Methodenartikel

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

15.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51298

⸱

4 juni 2014

 , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Departments of Neurobiology and Cell Biology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Samenvatting

Hoewel korte duur, mitose is een complexe en dynamische meerstapsproces fundamenteel belang voor de ontwikkeling van organen zoals de hersenen. In de ontwikkeling van cerebrale cortex, kan abnormale celdeling van neurale voorlopercellen defecten veroorzaken in de hersenen omvang en functie. Daarom is er dringend behoefte aan tools om de mechanismen van neurale voorlopercellen mitose begrijpen. De corticale ontwikkeling bij knaagdieren is een uitstekend model voor het bestuderen van dit proces. Neurale voorlopercellen mitose wordt vaak in vaste hersenen secties onderzocht. Dit protocol zal in detail beschrijven een aanpak voor live-beeldvorming van mitose in ex vivo embryonale hersenen plakjes. We zullen de kritische stappen beschrijven voor deze procedure, waaronder: hersenen extractie, hersenen inbedding, vibratome snijden van de hersenen plakjes, kleuring en kweken van plakjes, en time-lapse imaging. Wij zullen dan laten zien en beschrijf in detail hoe na de overname analyse van mitose te voeren. We zijn onder andere representatieve resultaten frOM deze test met de vitale kleurstof Syto11 transgene muizen (histon H2B-EGFP en Centrin-EGFP) en in utero elektroporatie (mCherry-α-tubuline). We zullen bespreken hoe deze procedure het beste kan worden geoptimaliseerd en hoe het kan worden aangepast voor onderzoek naar genetische regulatie van de mitose. Live-beeldvorming van mitose in de hersenen plakjes is een flexibele benadering van de invloed van leeftijd, anatomie, en genetische verstoring in een gecontroleerde omgeving te beoordelen, en een grote hoeveelheid gegevens met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie te genereren. Vandaar dit protocol zal de bestaande instrumenten voor de analyse van neurale voorlopercellen mitose.

Inleiding

De algemene doelstelling van dit protocol is om te beschrijven hoe om live beeldvorming van neurale voorlopercellen mitose presteren in embryonale hersenen plakjes. Met behulp van live beeldvorming van de hersenen plakjes in de cultuur, dit protocol voorziet in een eenvoudige methode om meerdere aspecten van de mitose assay in neurale voorlopercellen in een omgeving die sterk lijkt op een in vivo setting. Het kan worden toegepast op hersenen van mutante dieren en / of hersenen die zijn gemanipuleerd met in utero elektroporatie) 1-5. Deze techniek is ook ideaal om het effect van farmacologische middelen op mitose neurale precursoren te testen, door eenvoudig toevoegen van een middel aan het kweekmedium. Kortom, zal dit artikel een technisch uitdagende protocol toegankelijk voor diegenen studeren neurogenese te maken.

Tijdens neurogenese onderscheiden neurale populaties ondergaan nauwkeurig divisies neuronen die uiteindelijk bijdragen aan de zes corticale lagen van de volwassen neocortex 6-8 genereren. Vroeg in de corticale ontwikkeling, de neurale voorloper zwembad uitzet als neuro (NE) cellen delen symmetrisch om zichzelf te vernieuwen. NE cellen vervolgens omzetten in radiale gliacellen (RGC). Aanvankelijk RGC verdelen symmetrisch twee nieuwe RGC produceren, maar tijdens het grootste deel van neurogenese, belangrijkste wijze van verdeling RGC 'is asymmetrisch. In asymmetrische verdeling, 1 RGC ontstaat een nieuwe RGC en ofwel een post-mitotische neuron, of een meer gespecialiseerde voorlopercellen (een korte neurale precursor (SNP), een buitenste radiale glia (ORG), of een tussenproduct progenitor (INP) 2,3,7,9. INPS SNPs en ORGs kan vervolgens genereren neuronen in het sub-ventriculaire, ventriculaire en basale gebieden van de cortex, respectievelijk. Daarom celdeling voorlopercellen is een fundamenteel proces voor het genereren van neuronen van de neocortex.

Talrijke studies wijzen op een verband tussen specifieke mitotische trekken van RGC en het lot van dochtercellen. Haydar et al.. En Takahashi et al..hebben aangetoond dat de RGC mitotische duur en lengte van de celcyclus toename als neurogenese opbrengst, een bevinding weerklinkt in de follow-up studies 10-13. Een aantal studies hebben gesuggereerd dat mitotische spindel oriëntatie ten opzichte van het ventrikel beïnvloedt aspecten van neurogenese en corticogenesis, met inbegrip van soorten neuronen gegenereerd en de locatie van nakomelingen in de hersenen, respectievelijk 3,10,14-16. Of splijtenvliegtuig oriëntatie beïnvloedt direct cellot is controversieel, maar de conclusie blijft dat deze mitotische parameter gevolgen neurogenese. Verder benadrukken van het belang van mitose is de constatering dat vele genen betrokken bij de mechanica van mitose zijn cruciaal voor neurogenese en voor een goede ontwikkeling van de hersenen 17-20.

Mitose is een dynamisch proces, maar tot op heden de meeste onderzoeken waarin progenitorceltransplanten mitose gebruiken analyse van vaste weefselsecties of beeldvorming van neurale voorlopercellen via in vitro celkweek. Dus de reguliere methoden mitose evalueren slechts een momentopname van dit proces en niet te ontdekken hoe cellen zich in een weefsel. Live-beeldvorming van neurale voorlopercellen mitose is steeds meer een instrument van cruciaal belang voor het begrijpen van neurale voorlopercellen functie. Voor voorbeelden zie deze referenties 4,8,10,21-25. Diverse openstaande protocollen zijn gepubliceerd voor de voorbereiding en beeldvorming van de hersenen plakjes 26,27. Maar tot op heden heeft een uitgebreid protocol voor beeldvorming en analyse van de mitose niet beschreven noch aangetoond in video.

Deze techniek biedt een aantal belangrijke voordelen boven vaste analyse van hersencoupes. Time-lapse analyse van de hersenen plakjes schakelt het maken van aanzienlijk meer datapunten die op een flexibele manier kan worden geanalyseerd. Eerst worden gegevens verzameld op afzonderlijke tijdstippen in de loop van enkele minuten of enkele uren. Men kan sommige tijdstippen (om een ​​statische montage te maken) of analyserenkunnen verschillende tijdstippen te combineren in films. Ten tweede, confocale beeldvorming van plakjes schakelt het maken van de gegevens op verschillende Z-profielen in de hersenen plakjes. Hierdoor kunnen afzonderlijke secties worden geanalyseerd. Alternatief kan stapels individuele secties worden gecombineerd tot een maximale intensiteit projectie. Ten derde wordt de analyse uitgevoerd in de context van een weefsel, onthullen hoe cellen verdelen ten opzichte van naburige cellen en structuren. Ten vierde is het ideaal geschikt voor analyse van mutanten dat enige mitotische afwijkingen vertonen. Samen dit protocol zal helpen verduidelijken kritische stappen aan onderzoekers die wensen om live beeldvorming van neurale voorlopercellen mitose voeren in hun eigen laboratoria te helpen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van media (fig. 1, stap 1)

  1. Slice Cultuur Medium
    1. 25 ml slice kweekmedium is voldoende om 5 glazen bodem gerechten te bereiden met 2 sneetjes per putje.
    2. In een 50 ml conische buis, voeg 250 ul van een 100x N2-oplossing en 500 ui 50x B27 oplossing zonder vitamine A. DMEM/F12 Naar een volume van 22,5 ml.
    3. Filter steriliseren oplossing en vervolgens voeg 1,25 ml hitte geïnactiveerd paard serum en 1,25 ml foetaal bovine serum.
    4. Incubeer oplossing in een waterbad bij 37 ° C gedurende de duur van het preparaat van de segmenten.
    5. Voeg groeifactoren (FGF en EGF, eindconcentratie van 10 ng / ml en 20 ng / ml) onmiddellijk vóór het begin van de cultuur. De samenstelling van dit medium is geoptimaliseerd om de overleving van cellen in cultuur te bevorderen en om de proliferatie tarief van neurale voorlopercellen te verhogen. Dit zal dus de maximale waarschijnlijkheidobserveren mitotische cellen in de slice.
  2. Volledige HBSS Dissection Solution
    1. Bereid 500 ml volledig HBSS door toevoeging van 50 ml van 10x HBSS, 1,25 ml 1 M Hepes (pH 7,4, 2,5 mM FC), 6 ml 2,5 M D-glucose (FC 30 mM), 2,2 ml 0,9 M NaHCO3 (FC 4 mM) en geautoclaveerd DiH 2 O om uiteindelijk volume van 500 ml.
    2. Filter steriliseer oplossing en bewaar bij 4 ° C tot de verzameling baarmoederhoorns van de zwangere muis. Deze oplossing is bij 4 ° C worden bewaard weken.
    3. Houd HBSS op ijs gedurende de hele dissectie procedure.
  3. Inbedding oplossing
    1. Voor de inbedding van 4 embryonale hersenen, bereiden 30 ml 3% laag smeltpunt agarose in de volledige HBSS oplossing. In een 50 ml conische buis, voeg 0,9 g laag smeltpunt agarose en volledige HBSS tot 30 ml.
    2. Meng de oplossing met een vortex mixer, en smelten in een magnetron met de buis staan ​​en de kap open.
    3. Terwijl in de magnetron, bewaken de oplossing pRevent overloop als gevolg van overmatige koken. Bij het koken begint, stopt de magnetron en vortex de oplossing.
    4. Herhaal deze stappen totdat alle agarose is gesmolten.
    5. Bewaar de buis in een waterbad bij 42 ° C.

2. Ontrafeling van het embryo (Figuur 1, stap 2)

  1. Na zorgvuldige euthanasie van de zwangere muis, verzamel de baarmoeder horens en breng ze in een 10 cm 2 petrischaal met koud vol 1x HBSS. De leeftijd van het embryo kan variëren afhankelijk van de studie. Dit protocol is met succes gebruikt voor het kweken hersenenplakken uit embryonale dag E12.5 tot E17.5. Door hun grootte, jongere hersenen zijn vaak moeilijk te bewerken zijn.
  2. Verzamelen van de embryo's en ontleden de embryonale hersenen zoals eerder beschreven in de rat en de muis 26,27, totdat een volledige embryonale hersenen zoals de achterhersenen en de voorhersenen met de twee hersenhelften wordt verkregen. Deze kunnenbewaard bij kamertemperatuur totdat alle hersenen werden ontleed.
  3. Verzamelen van de embryo's en ontleden de embryonale hersenen zoals eerder beschreven in de rat en de muis 26,27, totdat een volledige embryonale hersenen zoals de achterhersenen en de voorhersenen met de twee hersenhelften wordt verkregen. Deze kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard totdat alle hersenen zijn ontleed.

3. Inbedding van de embryonale hersenen (Figuur 1, Stap 3)

  1. In een emmer met ijs, maak een gat in het ijs om de inbedding mallen te voegen in.
  2. Giet de 3% agarose medium in een plastic mal en plaats die schimmel in het bereid in het wak.
  3. Roer de agarose medium met de punt van een digitale thermometer totdat de temperatuur 35 ° C.
  4. Onmiddellijk de hersenen overbrengen naar de inbedding medium.
  5. Kritische Stap: Om de overtollige HBSS te verwijderen op het grensvlak tussen de hersenen en de agarose, zorgvuldig en tuimelen zachtjes / draai de hersenen herhaaldelijkde inbedding oplossing met de tang.
  6. Een kussen van gegeleerd agarose wordt op de bodem van de vorm te vormen in contact met het ijs. Wanneer het kussen kan worden gevoeld met de punt van de tang onder roeren de hersenen, plaats de hersenen met de dorsale zijde naar boven. De hersenen niet zinken naar de bodem van de mal.

4. Bereiding van Agarose blok (fig. 1, stap 4)

  1. Laat de agarose uitharden in ijs gedurende ten minste 5 minuten.
  2. Met behulp van een scheermesje, deel de hoeken van de mal.
  3. Carve zorgvuldig een agarose blok rond de hersenen met behulp van een scheermesje. Probeer het aantal bezuinigingen te beperken om te voorkomen verstoren de embedded hersenen.
  4. Zorg ervoor dat het blok een groter oppervlak in het caudale deel van de hersenen (versus het rostrale gebied, zie Figuur 1, stap 4) om de stabiliteit van het blok aan het snijden voetstuk verhogen.
  5. De laatste snede moet de een aan de caudale zijde van de hersenen;deze verlaging wordt de juiste snijden vlak te definiëren met de vibratome.
  6. Doe dit door aanpassing het blad loodrecht op de rostro-caudale as van de hersenen en de agarose blok. Schuif naar beneden het mes caudaal langs de rostro-caudale as en maken de final cut ongeveer 5 mm van de meest caudale regio van de hersenen.
  7. Stel de agarose / hersenen blok opzij en herhaal inbedding van andere hersenen.

5. Overdracht van de Embedded Brains in de lade van de Vibratome (Figuur 1, stap 5)

  1. Voeg een druppel lijm op de bodem van de lade vibratome. Plaats lijm zodat de agarose blokken worden geplaatst binnen het bereik van het trillende blad.
  2. Plaats de agarose / hersenen blok caudale kant naar beneden op de rand van de spatel, met ongeveer 50% van het blok kantelen over de rand van de spatel.
  3. Breng de caudale zijde van de agarose blok om de lijm en schuif de spatel verwijderd, handhaven de agarose blok aan de bodem van de lade met de sHoulder van een pincet. Laat niet de spatel rechtstreeks contact opnemen met de lijm.
  4. Laat de lijm stollen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.

6. Opdeling van de Embedded Brains (Figuur 1, stap 6)

  1. Vul het vibratome lade met HBSS.
  2. Definieer de start en finish posities van de vibratome mes.
  3. Genereer 200 - 250 micrometer plakjes. Met de VT1000s vibratome, gebruikt u de volgende parameters: snelheid 2-4, frequentie 8.
  4. Haal de plakjes uit de vibratome als ze zijn gesneden. Breng de plakjes met een spatel en de achterkant pincet in 12 putjes gevuld vol HBSS. Alternatief sommige onderzoekers hebben een penseel gebruikt in plaats van een pincet Kernpunt:. Tijdens de overdracht, zorg dat de hersenen plakjes blijven gehecht aan de omliggende agarose.

7. Syto11 kleuring van de Slices (Figuur 1, Stap 7)

  1. Verdun Syto11 een eindconcentratie van0,5-1 uM in de slice kweekmedium aangevuld met groeifactoren.
  2. In het putje van een 12-well plaat, incubeer plakjes ve hersenen in 2,5 ml kleuroplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  3. Was de plakjes in 2,5 ml slice kweekmedium zonder kleuring oplossing gedurende 20 minuten.

8. Montage van de plakjes in een glazen bodem Dish (Figuur 1, stap 8, 9)

  1. Bereid 15 ul van het inbedden van collageen oplossing per schijfje. Bereid een 1,5 mg / ml collageen oplossing door het mengen van 375 ui van 3 mg / ml collageen type I-oplossing met 75 ui 10X DMEM, 9,4 gl 1 M NaOH en 290 ui H2O Slaan op ijs.
  2. Plaats een 15 ul druppel van de collageenoplossing onderin een 35 mm glazen bodem Microwell schotel. Spreid het met een pipet om de grootte van het segment passen.
  3. Breng de sneetje in de daling van collageen met een spatel en pincet Kernpunt:. Montage meerdere segmenten in verschillenent gerechten verhoogt de kans op sneetjes geschikt voor de beeldvorming te verwerven. Scherm door middel van verschillende segmenten en kies degene die het beste voldoen aan de hieronder in de sectie "Representatieve resultaten" beschreven criteria.
  4. Laat de plakjes incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten alvorens ze in een 37 ° C incubator met 5% CO2.
  5. Na 20 minuten, voeg 1,2 ml slice kweekmedium in de glazen bodem Microwell Schotel. Voeg 600 ul van medium tegelijk en verdeel het met een pipetpunt.
  6. Leg een lage vergroting van de hersenen slice om de anatomische niveau en de integriteit van de slice te nemen.

9. Live-Imaging van de Slices (Figuur 1, stap 10, 11)

  1. Laat de plakjes terug in de incubator gedurende ten minste 1 uur en 30 min bij 37 ° C met 5% CO 2 voor levende beeldvorming.
  2. Afbeelding van de plakjes met de microscoop van keuze, in gedachten houden dat Syto11 is zeer gevoelig voor fotobleken. Hier een inverted spinning disk confocale microscoop wordt gebruikt (Andor XD revolutie draaiende schijf confocale microscoop). Alternatief laserscanning confocale microscoop kan worden gebruikt. De volgende parameters zijn voor de draaiende schijf microscoop set-up.
  3. Gedurende de gehele levende opnamesessie handhaven segmenten bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubatiekamer aan de microscoop.
  4. Afbeeldingscellen met een 60X objectief siliconenolie met een werkafstand van 300 urn en een numerieke apertuur van 1,3 (voor voorbeelden zie figuren 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Een 100x olie objectief met een werkafstand van 130 pm en een numerieke apertuur van 1,4 (zie bijvoorbeeld figuur 4C) kunnen ook worden gebruikt. De resolutie van de camera is 512 x 512.
  5. Beeld de cellen in een 30 urn z-stack, met het midden van de z-stack op ongeveer 40 urn onder het oppervlak van het segment. Proberen om foto dieper in het weefsel kan de doelstelling om toe te voegenmechanische druk op de slice. Dit kan de integriteit van de hersenen slice beïnvloeden. Als u van plan om 3D-reconstructies van de cellen te maken, gebruikt u een z-interval van niet meer dan 2 micrometer.
  6. Pas het laservermogen en de blootstelling keer om fotobleken beperken. Gebruik belichtingstijden variërend 30-200 msec, afhankelijk van de intensiteit van het signaal Syto11.
  7. Met een gemotoriseerde podium, afbeelding meerdere posities in meerdere segmenten gemonteerd in 1 gerecht. Bijvoorbeeld, afbeelding maximaal 20 posities verspreid over 4 verschillende segmenten in 1 gerecht.
  8. Voor levende beeldvorming gebruikt een tijdsresolutie van minder dan 5 minuten om de identificatie van de verschillende fasen van mitose mogelijk. Met Syto11 en / of histon H2B-EGFP, 4 - 5 uur live beeldvorming voldoende om een ​​aanzienlijk aantal mitotische cellen te observeren. Indien beeldvorming dun gelabelde mitotische cellen (zoals bereikt in utero elektroporatie), dan is een langere afbeelden parameter (overnacht) geschikt en werken well.
    Opmerking: Het gebruik van dit protocol, hebben we meestal te observeren op gemiddeld 10 mitotische cellen per positie. Zoals hierboven vermeld, weergave meerdere gemonteerde segmenten verhoogt de kans op een succesvolle experiment. Met deze aanpak meestal we mitotische cellen te identificeren in vrijwel alle experimenten uitgevoerd met Syto11 of histon H2B-EGFP.

10. Na verwerving Analyse van Mitose (figuur 2)

Alle procedures in dit hoofdstuk zijn geoptimaliseerd in Fiji (ImageJ), hetgeen voordelig is omdat het is een gratis open source software. Andere software-oplossingen beschikbaar zijn om dezelfde taken, zoals Metamorph, Imaris en Amira voeren.

  1. Identificatie van Mitotische figuren in Fiji
    1. Na het openen van de dataset voor een positie als een "HyperStack", selecteert u een z-vlak (zie figuur 2A voor de locatie van de schuifbalk) waar het weefsel en cellen zien er gezond uit (zie criteria in de discussie sectie).Scroll over de tijdsdimensie aan cellen gaan door anaphase identificeren, want het is de gemakkelijkste mitotische fase te identificeren.
    2. Blader terug in de tijd naar het tijdstip waar de cel binnenkomt mitose (DNA condensatie) te identificeren. De cel kan bewegen over z-vlakken, maar de temporele resolutie en de z-stack parameters eerder beschreven zijn geoptimaliseerd voor dit proces.
    3. In een spreadsheet, noteer de 4D-coördinaten van de cel in de HyperStack (X, Y, Z en tijd, zie figuur 2A om de locatie van deze cijfers te visualiseren op de Fiji-interface) als het mitose binnenkomt. Weten deze coördinaten voorkomen herhaaldelijk rekenen dezelfde cel.
    4. Ga vooruit in de tijd en noteer het tijdstip waarop de cel vordert van de ene fase naar de andere. Noteer de duur van elke mitotische fase een bepaalde cel.
    5. Ga verder met andere cellen, over de volle dataset (meerdere cellen binnen en tussen posities).
  2. 3D Reconstruction van de Cellen en kwantificering van Rotation Tijdens Metafase (Aangepast uit Haydar et al., 2003) (Figuur 2B).
    1. Na meerdere mitotische cellen te hebben geïdentificeerd, gebruikt u de coördinaten van een cel en ga vooruit in de tijd tot het begin van de metafase.
    2. Draai het hele "HyperStack", zodat de ventriculaire grens vlak is (met behulp van de "Beeld / Transform / Rotate ..." commando). Gebruik de "hoek" tool om de hoek te bepalen toe te passen voor deze rotatie.
    3. Identificeer de z-vlak waar de cel van belang is de meest zichtbare. In dat vliegtuig, de "rechthoek selectie" tool om een ​​selectie die de gehele cel omvat trekken.
    4. Identificeer de z-vliegtuigen die de cel in de omgeving zijn. Gebruik de "Beeld / Duplicate" commando om een ​​"sub-stack 'te creëren. In het dialoogvenster te verlaten "Duplicate HyperStack" aangevinkt. De "Plakken (z)" parameter komt overeen met de z-vlakken zoals de hele cell, en de "Frames (t)" parameter komt overeen met het huidige tijdstip.
    5. Als de resolutie slecht is, de grootte van de "sub-stack" met de "Afbeelding / Aanpassen / maat ..." commando.
    6. Genereer een 3D-reconstructie van de cel op het huidige tijdstip met behulp van de "Image/Stacks/3D project ..." commando. De parameters voor deze opdracht worden weergegeven in Figuur 2B. De "afstand Slice" correspondeert met het interval tussen elk van de z-vlak afbeeldingen (um). Belangrijk: zorg ervoor dat de fysieke dimensie (um) van de sub-stack is bewaard gebleven. Zo niet, dan zal de interpolatie van de pixels in de z-dimensie onjuist, en de 3D-reconstructie zal onnauwkeurig zijn.
    7. Met behulp van de schuifbalk, draai de resulterende 3D-reconstructie, zodat de rand van de metafaseplaat zichtbaar is. Het nummer van het frame overeenkomt met de hoek beta in figuur 3B beschreven, nemen dit nummer. Gebruikde "hoek" tool en de "Analyze / Maatregel ..." commando, meet de hoek tussen de horizontale en een lijn halverend de metafaseplaat loodrecht (Figuur 2B). Dit is de hoek alfa.
    8. Noteer deze hoeken voor de metafase tijdstippen van de cel van belang. De hoekverdraaiing tussen tijdstippen (t) en (t-1) gelijk aan de absolute waarde van het verschil tussen een hoek (t) en deze hoek (t-1).
  3. Het meten van de Oriëntatie van de Decollete Plane
    1. 3D reconstructie van een cel van belang op een tijdstip tijdens anafase volgens de instructies beschreven voor de 3D-reconstructie van metafase platen.
    2. Draai de reconstructie tot de randen van de twee platen gevormd door de scheiding van chromosomen zijn zichtbaar.
    3. Gebruik de hoek hulpmiddel om de hoek tussen de horizontale (de ventriculaire kant) en een lijn evenwijdig aan de twee platen gevormd door de scheiding van chromosomen meten. Dit is de hoek van de splitsing vlak (figuur 2C).
  4. Generatie van Movies
    1. Aangezien de cellen beweging vaak in verschillende z-vlakken, identificeren de z-vlakken bezet door de cel tijdens de live opnamesessie. Genereer een "maximale intensiteit projectie" van deze z-vliegtuigen met behulp van het "Beeld / Stacks / Z-project ..." commando. Sla de resulterende stapel als een "TIF." Bestand.
    2. Open dit bestand in de 1.45 versie van ImageJ als Fiji bevat geen stabiel plugin voor de generatie van ". Mov" of ". Avi" bestanden.
    3. Gebruik de "Bestand / Opslaan als / ..." commando van ImageJ naar een film in een formaat dat compatibel is met uw downstream-toepassingen te genereren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het succes van deze test en de observatie van meerdere mitotische cellen tijdens een live-imaging sessie grotendeels afhangen van zowel de integriteit en anatomische niveau van het segment waar overnames worden gemaakt. Zoals hieronder besproken, de anatomische niveau van een segment is een belangrijke factor. Figuur 3A toont rostro-caudale en mediale-laterale locaties waar wij het ​​meest succesvol zijn geweest. Voor meer discussie over dit onderwerp zie Noctor 26. De integriteit van het sch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het grote voordeel van het protocol we hebben beschreven dat het een dynamische temporele resolutie van mitose van neurale voorlopercellen. Gewoonlijk assays mitose visualiseren in de ontwikkelende hersenen worden uitgevoerd met behulp van immunofluorescentie vaste weefselsecties. Maar deze aanpak geeft slechts een momentopname van de mitose op een tijdstip.

Er zijn verschillende stappen die het meest essentieel voor het afbeelden van mitose in hersenenplakken: 1) De hersenen plakjes moet bl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen financiering van NINDS / NIH, R00-NS064197 en NINDS / NIH, R01NS083897 (zowel voor DLS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100X N2Life technologies17502048voor kweekmedium
50X B27 zonder vitamine ALife technologies12587010voor kweekmedium
DMEM/F12Life technologies11320033voor kweekmedium
Heat-inactivated paardenserumSigma AldrichH1138-500mlvoor kweekmedium
Heat-inactivated calf serumSigma AldrichF4135-500MLvoor kweekmedium
FGFR&D Sytems3139-FB-025voor kweekmedium
EGFvoor kweekmedium
10X HBSSLife technologies14065-056voor het dissekeren van de embryo's
Hepes Free AcidSigma AldrichH4034verdun tot 1 M (pH 7.4)
2.5 M D-GlucoseSigma AldrichG8769voor het dissekeren van de embryo's
0.9 M NaHCO3Life technologies25080-094voor het dissekeren van de embryo's
Low-melting agaroseFisherBP165-25voor het genereren van plakjes
Syto11Life technologiesS7573Maak 5µl aliquots
3 mg/ml collageen type ILife technologiesA1048301voor het kweken van plakjes
Glasbodem schotelMatTekP35G-1.5-14-Cvoor het kweken van plakjes
Petrischalenvoor dissectie van de embryo's
Digitaal thermometerom de temperatuur van de agarose te meten
Spatelom hersenen over te brengen
Verfkwastalternatief om hersenen over te brengen
VibratomeLeicaVT1000svoor het genereren van plakjes
Dissectiemicroscoopdissectie van embryo's
BeeldvormingsmicroscoopEen confocale microscoop is vereist, deze moet zijn uitgerust met een incubatiekamer

Referenties

  1. Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
  2. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
  3. Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
  4. LoTurco, J. J., Manent, J. -B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
  6. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
  7. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
  8. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
  9. Wang, X., Tsai, J. -W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
  10. Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
  11. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
  12. Pilaz, L. -J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
  13. Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
  14. LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
  15. Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
  16. Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
  17. Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
  18. Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
  19. Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
  20. Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
  21. Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
  22. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
  23. Hu, D. J. -K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
  24. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
  25. Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
  26. Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
  27. Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  28. Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
  29. Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
  30. Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
  31. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  32. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  33. Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
  34. Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
  35. Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitoseanalysepreparatie van hersendoorsnedenvibratoom sectietime lapse microscopieSyto11 kleuringHistone H2B EGFPCentrin EGFPin utero elektroporatie

Gerelateerde artikelen