Het testen van proteasomale Afbraak in een Celvrije System in Plants

Samenvatting

Gerichte afbraak van eiwitten is een belangrijke regulerende mechanisme voor de celfunctie. Het komt via een geconserveerde ubiquitineproteasoomroute, die polyubiquitine ketens hecht aan het doeleiwit dat dan als moleculaire "labels" voor het 26S proteasoom. We beschrijven hier een eenvoudige en betrouwbare celvrije assay voor proteasomale afbraak van eiwitten.

Samenvatting

De ubiquitine-proteasoom route voor eiwitafbraak voren gekomen als een van de belangrijkste mechanismen voor het regelen van een breed scala van cellulaire functies in bijna alle eukaryote organismen. Specifiek, in planten, het ubiquitin/26S proteasoom systeem (UPS) regelt eiwitafbraak en draagt ​​aanzienlijk bij tot de ontwikkeling van een groot aantal processen, waaronder immuunrespons, ontwikkeling en geprogrammeerde celdood. Bovendien, en meer gegevens suggereren dat een groot aantal planten ziekteverwekkers, zoals Agrobacterium, exploiteren de host-UPS voor efficiënte infectie, met nadruk op het belang van UPS in plant-pathogeen interacties.

De substraatspecificiteit van UPS wordt bereikt door E3 ubiquitin ligase dat werkt in samenhang met de E1 en E2 ligasen herkennen en markeren specifieke eiwitmoleculen voor afbraak bestemde met daaraan verbonden ketens van ubiquitine moleculen. Een klasse van de E3 ligasen is het SCF (SKP1 / CUllin / F-box eiwit)-complex, dat specifiek de UPS substraten en richt ze voor ubiquitination via de F-box eiwit component. Om een ​​mogelijke rol van UPS in een biologisch proces plaats te onderzoeken, is het belangrijk om een ​​eenvoudige en betrouwbare test voor UPS-gemedieerde eiwitafbraak bedenken. We beschrijven hier een dergelijke test met behulp van een plant-cel-vrij systeem. Deze test kan worden aangepast voor studies van de rol van gereguleerde eiwitafbraak bij diverse cellulaire processen, met een speciale focus op de F-box eiwit-substraat interacties.

Inleiding

De ubiquitin/26S proteasoomroute is in opkomst als een wijdverbreid mechanisme voor de controle van diverse biologische reacties, waaronder transcriptionele regulatie, cel-cyclus progressie en signaaltransductie, receptor down-regulering of endocytose, onder andere verwerkt ^1-4. In deze route, is het doelwit eiwit gelabeld door ubiquitine residuen die het eerst worden aangesloten via een thiolester binding met ubiquitine-activerend enzym E1 en vervolgens translocatie naar een cysteïne aminozuur residu van ubiquitine-conjugatie enzym E2, eindelijk, E2 interageert met ubiquitinligase E3 , waardoor polyubiquitinatie van het eiwit substraat. Uiteindelijk worden de polyubiquitinated eiwitten herkend en afgebroken door het 26S proteasoom. In dit mechanisme, de E3 enzym specificeert de ondergrond en fungeert als de belangrijkste regelgevende component van de ubiquitin/26S proteasoom systeem (UPS). E3 ligasen onafhankelijk optreden, zoals RING domein ligasen, of als onderdeel van een multisubunit SCF (Skp1/Cullin/F-box proteïne)-complex, zoals F-box domein ligases. SCF-gemedieerde proteasomale afbraakroutes zijn betrokken bij de regulatie van transcriptie, celcyclus, signaaltransductie ^5-10 en vele andere belangrijke cellulaire functies.

Naast deze kritische rol bij de regulatie van cellulaire processen, UPS duurt het centrale podium in veel plant-pathogeen interacties. Bijvoorbeeld meer gegevens suggereren dat verschillende planten pathogenen, waaronder Agrobacterium tumefaciens, vertrouwen op de host UPS voor om de infectie proces ¹¹ te vergemakkelijken. Agrobacterium lokt neoplastische groei op planten, zijn natuurlijke gastheren te vertegenwoordigen, en het kan ook veranderen diverse andere eukaryoten, van schimmels ^1,2 tot menselijke cellen ^12,13. Tijdens de infectie, Agrobacterium exporteert een DNA-element (T-DNA) en verscheidene virulentie (Vir) proteïnen in de gastheercel ^12-13. Een van deze eiwitten is VirF, de eerste F-box eiwit gevondenwordt gecodeerd door een prokaryote genoom ^14. Als onderdeel van de SCF ubiquitine ligase complex VirF De praktisch gastheer homoloog VBF ¹⁵ vergemakkelijken Agrobacterium infectie via de UPS-gemedieerde eiwitafbraak, die vermoedelijk vergemakkelijkt uncoating van de binnenvallende bacterieel T-DNA van de bijbehorende bacteriële en gastheereiwitten, VirE2 en VIP1, respectievelijk ^16,17. Interessant is dat veel F-box eiwitten, waaronder VirF, intrinsiek onstabiel vanwege hun proteolyse, wat gemedieerd door autoubiquitination activiteit ^18,19 of andere E3 ligasen waarvoor F-box eiwitten als substraten ^20-23 dienen.

Bij het bestuderen van biochemische activiteiten van F-box eiwitten, met ubiquitine ligasen en / of hun substraten, zou het zeer nuttig zijn om een ​​eenvoudige en betrouwbare test voor proteasomale degradatie gebruiken. Hier beschrijven we een dergelijk protocol voor de analyse proteïne stabiliteit in een cel-Vrij systeem. In deze bepaling wordt de stabiliteit van de UPS substraat geanalyseerd in de aanwezigheid of afwezigheid van een van de essentiële componenten van de proteasomale afbraak route, zoals een F-box eiwit in een celvrij systeem. Over het algemeen spreken wij de geteste eiwit (s) in plantaardige weefsels, bereiden cel-vrije extracten uit deze weefsels en toezien op de hoeveelheden van het eiwit (s) van belang door western blotting. De UPS-afhankelijk mechanisme van eiwitdegradatie wordt aangetoond door opname van specifieke proteasomale remmers en / of met co-expressie van dominant-negatieve vorm van SCF component, Cullin. Terwijl wij illustreren deze assay gebruikt proteasomale afbraak van de Arabidopsis VIP1 ¹⁷ eiwit door de F-box eiwit VBF ¹⁵ kan worden toegepast om de stabiliteit van andere proteasomale substraten te onderzoeken.

Protocol

1. Eiwitexpressie

1. Keuze van meningsuiting systeem
   Systeem selecteren, dat wil zeggen vectoren en vector levering methode, meest geschikt voor expressie van het eiwit van belang in de specifieke modelorganisme / cel. Merk op dat onze test vereist expressie van de geteste eiwitten in gemakkelijk waarneembaar bedragen, die het best bereikt door transiënte transformatie van grote aantallen cellen. In planten, bijvoorbeeld, is het beste bewerkstelligd met behulp van binaire plasmiden als expressievectoren en Agrobacterium als afgiftesysteem.
2. Constructie van binaire expressievectoren
   Kloon de coderende sequentie (s) van het eiwit (ten) van belang in een expressievector alleen of in translationele fusie aan een epitoop tag. Gebruik vectoren geschikt voor het gekozen expressiesysteem en standaard moleculair biologische procedures voor genklonering. Voor Agrobacterium-gemedieerde gentherapie, in dienst binaire vectoren en hen te introduceren, ook met behulp van Standard protocollen in een Agrobacterium-stam, zoals EHA105, voor daaropvolgende inoculatie van plantenweefsels.
3. Keuze van plantensoorten
   Selecteer de plantensoorten waarin het eiwit (s) van belang wordt uitgedrukt. Merk op dat, terwijl alle planten die gevoelig zijn voor Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie worden gebruikt, onze plantensoorten van keus Nicotiana benthamiana die gemakkelijk wordt gekweekt, zeer gevoelig voor Agrobacterium, en heeft grote bladeren die gemakkelijk worden geïnoculeerd.
4. Plantengroei
   Grow een fabriek voor 4 tot 6 weken in een pot met Pro-Mix BX in een pot (20 cm x 20 cm x 20 cm) onder milieuvriendelijke gecontroleerde omstandigheden (bv. groei kamer) van de lange dag (dwz 16 uur van 130 -150 uE m-2 s-1 licht bij 23 ° C en 8 uur donker bij 20 ° C) en 40-65% relatieve vochtigheid.
   1.5.2 Bemesten af ​​en toe met de handel verkrijgbare producten per instructies van de fabrikant. Zodra de plant wordt geteeld, selecteertbladeren met de grootte van 50 mm x 70 mm of groter (deze lengte metingen omvatten niet de bladsteel) voor Agrobacterium inenting.
5. Inoculatie met Agrobacterium
   Kweek Agrobacterium stam die de binaire construct tot expressie de geteste eiwit (ten) van stap 1.3 overnacht bij 28 ° C in YEP-medium (1% pepton, 1% gistextract en 0,5% NaCl) aangevuld met geschikte antibiotica (bijvoorbeeld 100 mg / L streptomycine en 10 mg / l rifampicine voor pPZP-RSC2-gebaseerde vectoren ^24-25).
   1.6.2 Centrifugeer de cellen opnieuw gesuspendeerd tot OD ₆₀₀ = 0,5 infiltratie buffer [10 mM _MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 100 pM acetosyringoon] en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Infiltreren de cultuur in de abaxiale zijde van een blad, met een 1-ml naaldloze injectiespuit, mee dat de bladeren geïnoculeerd in situ, terwijl wordt aan de plant bevestigd.
   1.6.3 Na infiltratie, groeien de plant gedurende 72 uur onder het licht regime van 16 uur 130-150 &# 181, E m-2 s-1 licht bij 23 ° C / 8 uur donker bij 20 ° C voor de oogst.
6. Toepassing van proteasomale remmers
   Om de gedachte dat de geteste eiwit (ten) wordt afgebroken via een proteasoom route ondersteunen gebruiksspecifieke proteasomale remmers MG132 en lactacystin ^28-29, die moet verminderen of zelfs blokkeren afbraak. Vier uur voor de oogst (zie Stap 2.1), infiltreren de-Agrobacterium geënt blad gebieden met 10 uM MG132 (EMD Millipore) of 10 uM lactacystin (Sigma-Aldrich) of modellen behandelen het blad met de respectieve oplosmiddelen, dwz 0,1% DMSO of gedestilleerd water.

2. Bereiding van celvrije extracten

1. Blad oogsten
   Oogst de geënte delen van het blad, meestal ca.. 200-400 mg vers gewicht, en stamp ze fijn tot fijn poeder in vloeibare stikstof. Als alternatief, kraal-winnen van de weefsels, met behulp van een kraal-beater (bijv. Biospec) of een tandheelkundige amalgamator (bijv. TPC Geavanceerde Technologies) direct bij de afbraak-buffer (zie Stap 2.2).
2. Eiwitextractie
   Bereid totaal eiwit extract door het plaatsen van de grond weefsel in 500 ui afbraak buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM _MgCl2, 5 mM DTT, 5 mM adenosine 5'-trifosfaat en 1x proteaseremmer Cocktail (Sigma-Aldrich)]. Merk op dat de proteaseremmer cocktail voornamelijk invloed serine, cysteïne, asparaginezuur en metalloproteasen en niet interfereert met de 26S protease. Verduidelijken het extract door twee opeenvolgende centrifugeren bij 12.000 xg gedurende 5 minuten.
3. Eiwitafbraak reactie
   Overdracht gelijke volumes extracten, meestal 20 pl, microfuge buizen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende toenemende perioden. Typisch, sample tijd nul, en 5, 10, 15, 20, en 30 minuten tijdstippen. Stop reacties door koken in SDS-gel-sample buffer, en ze te analyseren met western blotting.

jove_title "> 3. Opsporen afbraak van eiwitten door immunoblotting

1. Gel elektroforese
   3.1.1 Los het eiwitmonsters door SDS-polyacrylamidegel elektroforese en elektro-de opgeloste eiwitten op een nitrocellulose membraan volgens het standaardprotocol ^30.
   3.1.2 Bepaal eiwitconcentratie volgens de Bradford methode (Bio-Rad), en laadt 50-80 ug totaal eiwit per laan. Zorg ervoor dat alle monsters gelijk worden geladen. Voor het laden controles vergelijken intensiteiten van een alomtegenwoordige eiwit species, zoals vermeende RuBisCo grote ketens die migreren als een hoofdband met een relatieve elektroforetische mobiliteit van ongeveer 50 kDa, kunnen ze worden gedetecteerd op met Coomassie-blauw gekleurde gelen of Ponceau S-of fluorescerende SYPRO Ruby-gekleurd nitrocellulosemembranen.
2. Blokkeren
   Blokkeer het membraan met 5% magere melk in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
3. Primaire antilichaam
   Verdun primaire anti-epitoop-antilichaam in 1% afgeroomde melk in TBST bij de concentratie door de fabrikant en incubeer de geblokkeerde membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C onder zacht schudden.
4. Spoelen
   Spoel het membraan gespoeld in 20 ml TBST gedurende 15 min eenmaal en tweemaal gedurende 5 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
5. Secundair antilichaam
   Verdun secundair antilichaam (bijvoorbeeld anti-konijn IgG) geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) in 1% afgeroomde melk in TBST zoals aanbevolen door de fabrikant en incubeer met het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
6. Opsporing
   Spoel het membraan weer zoals beschreven in stap 3.4. Na de laatste spoeling in TBST, visualiseer de eiwitten van belang met een HRP chemiluminescentiesubstraat, meestal met behulp van een ECL-kit.

Resultaten

Figuur 1, aangepast van Zaltsman et al.. ^17, illustreert representatieve experimenten voor de detectie van proteasomale afbraak in een cel-vrij systeem. Specifiek, tonen we destabilisatie van een plant defensiegerelateerde eiwit VIP1 door de VBF F-box eiwit via de SCF ^VBF pathway in N. benthamiana. Arabidopsis VBF en HA-gelabeld VIP1 (HA-VIP1) eiwitten werden tijdelijk coexpressed, en HA-VIP1 eiwitgehalte in extracten van het uiten van bladeren werd geana...

Discussie

Deze test berust op de expressie van de geteste eiwitten in plantenweefsels, dus de potentiële proteasomale afbraakproces uiteraard het reeds in het levende weefsel. We assay eiwit destabilisatie echter alleen in de extracten met tijdstip nul monster die als eerste referentiepunt. Daarom definiëren we als een celvrij assay.

Éen belangrijk aspect van het succes van deze test is de juiste keuze van de expressievector waarvan de geteste eiwitten (s) geproduceerd. Behoudens specifieke antilicham...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Protein assay kit	Bio-Rad	500-0001
Proteinase inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	S8820
Mini-Protean systeem	Bio-Rad	165-8000
Semi-dry western blotting SD elektroforesesysteem	Bio-Rad	170-3940
Affiniteit Gezuiverde Konijn Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
Geit anti-Konijn IgG Peroxidase Conjugaat	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membraan	Pall Corporation	27377-000
Immobilon western chemiluminescent HRP substraat	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lactacystine	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substraat	Pierce	35055