zijn geplaatst en bevochtigd met warm Krebs buffer. Houd de hersenen en filterpapier bevochtigd met warm Krebs buffer, maar niet zo nat dat er vrije vloeistof op het oppervlak van het papier kan de hersenen wegglijden.
2. Snijd de hersenen in 250 micrometer coronale secties. Als voedingsstoffen, zuurstof en afvalstoffen thop zijn doorgaans uitgewisseld met de bloedtoevoer worden uitgewisseld met een vloeistof die het weefsel omgeeft in geïsoleerde neuraal weefsel, moet de omvang van de segmenten niet meer dan 400 pm dik zodat voldoende zuurstof en voedingsstoffen uitwisseling plaatsvinden.
3. Draai de McIlwain fase 90 °.
4. Snijd hersenen tot 250 micrometer sagittale plakjes. Hierin deze hersengebieden secties (250 urn x 250 urn plakjes variabele lengte, afhankelijk van de dikte van het weefsel) worden aangeduid als microslices.
5. Plaats de microslices een ronde bodem buis met 10-15 ml 37 ° C Krebs buffer (de hoeveelheid Krebs buffer zal afhangen van de hoeveelheid weefsel).

3. Gelijkschakeling van de Microslices

1. Schud voorzichtig totdat de individuele microslices worden opgeschort, en vervolgens laat ze bezinken onder zwaartekracht.
2. Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof, die troebel vanwege opgeschort cel puin zal zijn, en voeg 10 ml vers 37 ° CKrebs buffer op de buis.
3. Herhaal deze wasprocedure viermaal, wat zal resulteren in verwijdering van het meeste vuil.
4. Vervolgens evenwicht de microslices bij 37 ° C onder zacht schudden / inversie, en wijzigt de Krebs buffer elke 15 min gedurende 1 uur in totaal.
5. Op dit moment, voeg 2 ml vers 37 ° C Krebs buffer en overdracht 15-20 microslices (150 pl microslice suspensie) te platbodem polystyreen 5 ml buisjes met een wijde boring pipetpunt met afgevlakte randen (die kan worden gecreëerd door snijden ~ 2 mm van het uiteinde van een P1000 tip). Spreid de microslices gelijkmatig over de bodem van de buis in een enkele laag, zodat elke microslice niet verder dan enkele millimeters van het geoxygeneerde atmosfeer.

4. Excitotoxische Stimulatie

1. Incubeer de microslices bij 37 ° C, en voortdurend langs carbogen over het oppervlak van de 150 ul microslice suspensie via een gasleiding die positieed net boven het oppervlak van de microslice suspensie (mechanische verstoring te vermijden).
2. Behandel microslices met ofwel 150 pi 5 mM glutamaat + 100 uM glycine in Krebsbuffer (excitotoxische stimulus: eindconcentratie 2,5 mM glutamaat + 50 uM glycine) of 150 ul Krebsbuffer alleen (controle nonstimulated). Een verscheidenheid aan stimuli kan worden gebruikt in deze stap (waaronder, maar niet beperkt tot AMPA, NMDA + glycine, KCl depolarisatie en zuurstof / glucose ontbering).
3. Verwijder de incubatieoplossing op verschillende tijdstippen na stimulatie (0, 30, 60, 90, 120 en 300 seconden) en vervangen door 300 ul ijskoude homogenisatiebuffer (30 mM Tris, pH 7,4, 1 mM ethyleenglycol azijnzuur, 4 mM EDTA, 100 uM ammoniummolybdaat, 5 mM natriumpyrofosfaat, 25 mM natriumfluoride, 1 mM natriumorthovanadaat, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, volledige proteaseremmer cocktail).
4. Homogeniseren microslices op ijs, met behulp van een glas-Teflon Dounce Homogenizer(20 slagen; 700 rpm).
5. WINKEL homogenaten bij -80 ° C en verschillende signaalmoleculen, dood moleculen, etc. worden gemeten door Western blot.

Resultaten

Microslices gegenereerd deze procedure levensvatbaar en een aantal soorten (bijvoorbeeld rat, muis, kip en) kunnen worden gebruikt microslices produceren. Drie onafhankelijke maatregelen van de levensvatbaarheid zijn gebruikt: ademhalingsfrequentie (figuur 1), adenine nucleotide ratio's (figuur 2), en weefsel kaliumgehalte (figuur 3). Met deze maatregelen is aangetoond dat microslices blijven nog gedurende ten minste 2 uur na generatie.

...

Discussie

Hierin wordt een in vitro methode voor het genereren van microslices die kunnen worden gebruikt om de moleculaire mechanismen betrokken bij excitotoxiciteit en ischemie-gemedieerde celdood in intacte volwassen hersenweefsel onderzoeken beschreven. Deze techniek produceert levensvatbaar weefsel (figuren 1-3), dat is metabolisch vergelijkbaar met grotere organotypische plakjes ^15. Bovendien is dit model microslice nauw overeenkomt met de respons waargenomen na excitotoxicity gemedieerd...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Guillotine			Word gebruikt om dieren te onthoofden
Chirurgisch gereedschap			Pincetten, schaar, tang, etc., voor het verwijderen en dissekeren van hersenen
McIlwain chopper	McIlwain choppers worden geproduceerd/gedistribueerd door een aantal bedrijven waaronder Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments en Ted Pella.		Wordt gebruikt om 100-400 µm hersensecties te genereren.
Ronde bodem plastic buizen	Greiner
Waterbad			Voor het houden van weefsel op 37 °C
Bevochtiger/beluchtingsapparaat			Wordt gebruikt om microsneden in een bevochtigde, met zuurstof verrijkte omgeving te houden
Vlak geboden polystyreen buizen	Nunc
Dounce Homogenizer