Expressie, isolatie en zuivering van oplosbare en onoplosbare Biotinylated Eiwitten voor Nerve Tissue Regeneration

Samenvatting

Ontwikkelen biotinylatable fusie-eiwitten heeft veel potentiële toepassingen in diverse gebieden van onderzoek. Recombinant eiwit-engineering is een rechttoe rechtaan procedure die is kosteneffectief, het verstrekken van hoge opbrengsten van op maat gemaakte eiwitten.

Samenvatting

Recombinant eiwit-engineering heeft gebruikt Escherichia coli (E. coli) expressie systemen voor bijna 4 decennia, en vandaag E. coli is nog steeds de meest gebruikte gastheerorganisme. De flexibiliteit van het systeem maakt de toevoeging van groepen zoals een biotine-tag (voor streptavidine interacties) en grotere functionele eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit of kersen rode eiwit. Ook is de integratie van natuurlijke aminozuren zoals metaalion chelatoren, unieke reactieve functionele groepen, spectroscopische probes, en moleculen verlenen posttranslationele modificaties betere manipulatie van eiwitten eigenschappen en functionaliteiten ingeschakeld. Als gevolg van deze techniek creëert aanpasbare fusie-eiwitten die belangrijke hulpprogramma voor verschillende terreinen van onderzoek aan te bieden. Meer specifiek heeft de biotinylatable eiwitsequentie opgenomen in vele doeleiwitten vanwege de hoge affiniteit interactie tussen biotine met avidine en streptavidine. Deze toevoeging heeft geholpen bij het verbeteren van de detectie en zuivering van gemerkte eiwitten en opent de weg voor secundaire toepassingen zoals celsortering. Aldus biotine gelabelde moleculen vertonen een toenemend en wijdverspreide invloed bioindustrial en biomedische gebieden. Voor het doel van ons onderzoek hebben wij recombinante fusieproteïnen die gebiotinyleerde zenuwgroeifactor (NGF) en semaphorin3A (Sema3A) functionele regio ontworpen. We hebben eerder gemeld hoe deze gebiotinyleerde fusie-eiwitten samen met andere actieve eiwitsequenties kunnen worden vastgebonden aan biomaterialen voor tissue engineering en regeneratieve doeleinden. Dit protocol beschrijft de basisprincipes van de techniek biotinylatable eiwitten op de milligram schaal, met behulp van een T7 lac induceerbare vector en E. coli expressie gastheren, vanaf transformatie naar schaal-en zuivering.

Inleiding

Eiwitten omvatten een breed scala van biomoleculen die verantwoordelijk zijn voor vele biologische functies, uiteindelijk leidend tot goede vorming en organisatie weefsel. Deze moleculen initiëren duizenden signaalwegen die de controle up-regulatie en / of down-regulatie van genen en andere eiwitten, een evenwicht te bewaren in het menselijk lichaam. Verstoring van een enkel eiwit beïnvloedt dit hele web van signalen, wat kan leiden tot het ontstaan ​​van verwoestende aandoeningen of ziekten. Engineering van afzonderlijke eiwitten in het lab biedt een oplossing voor de bestrijding van deze bijwerkingen en biedt een alternatief voor kleine molecules. In 1977, een gen dat codeert voor de 14 aminozuursequentie somatostatine sequentie was een van de eerste gemodificeerde polypeptiden gemaakt met E. coli ^1. Al snel na in 1979, werd insuline gekloond in plasmide pBR322, getransformeerd, uitgedrukt, en gezuiverd ^2. Sindsdien hebben recombinante eiwitten hun invloed uitgebreid naar meerdere velden van research zoals biomaterialen, drug delivery, tissue engineering, biofarmaceutische, landbouw, industriële enzymen, biobrandstoffen, etc. (zie voor referenties ^3-8). Dit is grotendeels te wijten aan de veelzijdigheid die de techniek biedt via de toevoeging van toepassingsspecifieke chemische delen of eiwit sequenties voor doeleinden zoals, maar niet beperkt tot, doeleiwit identificatie, stabilisering en zuivering.

Via recombinant DNA technologie kunnen recombinante eiwitten tot expressie worden gebracht in een verscheidenheid van eukaryotische en prokaryotische gastheer met inbegrip van zoogdieren, planten, insecten, gist, schimmels of bacteriën. Elke host biedt verschillende voordelen en typisch het beste systeem wordt bepaald op basis van eiwitfunctie, opbrengst, de stabiliteit, de totale kosten en schaalbaarheid. Bacteriecellen missen vaak de post-translationele modificatie mechanismen die eukaryotische gastheren (dat wil zeggen glycosylering, disulfide bridging, e tc.) ^5. Daardoor zoogdier en insecten systemen meestal resulteren in betere compatibiliteit en expressie van eukaryote eiwitten, maar deze systemen zijn doorgaans duurder en tijdrovender ^9. Daarom E. coli is de favoriete gastheer voor onze expressie systeem omdat de cellen snel uit te breiden in goedkope groeicondities en de genetische expressie mechanismen zijn goed begrepen ^5,9. Bovendien is dit systeem eenvoudig opschaling voor productiedoeleinden en resulteert in functionele eiwitten ondanks het ontbreken van post-translationele modificaties ^10. De E. coli K12 stam wordt gekozen in dit protocol voor het klonen, omdat deze stam biedt uitstekende plasmide rendementen op basis van hoge efficiëntie van de transformatie. Bovendien, een E. coli BL21 stam wordt gebruikt voor expressie, omdat deze host stam bevat de T7 RNA polymerase gen waarbij gereguleerde eiwit expressie en stabiliteit ¹¹ biedt.

tent "> Na hostselectie moeten verdere zorg worden genomen bij het selecteren van de ideale expressievector geselecteerde en gecontroleerde eiwitexpressie te vergemakkelijken. synthetiseren recombinante eiwitten begint met een doel DNA-sequentie die is gekloneerd onder leiding van bacteriofaag T7 transcriptie en translatie-signalen, en expressie wordt geïnduceerd in gastheercellen die chromosomale kopie van het T7 RNA polymerase gen ^12. Deze vectoren verkregen uit plasmide pBR322 (voor overzicht zie referentie ^13), wordt streng gecontroleerd door de T7-promotor oorspronkelijk ontwikkeld door Studier en collega's ¹⁴ en aanvullende controle door opname van de lac operator en lac-repressor (LAC1) ^15,16. Voor recombinante eiwit-engineering, dit expressiesysteem biedt de mogelijkheid om een specifiek aminozuur sequentie van een gewenst eiwit aanpassen door het invoegen van verschillende doelwit DNA sequenties of fusie-eiwitten maken bestaande uit gecombineerde domeins van enkele eiwitten. Bovendien, sommige vectorreeks omvatten peptide tag modificaties aan het N-of C-uiteinde worden geplaatst. Voor onze design doeleinden, werd een histidine (His) tag aan de DNA-doelsequentie voor zuivering toegevoegd en een 15 aminozuur biotinylatable sequentie werd opgenomen voor biotinylatie ^17,18. In dit protocol een plasmide dat een ampicilline resistentiegen, werd gekozen om onze biotinylatable fusieproteïne sequenties dragen. Expressie wordt gecontroleerd in deze vector via de T7-lac-promoter en is gemakkelijk geïnduceerd met isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).

Test uitdrukkingen (kleinschalig kweken) worden gebruikt om de aanwezigheid en de oplosbaarheid van het doeleiwit, die kan worden uitgedrukt in een oplosbare of onoplosbare vorm tot zuiveringsprocedures formuleren bepalen. Een oplosbare proteïne die binnen de bacterie cel zal spontaan vouwen ondergaan om de natieve structuur ¹⁹ te handhaven. Typisch de inheemsestructuur is thermodynamisch gunstig. In veel gevallen de metabolische activiteit van het systeem is niet bevorderlijk voor het doeleiwit, plaatsen belasting van het systeem leidt tot onoplosbare eiwitproductie en de vorming van insluitingslichamen uit onoplosbare proteïneaggregaten. Dus het doelwit eiwit denatureert, waardoor ze in het algemeen biologisch inactief ^20. Beide testen uitdrukkingen worden opgeschaald en isolatieprocedures worden bepaald door de oplosbaarheid van het doeleiwit. Een extra renaturatie of terugvouwstap is vereist voor onoplosbare eiwitten. De resulterende recombinante eiwitten kunnen verder worden gezuiverd met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie.

In huis biedt productie van recombinant eiwit kostenvoordelen ten opzichte van commerciële producten sinds milligram doelwit eiwit kan worden geïsoleerd per liter van de belangrijkste cultuur. De meeste van de benodigde apparatuur is verkrijgbaar in een typisch biologisch of chemisch laboratorium. Protein engineering zorgt voor creatieaangepaste fusie-eiwitten met toegevoegde functionaliteiten die niet in de handel verkrijgbaar zijn altijd. Figuur 1 toont de belangrijkste procedures die betrokken zijn bij techniek recombinante eiwitten. Met dit expressiesysteem hebben we veel biotinylatable eiwitten, zoals interferon-gamma, van bloedplaatjes afgeleide groeifactor, en bot-morfogenetisch eiwit ^21-23 geregistreerd, maar zich op twee eiwitten die we ontworpen voor axon begeleiding, NGF (29 kDa ) en Sema3A (91 kDa) ¹⁰ (voor een overzicht zie referentie ^24). Biotinylering is een veelgebruikte techniek voor identificatie, immobilisatie en isolatie van gemerkte eiwitten met behulp van de bekende biotine-streptavidine interactie ^25-27. Biofysische probes ^28,29, biosensoren ^30, en quantum dots ³¹ zijn enkele voorbeelden van systemen die de hoge affiniteit van biotine-streptavidine conjugatie met een K _d in de orde van 10 ^-15 M ²⁷ gebruiken. De E. coli biotin ligase, BirA, helpt bij de covalente binding van biotine aan de lysinezijketen gevonden binnen de biotine gelabeld volgorde ^18,32. Tethering biotine om materialen en biomoleculen heeft resulteerde in een continue levering van groeifactoren naar cel voor meerdere tissue engineering toepassingen ^21,33-35. Daarom ingenieursbureau met deze speciaal ontworpen biotinylatable eiwitten is een krachtige tool die meerdere onderzoeksinteresses kunnen overstijgen.

Protocol

1. Het ontwerpen van doeleiwit

1. De National Center for Biotechnology Information website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) an amino sequentie voor het doeleiwit rekening houdend met de van belang zijnde species en eventuele splice-varianten. Selecteer de aminozuursequentie die overeenkomt met het actieve gebied van belang van het eiwit.
   Opmerking: Voor Sema3A werden aminozuren 21-747 gekozen. Fusie-eiwit werd ontworpen met NGF waarbij de sequentie van barstar, aminozuren 1-90, werd toegevoegd aan NGF aminozuren 122-241.
2. Om de N-terminus voeg de follow sequenties: 6X-His tag voor zuivering (HHHHHH), Tobacco Etch Virus (TEV) protease gesneden site voor het verwijderen van Zijn tag (ENLYFQG), biotine gelabeld sequentie voor biotinylatie van eiwit op K (GLNDIFEAQKIEWHE) en flexibele scharnier met lacunes die ruimte voor een goede eiwit refolding (EFPKPSTPPGSSGGAP) zal toestaan.
   Opmerking: Deze sequenties kunnen variëren naargelang de gewenste fusie-protein.
3. Stuur volledige aminozuursequentie een bedrijf voor gen ontwerp / optimalisatie voor gewenste gastheersoorten en synthese. Subkloneren in een vector naar keuze met het BamHI-NotI-plaats met behulp van een kit of door gebruik commerciële diensten.

2. Maken agarplaten

Opmerking: Het is heel belangrijk dat alle voorraden van antibiotica, borden, buffers, etc. behoren zijn opgeslagen (temperatuur en duur) en blijven vrij van proteasen (gesteriliseerd).

1. Weeg agar op 1,5 gew% en lysogenie bouillon (LB) bij 20 g / L en plaats in een glazen fles media. Een flesje van 500 ml maakt ongeveer 15 platen.
2. Volumetrisch voegen ultrapuur water, meng goed, en autoclaaf.
3. Laat fles koel aan en voeg de juiste antibiotica. Voorkom voortijdige stolling van agar, maar als fles koelt te veel en oplossing begint te stollen, opwarmen in de magnetron.
   Opmerking: Onze plasmide bevat een ampicillineresistentie gene. Daarom moeten alle stappen ampicilline bevat bij 100 ug / ml. De E. coli klonen K12-stam vereist tetracycline (12,5 pg / ml) antibioticum. BL21 bacteriecellen geen extra antibioticum.
4. Giet 25-30 ml oplossing in 90 mm petrischaaltjes en voldoende tijd om te drogen.
5. Label schotel met geschikte antibiotica en opslaan ondersteboven in 4 ° C, met Parafilm en in een hersluitbare zak.
   Opmerking: De platen zijn goed voor ongeveer een maand.

3. Klonering van de biotine Tagged Plasmide

Let op: Voorwaarden worden aseptisch gebeuren.

1. Spin down plasmidevector bij 6.000 xg gedurende 3 minuten om pellet, en voeg 10 ul van gesteriliseerd ultrapuur water.
2. Verwijder 50 pl chemisch competente E. coli hoge transformatie-efficiëntie cellen van -80 ° C en onmiddellijk plaats op ijs gedurende 5-10 minuten.
3. Voeg 1 ul van vector oplossing bij 0,5-1 ng/5056, l cellen aan de 50 ul E. coli-cellen en plaats de resterende plasmide -80 ° C.
4. Plaats de bacterie cellen die de vector op ijs gedurende 5 minuten.
5. Heat shock de cel en vector mengsel gedurende 30-45 sec bij 42 ° C waterbad en plaats cellen terug op ijs gedurende 2 minuten.
6. Voeg 250 ul van super optimale bouillon met katabolische repressie (S) medium (2% w / v Bacto-trypton, 0,5% gew / vol bacto-gistextract, 8,56 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM _MgSO4, 20 mM glucose , ultrazuiver water, pH = 7,0) en schudden bij 250 rpm bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
   Opmerking: SOC mag niet worden geautoclaveerd maar zijn filter gesteriliseerd door een 0,22 urn filter.
7. Droge platen 10-15 min voor plating cellen.
8. Pipetteer 25, 50 en 100 ui celoplossing op afzonderlijke agarplaten die ampicilline (100 ug / ml) en tetracycline (12,5 pg / ml) antibiotica. Gebruik glazen kralen om de oplossing gelijkmatig over agar-platen te verdelen.
9. Incubeer de platen omgekeerd bij 37 ° C gedurende 15-18 uur.
10. Controleer voor kleine afzonderlijke bacteriekolonies op platen en opslaan kop bij 4 ° C tot gebruik (figuur 2A).
    1. Als er geen kolonies aanwezig zijn:
       1. Controleer de versheid en de steriliteit van buffers en benodigdheden.
       2. Verhoog de ​​hoeveelheid plasmide toegevoegd E. coli K12-stam.
    2. Als grote kolonies aanwezig zijn of er een overmatige groei van de kolonies (figuur 2B en 2C), restreak een nieuwe agar plaat met een steriele enting lus of plaat cellen bij een lager volume.
11. Inoculeer 5 ml LB met ampicilline (100 ug / ml) en tetracycline (12,5 pg / ml) antibiotica met een enkele kolonie van getransformeerde E. coli-cellen. Grow-up cellen overnacht bij 37 ° C bij 250-300 rpm.
12. De volgende dag, gebruikt een plasmide isolatie kit om de doelvector isoleren van de nachtelijke grow-en store gezuiverd plasmide bij -80 ° C tot verder gebruik.
    1. Optioneel: Controleer de zuiverheid en de concentratie van het plasmide met behulp van absorptie lezing verkregen bij 260 en 280 nm.

4. Transformatie van plasmide in Expression Host

Let op: Voorwaarden worden aseptisch gebeuren.

1. Herhaal stap 3,2-3,10 voor E. coli BL21 cellen met de volgende wijzigingen:
   Opmerking: BL21 cellen geen extra antibiotica nodig, dus alleen ampicilline wordt toegevoegd aan de agar platen voor transformatie.
   1. Voeg 2-5 ul van geïsoleerde plasmide op 0,5-2 ng/50 pi cellen uit stap 3,12-50 pi E. coli-expressie gastheercellen.
   2. Heat shock cellen voor 60-90 sec.
   3. Schud oplossing die SOC medium bij 250 rpm gedurende 60 minuten in plaats van 30 minuten.
2. Pluk een enkele kolonie van getransformeerde bacteriën cellen uit de petrischaal met een sterile applicator stick en plaats in een reageerbuis met 5 ml LB-medium met de juiste concentratie van ampicilline (100 ug / ml).
3. Plaats reageerbuizen in shaker nacht bij 37 ° C bij 250 rpm.
4. De volgende ochtend, neem 200 ul van de dag te behalen-up toevoegen aan 5 ml LB met ampicilline 100 ug / ml.
5. Bevries de resterende cellen met 250 pi 50% glycerol (steriel) tot 750 ul cultuur en -80 ° C te houden
   Opmerking: Nieuwe test expressie en schaal-procedures kan worden gedaan met behulp van een steriele applicator stok een schrapen van bevroren cellen te verkrijgen en enten LB met de juiste antibiotica.
6. Plaats reageerbuis in schudder bij 250-300 tpm bij 37 ° C totdat de optische dichtheid (OD) wordt gemeten tussen 0,7-0,8 bij een absorptie van 600 nm.
7. Veroorzaken cellen met IPTG in een eindconcentratie van 1 mM.
8. Schud gedurende nog eens 4 uur bij 37 ° C bij 300 rpm. Als alternatief kunnen ook cellenworden overnacht geschud bij 18 ° C bij 250-300 rpm. Dit kan een hogere opbrengst van plasmide produceren afhankelijk van het doeleiwit.
9. Natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) analyse van Test Expressie
   1. Neem 500 ul van cultuur en plaats in een 1,5 ml buis. Spin down op 13-15 xg gedurende 5 minuten. Giet de bovenstaande vloeistof en label "oplosbaar." Resuspendeer pellet met vortexen in 200 ul laadkleurstof (50 pi 2-mercapto-ethanol, 950 ul Laemmli monster buffer).
      Opmerking: Oplosbaar bacteriën korrels worden gebruikt om te bepalen of het recombinante eiwit in de cytoplasmatische regio van de bacteriecellen. Pellets kunnen in -80 ° C worden bewaard zonder het laden van kleurstof totdat het nodig is. Een controle bacteriecultuur die niet is getransformeerd of geïnduceerd kunnen worden behandeld als oplosbare ook voor vergelijking.
   2. Neem 1000 ul van cultuur en plaats in een 1,5 ml buis. Spin down op 13-15 xg gedurende 5 minuten.Giet de bovenstaande vloeistof en label "onoplosbaar."
      Opmerking: Onoplosbare pellets zal denaturatie procedures ondergaan hieronder om eiwitten in insluitingslichaampjes bacteriën cellen vrij te geven. Pellets kunnen worden opgeslagen in -80 ° C totdat het nodig is. Een controle bacteriecultuur die niet is getransformeerd of geïnduceerd kunnen worden behandeld als onoplosbaar en ter vergelijking.
      1. Resuspendeer de onoplosbare pellet in 200 ui BugBuster en reactie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
      2. Weer spin down monster bij 13-15 xg gedurende 5 minuten en neem 50 pl supernatant en voeg deze toe aan nieuwe "onoplosbaar" 1.5 ml buis.
      3. Voeg 50 pl ladingskleurstof deze nieuwe monster.
   3. Kook zowel oplosbare als onoplosbare monsters gedurende 5 min naar eiwitten voor SDS-PAGE-analyse denatureren.
   4. Laad elk monster in elektroforese gel met standaard ladder.
   5. Om te visualiseren het eiwit monsters gebruik een staining reagens en volg het protocol van het bedrijf.
   6. Bepaal of het eiwit uitdrukt in de oplosbare en / of onoplosbaar fracties door het vergelijken van deze twee rijstroken alsook het vergelijken van de rijstroken aan de oplosbare en onoplosbare rijstroken (zie toelichting 4.9.1 en 4.9.2) op de SDS-PAGE-gel (Figuur 2). Een donkere band verschijnt in het molecuulgewicht van het eiwit in de oplosbare of onoplosbare rijstroken. Dit bepaalt welke isolatieprocedure voor gebruik in protocol 6.
      Opmerking: Als er een band in beide gebieden dan ook afzonderlijk gebruikt protocol 6 hieronder kan worden uitgevoerd, of het eiwit kan worden geïsoleerd beide manieren om te bepalen welke isolatiemethode levert een hogere opbrengst van recombinant eiwit (Figuur 3) .
   7. Als een 4 uur en 's nachts inductie werd uitgevoerd, bepalen welke inductie methode de hoogste eiwitproductie voor de scale-up proces (figuur 2) heeft.

5. Scale-up procedure en Hoofd Cultuur

1. Bereid groeimedia met 85,7 g Terrific bouillon en 28,8 ml 50% glycerol in 1,8 L van ultrapuur water en autoclaaf op vloeibare cyclus gedurende 1 uur.
2. Start een overnachting cultuur uit ingevroren cel stock gemaakt in stap 4.5.
   Let op: Voorwaarden worden aseptisch gebeuren.
   1. Meng 20 ml LB en met een eindconcentratie van 100 ug ampicilline / ml in een steriele 125 ml Erlenmeyer kolf.
   2. Met behulp van een steriele applicator stok neem een sloop van getransformeerde E. coli-cellen en neerzetten applicator in de kolf. Verwijder de applicator stick en plug fles met schuim stop of katoen en dek af met aluminiumfolie om de steriliteit te behouden.
   3. Schud nacht bij 250 tpm bij 37 ° C.
3. Hoofd Cultuur
   Let op: Voorwaarden worden aseptisch gebeuren.
   1. Giet overnacht cultuur in 1,8 L van steriele groeimedia en voeg ampicilline bij 100 ug / ml en 6 tot 8 druppels steriel antischuimmiddel 204 met behulp van een Pasteur pipet.
   2. Plaats culturen in een 37 ° C waterbad met 0,2 mm gefilterde perslucht borrelen in culturen door beluchting stenen.
   3. Zodra de OD _{600 nm} 0,7-0,8 bereikt, induceren met IPTG (1 mM) en laat inductie optreedt voor of 4 uur bij 37 ° C of overnacht bij 18 ° C afhankelijk van oplosbare / onoplosbare resultaten van SDS-PAGE in stap 4.9.
4. Verzamelen E. coli Cellen
   1. Spin down de celcultuur in 1 L centrifuge flessen (2 flessen / cultuur) gedurende 15 minuten bij 14.000 xg bij 4 ° C.
   2. Giet supernatant en met behulp van een dunne spatel, schep de bacteriën pellet in twee buizen van 50 ml. De cellen kunnen opnieuw worden gepelleteerd door centrifugatie gedurende enkele minuten.
      Opmerking: Elke 1,8 L cultuur zal resulteren in twee bacteriën pellets, een in elke 50 ml centrifugebuis.
   3. WINKEL pellets -80 C tot eiwit isolatie.

6. Isolatie en zuivering van recombinant eiwit

Opmerking: Als het eiwit bevindt zich in de oplosbare regio op basis van SDS-PAGE-analyse uit stap 4.9 en vervolgens "Inheemse Isolation" zal worden gebruikt, maar voor onoplosbare eiwitten "niet-aangeboren Isolation" procedures zullen worden uitgevoerd.

1. Cell Lysis
   1. Nonnative
      1. Verwijder getransformeerde E. coli pellet van -80 ° C vriezer en voeg 20 ml Lysis / Wash Buffer (Tabel 1) aan elke centrifugebuis.
      2. Vortex en schud de bevroren pellet totdat het ontdooit en oplosbaar in de buffer-oplossing zonder grote brokken. Incubeer op nutator overnachten. De volgende morgen, moet de pellet nu een viskeuze suspensie door denaturering van het eiwit uit de buffer.
      3. Centrifugeer de suspensie bij 20.500 xg bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Breng het supernatant naar een nieuwe buis voor isolatie en de pellet gooi.
   2. Native
      1. Verkrijgen getransformeerde E. coli pellet van -80 ° C vriezer.
      2. Voeg Lysis Buffer (Tabel 1) om centrifugebuis tot een eindvolume van 30 ml te bereiken en los bevroren pellet door vortexen en rigoureus schudden. Plaats pellet op ijs.
      3. Was ultrasoonapparaat sonde met 70% ethanol bij 100% amplitude gedurende 1-2 minuten. Herhaal vervolgens met ultrapuur water.
      4. Sonicaat bacteriën pellet terwijl op ijs gedurende 5 minuten (totale verstreken tijd van 10 min).
         1. Stel sonicator op 30% amplitude met puls van 30 sec on/30 sec uit.
         2. Bob centrifugebuis op en neer tijdens sonicatie interval om volledig breken de cel pellet. Aan het einde van de totale verstreken tijd er mogen geen zichtbare pellet bacteriën waardoor een vezelig, viskeuze suspensie.
         3. Reinig de sonicator probe tussen verschillende eiwit isolatie en voor opslag via 70% ethanol en ultrazuiver water zoals beschreven in stap 6.1.2.3.
      5. Centrifugeer de suspensie bij 20.500 xg bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Breng het supernatant naar een nieuwe buis voor isolatie en de pellet gooi.
2. Ni-NTA affiniteit chromatografie
   1. Nonnative
      1. Voeg 1 ml ^{Ni2 +-NTA} harsoplossing elke centrifugebuis (2 ml hars totaal voor een 1,8 L cultuur) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur op nutator.
      2. Giet slurrie in affiniteit kolom en laat geen oplossing om helemaal doorheen druppelen kraan klep in afval beker.
      3. Voer 10 wassingen met 10 ml van Lyse / Wash Buffer voor elke wasbeurt.
         1. Voor de eerste twee wassen, voeg 10 ml aan de centrifugebuis extra hars te verwijderen en giet in kolom. De extra wassingen kan direct worden toegevoegd aan de kolom.
         2. Na elke wasbeurt, roer de hars met een glazen roerstaaf. Zodra de was druppelt in het afval beker, kan de volgende 10 ml worden toegevoegd.
      4. Na het wassen helemaal drips door, dicht kraan klep, verwijder afval beker en te vervangen door 50 ml centrifugebuis voor eiwit collectie.
      5. Voeg 15 ml Elutiebuffer (tabel 1) en roer-up hars, waardoor oplossing te zitten voor 5 minuten. Open kraan ventiel en verzamelen elutie. Herhaal met een extra 15 ml.
   2. Inlander
      1. Volg de nonnative Affinity Chromatography hierboven (Stappen 6.2.1.1-6.2.1.4) behalve pas de volgende parameters:
         1. Incubeer ^{Ni2 +-NTA} hars oplossing bij 4 ° C gedurende tenminste 1 uur op nutator.
         2. Gebruik de juiste Wash Buffer (tabel 1).
      2. Voeg 5 ml Elutiebuffer (tabel 1) en incubeer met hars gedurende 5 minuten.
         1. Open kraan klep en laat elueren tot het meeste oplossing door gedruppeld.
         2. Voeg 90 ul / putje van Bradford reagens 96-well plaat verwijderen. Na elke elutie mogelijk 10 gl zolutie te druppelen uit kolom in putje met 90 ul Bradford reagens.
         3. Blijven toevoegen 5 ml Elutiebuffer in een tijd totdat Bradford assay niet meer eiwit (kleur gaat van donker blauw naar licht blauw te ontruimen) detecteert. Dit duurt meestal 4-5 elutievolumes.
3. Dialyse / Renaturatie
   1. Maak nonnative (renaturering) en inheemse dialyse buffers (tabel 1) en bewaar in 4 ° C.
      Opmerking: De pH van de dialyse buffers worden bepaald door het doel eiwit iso-elektrisch punt (pI). Als vuistregel eiwitten ten minste een vol punt boven of onder hun pi-waarden moeten worden gebufferd.
   2. Transfer inheemse en niet-aangeboren eluties dialyse buis met geschikte molecuulgewichtgrenswaarde (25.000 MWCO voor NGF en 50.000 MWCO voor Sema3A). Plaats elke eiwitmonster in respectieve dialysebuffer 1 gedurende 4 uur bij 4 ° C en vervang de respectieve buffer 2 overnacht bij 4 ° C.
      Opmerking: Eiwit moet worden gedialyseerd in elke buffer gedurende ten minste 4 uur voor de juiste hervouwing en bufferuitwisseling plaatsvinden.
   3. Concentreer de gedialyseerd eiwit eluties tot minder dan 5 ml met een centrifuge draaien concentrators.
      Opmerking: Eiwitten kunnen verder worden gezuiverd door snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) en opnieuw geconcentreerd.
4. Bepaal eiwitconcentratie (mg / ml) door vriesdrogen 10-50 ml monster in een vooraf gewogen microcentrifugebuis.
   1. Optioneel: bepalen extinctiecoëfficiënt ε zodat eiwitconcentratie kan voortaan isolaties worden bepaald door de absorptie van een monster bij 280 nm met behulp Law Beer-Lambert: c = A _280nm / εl, waarbij L de weglengte.

7. Biotinylering van gezuiverde eiwit

1. Dialyze eiwitten in 10.000 MWCO dialyse cassettes against 10 mM Tris (pH = 8,0), het veranderen van de buffer om de 4 uur met een totaal van 6 veranderingen.
2. Breng de recombinante eiwitten (nu in 10 mM Tris-buffer) tot 2 ml micro-centrifugebuis voor biotinylering.
3. Biotinyleren eiwitten met een biotine ligase proteïne kit.
4. Dialyseer eiwitten tegen PBS (pH = 7,4) met 10.000 MWCO dialyse cassettes met 3 buffer verandert per dag gedurende 2 dagen.
5. Bepaal het percentage biotinylering van eiwitten met een kwantificeringskit.
6. Bepaal de concentratie weer zoals beschreven in 6.4 en bewaar bij 4 ° C of monster en bewaar bij -20 ° C voor lange termijn opslag.

Resultaten

Klonen en Test Expression

Wanneer plating behoren wordt uitgevoerd, moet enkele geïsoleerde kolonies te vormen om de kansen van plukken klonale getransformeerde bacteriecellen (Figuur 2A) verhogen. Echter, als er te veel cellen zijn bedekt, platen te lang geïncubeerd bij 37 ° C of transformatie is twijfelachtig, kolonies kan de agar plaat te dekken of te vormen grotere aggregaten van cellen (fig. 2B en 2C). Tijdens tes...

Discussie

Recombinant eiwit-engineering is een zeer krachtige techniek die vele disciplines overspant. Het is kosteneffectief, afstembare en een relatief eenvoudige procedure, waardoor de productie van hoge opbrengsten van op maat gemaakte eiwitten. Het is belangrijk op te merken dat het ontwerpen en expressie doeleiwitten is niet altijd eenvoudig. Basale expressie en recombinant proteïne stabiliteit afhankelijk van specifieke keuzen van vector, E. coli celstammen, peptide tag aanvullingen en teelt parameters. Onze speci...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol	Chem-Impex International	642	250 ml
Azijnzuur, glashelder	EMD	AX0073-9	2,5 L
Agar	Bioshop	AGR001.500	500 g
Ampicillin natriumzout	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
Antifoam 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	1 ml; Expressiegastheer
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
Gel filtratie standaard	Bio-Rad	151-1901	6 flacons
Glycerol	Bioshop	GLY001.1	1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride	Chem-Impex International	152	1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88222	100 ml
Zoutzuur	EMD	HX0603-3	2,5 L
Imidazool	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli monster buffer	Bio-Rad	161-0737	30 ml
Laurylsulfaat natriumzout, Natriumdodecyloppervlak	Chem-Impex International	270	500 g
LB Broth	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Competent Cells	Novagen	69825	1 ml; Kloning gastheer
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 verpakkingen
Kaliumchloride	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
Natriumhydroxide	Fisher Scientific	S318-500	500 g
Natriumfosfaat dibasisch	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
Natriumfosfaat monobasisch	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Broth	Bioshop	TER409.5	5 kg
Tetracycline hydrochloride	Chem-Impex International	667	25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Trypton, pancreatisch	EMD	1.07213.1000	1 kg
Gistextract, gegranuleerd	EMD	1.03753.0500	500 g
ÄKTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	Inclusief kits en accessoires
Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	Enzym wordt geleverd met reactiebuffers en biotin-oplossing
Dialysis Casette	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysisbuis	Spectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: 25.000 en 50.000
Flow Diversion Valve FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit	Invitrogen	1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
Fraction Collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	Inclusief kits en accessoires
Verwarmde/gekoelde circulator	VWR	13271-102	Model 1156D
Verwarmingskast FD Series	Binder		Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	Uit productie--Vervangende product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge	Beckman Coulter	393126
JA 25.50 Rotor	Beckman Coulter	363055
JLA 8.1 Rotor	Beckman Coulter	969329	Inclusief 1 L polypropyleenflessen
JS 5.3 Rotor	Beckman Coulter	368690
Laminairstroomkap	Themo Scientific	1849	Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4-gel vertical elektroforesesysteem
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels	Bio-Rad	456-9036	Elke kDa, 15-well kam
Ni-NTA Column	Bio-Rad	737-2512	49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit	Omega Bio-Tek	D6943-01
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
Buisjes met ronde bodem Polypropyleen Copolymer	VWR	3119-0050	50 ml buisjes voor JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators	Corning	431488, 431483	20 en 6 ml; MWCO: 10.000 Da
Subcloning Service	GenScript USA Inc.		Eiwitservices