Method Article

Expressie, isolatie en zuivering van oplosbare en onoplosbare Biotinylated Eiwitten voor Nerve Tissue Regeneration

DOI:

10.3791/51295

⸱

January 22nd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Akron

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ontwikkelen biotinylatable fusie-eiwitten heeft veel potentiële toepassingen in diverse gebieden van onderzoek. Recombinant eiwit-engineering is een rechttoe rechtaan procedure die is kosteneffectief, het verstrekken van hoge opbrengsten van op maat gemaakte eiwitten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recombinant eiwit-engineering heeft gebruikt Escherichia coli (E. coli) expressie systemen voor bijna 4 decennia, en vandaag E. coli is nog steeds de meest gebruikte gastheerorganisme. De flexibiliteit van het systeem maakt de toevoeging van groepen zoals een biotine-tag (voor streptavidine interacties) en grotere functionele eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit of kersen rode eiwit. Ook is de integratie van natuurlijke aminozuren zoals metaalion chelatoren, unieke reactieve functionele groepen, spectroscopische probes, en moleculen verlenen posttranslationele modificaties betere manipulatie van eiwitten eigenschappen en functionaliteiten ingeschakeld. Als gevolg van deze techniek creëert aanpasbare fusie-eiwitten die belangrijke hulpprogramma voor verschillende terreinen van onderzoek aan te bieden. Meer specifiek heeft de biotinylatable eiwitsequentie opgenomen in vele doeleiwitten vanwege de hoge affiniteit interactie tussen biotine met avidine en streptavidine. Deze toevoeging heeft geholpen bij het verbeteren van de detectie en zuivering van gemerkte eiwitten en opent de weg voor secundaire toepassingen zoals celsortering. Aldus biotine gelabelde moleculen vertonen een toenemend en wijdverspreide invloed bioindustrial en biomedische gebieden. Voor het doel van ons onderzoek hebben wij recombinante fusieproteïnen die gebiotinyleerde zenuwgroeifactor (NGF) en semaphorin3A (Sema3A) functionele regio ontworpen. We hebben eerder gemeld hoe deze gebiotinyleerde fusie-eiwitten samen met andere actieve eiwitsequenties kunnen worden vastgebonden aan biomaterialen voor tissue engineering en regeneratieve doeleinden. Dit protocol beschrijft de basisprincipes van de techniek biotinylatable eiwitten op de milligram schaal, met behulp van een T7 lac induceerbare vector en E. coli expressie gastheren, vanaf transformatie naar schaal-en zuivering.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitten omvatten een breed scala van biomoleculen die verantwoordelijk zijn voor vele biologische functies, uiteindelijk leidend tot goede vorming en organisatie weefsel. Deze moleculen initiëren duizenden signaalwegen die de controle up-regulatie en / of down-regulatie van genen en andere eiwitten, een evenwicht te bewaren in het menselijk lichaam. Verstoring van een enkel eiwit beïnvloedt dit hele web van signalen, wat kan leiden tot het ontstaan ​​van verwoestende aandoeningen of ziekten. Engineering van afzonderlijke eiwitten in het lab biedt een oplossing voor de bestrijding van deze bijwerkingen en biedt een alternatief voor kleine molecules. In 1977, een gen ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het ontwerpen van doeleiwit

  1. De National Center for Biotechnology Information website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) an amino sequentie voor het doeleiwit rekening houdend met de van belang zijnde species en eventuele splice-varianten. Selecteer de aminozuursequentie die overeenkomt met het actieve gebied van belang van het eiwit.
    Opmerking: Voor Sema3A werden aminozuren 21-747 gekozen. Fusie-eiwit werd ontworpen met NGF waarbij de sequentie van barstar, aminozuren 1-90, werd toegevoegd aan NGF aminozuren 122-241.
  2. Om de N-terminus voeg de follow sequenties: 6X-His tag voor zuivering (HHHHHH), Tobacco Etch Virus (TEV) pro....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonen en Test Expression

Wanneer plating behoren wordt uitgevoerd, moet enkele geïsoleerde kolonies te vormen om de kansen van plukken klonale getransformeerde bacteriecellen (Figuur 2A) verhogen. Echter, als er te veel cellen zijn bedekt, platen te lang geïncubeerd bij 37 ° C of transformatie is twijfelachtig, kolonies kan de agar plaat te dekken of te vormen grotere aggregaten van cellen (fig. 2B en 2C). Tijdens tes.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recombinant eiwit-engineering is een zeer krachtige techniek die vele disciplines overspant. Het is kosteneffectief, afstembare en een relatief eenvoudige procedure, waardoor de productie van hoge opbrengsten van op maat gemaakte eiwitten. Het is belangrijk op te merken dat het ontwerpen en expressie doeleiwitten is niet altijd eenvoudig. Basale expressie en recombinant proteïne stabiliteit afhankelijk van specifieke keuzen van vector, E. coli celstammen, peptide tag aanvullingen en teelt parameters. Onze speci.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag de Universiteit van Akron erkennen voor de financiering die dit werk ondersteund.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Chem-Impex International127100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-MercaptoethanolChem-Impex International642250 ml
Acetic acid, glacialEMDAX0073-92.5 L
AgarBioshopAGR001.500500 g
Ampicillin sodium salt Sigma-AldrichA951825 g
Antifoam 204Sigma-AldrichA6426500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
BL21(DE3) Competent CellsNovagen694501 ml; Expression Host
Bradford reagentSigma-AldrichB6916500 ml
BugBusterNovagen70922-3100 ml
Gel filtration standardBio-Rad151-19016 vials
GlycerolBioshopGLY001.11 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochlorideChem-Impex International1521 kg
His-Pur Ni-NTA ResinThermo Scientific88222100 ml
Hydrochloric acidEMDHX0603-32.5 L
Imidazole Chem-Impex International418250 g
IPTGChem-Impex International194100 g
Laemmli sample bufferBio-Rad161-073730 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surfaceChem-Impex International270500 g
LB Broth  Sigma-AldrichL30221 kg
NovaBlue Competent CellsNovagen698251 ml; Cloning Host
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP5368-10PAK10 pack
Potassium ChlorideChem-Impex International012471 kg
Sema3A-pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC60601 L
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886-1KG1 kg
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-500500 g
Sodium phosphate diabasicSigma-AldrichS5136-500G500 g
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS5011500 g
Terrific BrothBioshopTER409.55 kg
Tetracycline hydrochlorideChem-Impex International66725 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10xBio-Rad16107321 L
Trizma BaseSigma-AldrichT15031 kg
Tryptone, pancreaticEMD1.07213.10001 kg
Yeast extract, granulatedEMD1.03753.0500500 g
 ÄKTApurifier10GE Healthcare28-4062-64Includes kits and accessories
Benchtop Orbital ShakerThermo ScientificSHKE4000MAXQ 4000
BirA500AvidityBirA500Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis CasetteThermo Scientific66380Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis TubingSpectrum Laboratories132127, 132129MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923GE Healthcare11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay KitInvitrogen1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack CGE Healthcare18-6083-13
Fraction Collector Frac-950GE Healthcare18-6083-00Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator VWR13271-102Model 1156D
Heating Oven FD SeriesBinderModel FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pgGE Healthcare17-1069-01Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti CentrifugeBeckman Coulter393126
JA 25.50 RotorBeckman Coulter363055
JLA 8.1 RotorBeckman Coulter969329Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 RotorBeckman Coulter368690
Laminar Flow HoodThemo Scientific1849Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate ReaderTECANinfinite M200
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-80044-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast GelsBio-Rad456-9036Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA ColumnBio-Rad737-251249 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep KitOmega Bio-TekD6943-01
PowerPac HC Power SupplyBio-Rad164-5052250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer TubesVWR3119-005050 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF ConcentratorsCorning431488, 431483 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning ServiceGenScript USA Inc.Protein Services
Ultrasonic Processor Cole-Parmer18910445AModel CV18
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236Model G560

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
  2. Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemic....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biotinylated ProteinsE coli ExpressionAffinity ChromatographyProtein PurificationNerve Growth FactorSemaphorin3ASDS Page AnalysisFPLC PurificationNative IsolationNon native Isolation

Related Articles