Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility

Summary

Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.

Abstract

Elektrische Cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS) is een in vitro impedantie meetsysteem om het gedrag van cellen in hechtende kwantificeren cellagen. Daartoe worden cellen gekweekt in speciale kweek kamers boven tegenoverliggende cirkelvormige gouden elektroden. Een constante kleine wisselspanning wordt aangelegd tussen de elektroden en de spanning over gemeten. De isolerende eigenschappen van de celmembraan account weerstand tegen de elektrische stroom resulteert in een verhoogd elektrisch potentiaal tussen de elektroden. Meten cellulaire impedantie deze wijze kan de geautomatiseerde studie van celhechting, groei, morfologie, functie en motiliteit. Hoewel de ECIS meting zelf is eenvoudig en makkelijk te leren, de onderliggende theorie is complex en selectie van de juiste instellingen en correcte analyse en interpretatie van de gegevens is niet vanzelfsprekend. Toch een duidelijk protocol beschrijft de verschillende stappen van de experimenteleontwerp tot voorbereiding, uitvoering en analyse van het experiment niet beschikbaar. In dit artikel de basis meetprincipe evenals mogelijke toepassingen, worden experimentele overwegingen, voordelen en beperkingen van het ECIS systeem besproken. Een handleiding wordt voor de studie van celhechting, spreiding en proliferatie, kwantificering van celgedrag in een confluente laag, wat barrièrefunctie celbeweeglijkheid, kwaliteit van cel-cel en cel-substraat adhesie, en kwantificering van wondgenezing en cellulaire reacties op vasoactieve stimuli. Representatieve resultaten worden besproken gebaseerd op menselijke microvasculaire (MVEC) en humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC), maar gelden voor alle hechtende groeiende cellen.

Introduction

ΩΩΩHere presenteren wij Electric Cell-substraat Impedantie Sensing, bekend als ECIS, een specifieke methode voor het meten en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen in cultuur ^1. Het doel van dit protocol is een algemeen toepasbaar gids voor het gebruik van dit soort impedantie gebaseerde cellulaire assays bieden en protocollen voor enkele van de belangrijkste functies van het steeds toenemend aantal toepassingen. De nadruk zal liggen op de studie van cel-proliferatie, barrièrefunctie, cel contacten, en cel beweeglijkheid.

Aangezien ECIS en de bijbehorende model de impedantie spectroscopie gegevens te transformeren in biologisch relevante parameters in zijn huidige vorm werd geïntroduceerd in de wetenschappelijke gemeenschap door Giaever en Keese in 1991 ^2, is het vaak aangeduid als een systeem voor het meten van TEER (trans -epitheliale elektrische weerstand), die niet juist. De verschillen lijken marginaal op het eerste, maarzijn belangrijk voor de interpretatie van gegevens. Voor klassieke TEER metingen worden cellen gekweekt op permeabele filters om paracellulaire transportmechanismen die worden gedomineerd door epitheliale of endotheliale tight junctions contactplaatsen ³ karakteriseren. Gewoonlijk twee elektroden geplaatst boven en onder het filter worden gebruikt om een gelijkstroom (DC) stroom via cellaag en twee andere elektroden met de resulterende spanningsval ⁴ meten toepassing. De elektrische weerstand wordt berekend met de wet van Ohm, die een numerieke beschrijving van de kwaliteit van de cel barrière toelaat.

ECIS volgt dit basisprincipe en breidt deze uit. In het ECIS systeem worden cellen gekweekt op tegenover, cirkel gouden elektroden die zijn ingebed in de bodem van speciale celcultuurschalen. Het aantal elektroden per kweekputje is variabel, afhankelijk van de toepassing en de elektroden een standaard diameter van 250 urn, in sommige gevallen groter tegenelektrodewordt gebruikt om het circuit te voltooien. ECIS gebruikt een constante wisselstroom (AC) van 1 pA met een bepaalde frequentie in plaats van een gelijkstroom. De impedantie wordt berekend uit de overeenkomstige wijzigingen in de spanning (in mV) tussen de elektroden. ECIS biedt de mogelijkheid om de impedantie over een bereik van frequenties frequentie afhankelijke cellulaire eigenschappen, die verschillende voordelen biedt boven TEER zal nader worden toegelicht in dit artikel gaan meten. Eerst meten complexe impedantie kan scheiden van de totale impedantie in cel barrière weerstand en cel capaciteit. Bovendien, door het nemen van gegevens op meerdere frequenties en toepassing van een wiskundig model, kan men onderscheid tussen junctionele impedantie (dichtheid van cel-cel contacten) en impedantie veroorzaakt door cel-substraat interacties (afstand basale celmembraan onderliggende matrix) en de bijdrage van de celmembraan capaciteit. Ten tweede kunnen celproliferatie en beweeglijkheid worden beoordeeld, aangezien de cels in direct contact met de elektroden. Derde substraat en elektroden zijn voldoende dun om voor helderveld en fase contrast microscopie.

Basis van impedantie metingen: De complexe impedantie

De basis voor het meten van de elektrische impedantie van biologische objecten (bijv. cellen) is de wet van Ohm, een basis elektrotechnische principe, dat de verhouding tussen de weerstand (R) beschrijft stroom (I) en de spanning (U) in een elektrisch circuit op een bepaald tijdstip (t).
Toepasbaar in DC circuit: R (t) = U (t) / I (t)

Bij het werken in de AC-systeem, stroom en spanning niet alleen verschillen in amplitude, maar ook de fase (φ). Nu, de weerstand is niet langer voldoende om deze relaties te beschrijven. In plaats daarvan de complexe impedantie (Z) of in de meeste gevallen de grootte van de impedantie (| Z |) gebruikt, die de eerder beschreven ohmse weerstand plus reactantie (X), waarin retaten van AC stroom door condensatoren en spoelen het besturen van de faseverschuiving tussen spanning en stroom ^5.
Toepasbaar in AC circuit: | Z (f) | = √ (R ² + X (f) ²⁾
φ = arctan (X / R)

Bij het uitvoeren van impedantiemetingen op intacte cellen, door de eigenschappen van hun membraan cellen fungeren als een parallelschakeling van weerstand en condensator. Hier, is de weerstand tegen stroom, terwijl capaciteit (C) beschrijft de scheiding van elektrische dragers in de isolerende bi-laag van de celmembraan dat polarisatie van de cel veroorzaakt. Daarbij X wordt gedomineerd door de capacitieve eigenschappen van de celmembraan.
X (f) ≈ (2 * pi * f * C _Cell) ^-1

Omdat X frequentieafhankelijke variatie van de meetfrequentie maakt studie van verschillende functionele en structurele eigenschappen van de cel. De ECIS apparaat meet zowel R en X, zodat berekeningvan | Z, C en φ.

Kwantificeren hele cel lagen met impedantie spectroscopie: Het elektrisch equivalent circuit.

Zoals eerder uitgelegd, wanneer een cel in een elektrisch veld wordt gebracht, toont eigenschappen van passieve elektronische componenten. Indien nu, in plaats van een enkele cel, een gehele cellaag gekweekt bovenop elektroden en aangevuld met celkweekmedium wordt onderzocht, het simpele model van weerstand en condensator moet worden uitgebreid tot een volledig elektrisch netwerk. In deze zogenaamde equivalent circuit, weerstand van het kweekmedium (R _Med) en capaciteit (C _Elect) en weerstand (R _Elect) karakteriseren van de elektrode / elektrolyt interactie moeten worden overwogen ^3,6.

Een vereenvoudigd, algemeen voorbeeld van een dergelijke equivalente schakeling voor een hechtende kweken cellaag te vinden in Figuur 1. Het voordeel van een dergelijke mathematische eenAANPAK een biologisch systeem beschrijven dat de circuits kunnen worden verfijnd ad libitum en aangepast aan de specifieke experimentele vragen, bijvoorbeeld door rekening impedantie veroorzaakt door intracellulaire organellen of invloeden van cel-cel (R _Junc) en cel-substraat adhesie onderscheiden (R _Sub) op de totale impedantie ^7,8. Toch is de doelstelling voor de modellering moet altijd tot het kleinste aantal elementen beschrijven van alle functies van de gemeten impedantie spectrum om zinvolle correlaties laten gebruiken.

Figuur 1. Schematische voorstelling van het ECIS systeem en representatieve equivalent circuit voor een hechtende groeiende cellen laag. A) Dwarsdoorsnede van een ECIS cultuur ook. De cellen groeien bovenop detectie en tegenelektrode en eenopnieuw bedekt met kweekmedium. De elektroden zijn verbonden met een lock-in versterker en een AC-signaal wordt via een 1 MQ weerstand met een constante stroombron maken. Stimuli direct worden toegevoegd aan het kweekmedium op elk moment. B) ECIS meet de som van alle individuele bijdragen aan het impedantie. Weerstand van het kweekmedium (R _Med) en impedantie veroorzaakt door de elektrode / elektrolyt-interface, die voor de eenvoud weergegeven als een parallelschakeling van een weerstand (R _Elect) en een condensator (C _Elect), en ook de elektrische eigenschappen van de celmembraan beschreven door een parallelschakeling van weerstand (R _Cell) en capaciteit (C _Mem), moeten allemaal worden beschouwd. R _Cell variabel, omdat het afhankelijk is van de permeabiliteit van de cel in de lopende. De equivalente schakeling kan worden uitgebreid en verfijnd ad libitum. Als voorbeeld junctionele (R _Junc) alsevenals subendotheliale (R _Sub) weerstand werden toegevoegd aan het circuit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Impedantie parameters en hun biologische betekenis

De twee meest directe parameters uit impedantiemetingen zijn weerstand en capaciteit van de cellen. Weerstand staat voor kwaliteit en functie van de cel barrière en derhalve houdt rekening met de weerstand tegen para-en trans-cellulaire stroom. Capaciteit wordt een totaal-maatstaf elektrode dekking. Het onderscheidende kenmerk van de ECIS is dat met de hulp van equivalente circuits en modelleren van deze globale parameters geven inzicht op veel meer cellulaire eigenschappen, met inbegrip van cel-cel en cel-substraat adhesie, die verderop in dit artikel zal worden besproken.

Voordat u begint: Experimentele ontrantsoenen

Meetopzet - De opstelling bestaat uit verschillende delen: ECIS apparaat met meetelektronica, PC voor data-acquisitie,-array houder voor de 8 - of 96-well systeem; ECIS arrays en de celkweek van keuze. De array houder moet in een incubator geplaatst en aangesloten op het ECIS apparaat buiten de incubator. De PC moet worden uitgerust met ECIS software (1.2.123.0 14 februari 2013) en verbonden met het ECIS apparaat.

Array selectie - Er is een steeds groeiende verscheidenheid aan ECIS arrays, ontworpen voor meerdere toepassingen. De standaard arrays zijn 8W1E en 8W10E arrays die zijn samengesteld uit 8 kweekputjes (aangeduid met W) bevattende 1 of 10 metingselektroden (aangegeven met E), respectievelijk. Een grote tegenelektrode voltooit het circuit, maar de impedantie wezen verwaarloosbaar in de eigenlijke meting ^6. De standaard 8-goed-array houder kan hosten twee eenrrays, resulterend in een totaal van 16 kweekputjes. De gouden elektroden 50 nm dik, omlijnd met een isolerende film en aangebracht op ofwel een optisch helder Lexan polycarbonaat of een printplaat (PCB). De PCB-arrays zijn robuuster en kostenefficiënt. De transparante dia's zorgen voor licht en immunofluorescentie microscopie. Wat moet worden beschouwd is dat de 1E-array verbetert schommelingen in het verzet signaal veroorzaakt door cel bewegingen en is nodig voor wondgenezing studies. Daarnaast enkele elektroden laten correlatie van elektrische en optische signalen. In de multi-elektrode arrays, wordt het signaal gemiddeld over meerdere elektroden die door de verhoogde meetgebied onder meer cellen in de meting beperkt voorspanning van de gegevens door ongelijke inoculatie en groei van de cellen en vermindert vervaging van het signaal door cel moties. Daarom is de meervoudige elektrode arrays zijn nuttig om celproliferatie en barrièrevorming bestuderen. Naaststandaard arrays er speciale arrays beschikbaar voor de toepassing van afschuifspanning ^9, chemotaxis ¹⁰ studeren, celmigratie en proliferatie evenals 96-well platen voor high throughput screenings. Tot slot, de array te gebruiken is sterk afhankelijk van de wetenschappelijke vraag en celtype en moeten worden geselecteerd en zorgvuldig getest.

Meetfrequentie - Het modelleren van Rb-en alfa (zie data-analyse) nodig meerdere frequentie metingen (MFT). Anders impedantie kan worden gemeten in de tijd op een celtype specifieke frequentie (SFT), met als voordeel dat de gegevens kunnen worden verzameld met een hogere temporele resolutie. De gevoeligste meetfrequentie voor een specifiek celtype vindt frequentie scans. Bij het plotten impedantie respectievelijk weerstand vs frequentie in een log-log grafiek de frequentie waar het verschil tussen cel-vrij of cel bedekte elektrode is de grootste is de frequentie waar de cellen blokkeren thij huidige meest effectief. Bij endotheelcellen (EC) die frequentie ongeveer 4 kHz.

Entdichtheid - Zoals in elke reguliere cel-gebaseerde experiment seeding dichtheid is afhankelijk van het wetenschappelijk probleem. Bij het ​​bestuderen hechting en spreiding of barrièrevorming moeten endotheelcellen worden gezaaid met een hoge dichtheid van 40.000-60.000 cellen / cm ² een confluente garanderen stabiele barrière na 48 uur. Wanneer de focus van het experiment proliferatie dient endotheelcellen worden gezaaid met een lage dichtheid van ongeveer 2,000-10,000 cellen / cm ^2.

Protocol

1. Voorbereiding van Measurement System

1. Voorverwarmen de array houder in een incubator bij 37 ° C voordat het experiment om condensvorming te voorkomen.
2. Vul water kist van de incubator met gedestilleerd water om uitdroging van de putten te vermijden.
3. Voer alle manipulaties op cellen en arrays in een laminaire flowkast onder steriele omstandigheden.

2. Bereiding van Arrays en Enten van cellen

OPMERKING: De ECIS arrays moeten worden gereinigd en gestabiliseerd alvorens een experiment elektrode drift te voorkomen, well-to-well reproduceerbaarheid en signaal-ruisverhouding te verbeteren. Daarom zijn er twee mogelijkheden: A) voorbehandeling van de elektroden met L-cysteïne en B) de stabilisatie functie van de ECIS.

Optie A: L-cysteïne wordt aanbevolen als de meest consistente voorbehandeling, maar kan in sommige speciale gevallen interageren met eiwit coatings op de elektroden. De gepresenteerde hoeveelheden worden gebruikt voor standaard 8-well arrays.

1. Voeg 200 ul / putje 10 mM L-cysteïne. Cysteïne reinigt en wijzigt de elektrode oppervlak biedt een hoge en reproduceerbare elektrode capaciteit.
2. Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
3. Was tweemaal 500 ul / putje met ultra-puur water (type 1). Gebruik fosfaat buffers, die kunnen interfereren met de adsorptie van sommige eiwitten. Vermijd ook serum-bevattende oplossingen voor het coaten, aangezien de goud oppervlak de eerste macromoleculen in contact gebracht zullen adsorberen.
4. Jas met 200 ul / putje warme 1% gelatine.
5. Incubeer 30 minuten bij 37 ° C.
6. Verwijder gelatine, maar laat oppervlak droog. Dit kan de borstband beschadigen.
7. Was eenmaal met ultra-puur water (type 1).
8. Voeg 400 ul / putje volledig celkweek medium (serum bevat, antibiotica en alle groeifactoren).
9. Slide array naar array-houder eend Zorg ervoor dat de array zodanig dat de negen gouden vierkante elektroden goed worden benaderd door het verende pogo pennen en fix stelschroef handvast is gepositioneerd. Wees voorzichtig met transparante arrays, kan de goudlaag gemakkelijk worden beschadigd.
10. Open de meetsoftware en druk op Setup gevolgd door Controleer in de sectie "Gegevens verzamelen" om snel een impedantie meting van elk individu goed presteren. De verkregen waarden zijn gemeten basislijn en automatisch opgeslagen in de "Commentaar".
11. De goed controle zal automatisch het type ECIS arrays gebruikt bepalen. Controleer de geselecteerde arrays in de sectie "Well Configuration".
12. De array diagram brandt groen voor goed aangesloten putten en rood voor lege of onjuist aangesloten putten. Toch is er altijd voor zorgen dat de arrays correct in de houder geplaatst.
    OPMERKING: Als reinigen en coaten succesvol waren de 8W1E ECIS arrays hebben acapacitance van ongeveer 5 nF en 8W10E arrays van 50 nF, hetgeen een basislijn weerstand van ongeveer 2000 en 200 Ω resp.
13. Verwijder array houder.
14. Zaadcellen als een enkele celsuspensie in 400 pl / putje volledig celkweekmedium.

Optie B: De stabilisator van het ECIS kan worden gebruikt als alternatief of in combinatie met L-cysteïne behandeling en als problemen met elektrode drift of grote verschillen in well-to-well weerstand en capaciteit optreden.

1. Voer cysteïne behandeling (optioneel) en voorstrijken elektroden met eiwitten (optioneel).
2. Voeg 200 ul / putje volledig medium aan elk putje en plaats de array in de array houder.
3. Open meetsoftware en druk op Setup gevolgd door Controle aan de array bepalen goed is aangesloten en de eerste Z, R te meten, en C.
4. Stabiliseren de elektroden door te drukken Stabiliseren in de sectie "Gegevens verzamelen". De ECIS zal een hoge stroom (ca.. 3 mA), hoge frequentie (64 kHz) puls naar de elektroden reinigen van toepassing.
5. Controleer elektroden opnieuw. Capaciteit moet worden vergroot en de weerstand waarden moeten in een vergelijkbare range.
6. Als capaciteit en weerstand waarden zijn nog steeds niet bevredigend is, herhaal dan de stabilisatie.
7. Verwijder serie uit de houder en te enten cellen.

3. Het opzetten van Measurement Software en Data Acquisition

1. Plaats de array in de array houder zoals hiervoor beschreven.
2. Open meetsoftware en druk op de knop Instellingen in de sectie "Gegevens verzamelen" om de ECIS software aan te sluiten op de ECIS instrument en lopen nog een goed controleren.
3. Controleer de geselecteerde arrays in de sectie "Well Configuration".
4. Selecteer de putten te worden gemeten in de "Well CONFIGURATsectie ion ".
5. Kies de mode van de "Gegevens verzamelen" opties:
   1. Voor een tijdreeks op een vaste frequentie, selecteert Single Freq. / Time (SFT) en kies de meetfrequentie uit het drop down menu.
   2. Voor het meten van de elektrode dekking en modellering van Rb en Alpha, selecteert u Meerdere Freq. / Time (MFT). De ECIS apparaat automatisch te meten bij alle beschikbare frequenties.
   3. Voor micromotion (zie data-analyse) te selecteren Rapid Tijd Verzamelen (RTC) en meetfrequentie en sampling frequentie aan te passen. Hier de standaard tijdsresolutie een monster per seconde (1 Hz), maar bemonsteringsfrequentie kan ook worden verhoogd tot snelle veranderingen in impedantie tot 25 Hz (de Z-Theta) volgen. Belangrijke opmerking: in de RTC-modus slechts een enkele goed wordt gemeten.
      OPMERKING: Als micromotion moeten worden gemeten in verschillende putten vervolgens, ga naar Help> Show expert werkbalk / menu-items> Acquire> Multi-Well RTC. Geef de Termijn (hr) in de sectie Gegevens verzamelen, de ECIS zal nu de geselecteerde putten in numerieke volgorde te meten. Na het starten van de meting zal de software vragen om het aantal cycli te geven. Voer de waarde van hoe vaak de meting moet worden herhaald.
6. Voor SFT en MFT, selecteer het tijdsinterval (sec) tussen metingen of indien gegevens moeten zo snel mogelijk u deze optie niet worden verworven.
   OPMERKING: Om de gegevens van de ECIS apparaat maakt gebruik van een multiplexer om over te schakelen van de ene put naar de andere met een minimum SFT overname van 0,25 sec en 7,5 sec voor MFT verwerven. Betekenis het interval afhankelijk aantal geselecteerde putjes en frequenties. Voor metingen op langzame prolifererende cellen of een eenvoudige opname van resistentie tegen tijd, gebruikt tussenpozen van 600 s of meer.
7. Druk op Start, de naam van het bestand en selecteer locatie om de gegevens op te slaan.
   OPMERKING: bestand mag geen probleem, aangezien ECIS gegevens worden opgeslagen in een soort platte tekst genoemd *. abp, die nooit meer dan een paar honderd MB zelfs met alle meetfrequenties en aantal putten geselecteerd.
8. Stoppen door te drukken op Voltooien.

4. Medium Verandering en celmanipulatie

1. Druk op pauze, zal dit de data-acquisitie te stoppen, maar blijven de experimentele klok draaien.
2. Verwijder de array uit de houder en manipuleren onder een laminaire stroming bankje (dwz verandering gemiddeld).
3. Plaats reeks terug in de houder en klikt u op Verbinding controleren of Hervatten Experimenteer om data-acquisitie blijven. De meetsoftware zal een tijd stempel plaatsen in de dataset.

5. Acute stimulatie tijdens de Data Acquisition

OPMERKING: Een tweede optie is om de cellen te manipuleren tijdens de data-acquisitie onmiddellijk de nodige wijzigingen volgen. Dit kan alleen, Wanneer de monsters niet moet steriel zijn in het verdere verloop van het experiment.

1. Voeg de stimulus rechtstreeks naar de bron en zorg ervoor om te mengen voorzichtig met een 200 ul pipet.
2. Mark tijdstip handmatig door op Mark en voeg geplaatst.

6. Elektrische Verwonden

OPMERKING: Het vinden van de juiste instellingen voor het gebruikte celtype is de sleutel voor elektrische verwonden. Als verwonden te kort is kan dit leiden tot een ontoereikende verwijdering van cellen, terwijl als verwonding is te lang en / of ruwe kan dit de elektroden (vooral op de transparante arrays) beschadigen. Daarom worden verschillende korte verwonden pulsen aanbevolen. Voor HUVEC culturen twee 10-20 sec lang verwonden pulsen van 5 V bij 60 kHz hebben elkaar gevonden optimaal gebruik van de ECIS 1600R. In het algemeen wordt aanbevolen om hoge frequenties> 20 kHz uniforme hoge velden in de cellen behouden en schade aan de elektroden veroorzaakt.

1. Voer verwonden during een actieve ECIS meting.
2. Wond / electroporate instellen in te schakelen, klikt u op Wond en in de tijd (sec) invullen, wond spanning (V voor 1600 R) of stroom (uA voor Z en Z-Theta) en frequentie (Hz). De weergegeven standaardwaarden zijn gebaseerd op het type array en ECIS apparaat.
3. Selecteer de putten te verwonden in de sectie "Well Configuration". Alleen de aangevinkte putten zal worden gewond.
4. Inschakelen Uitstellen tot uur en in de vertragingstijd naar de vertraging wond te activeren vullen. Deze functie kan op elk gewenst moment worden gestopt door op Stop te drukken of handmatig aanbrengen van een wond. Slechts een vertraging commando actief zijn tijd.
5. Druk op Activeren en klik op OK in het pop-up venster om te beginnen verwonden.
6. Zorg ervoor dat de weerstand signaal daalt tot de offset impedantie na verwonding, het verwonden anders herhalen.

7. Data Analysis

1. Datarepresentatie en exporteren.
   1. Finish meting of belasting dataset via File -> Open.
   2. Selecteer putten moet worden weergegeven in het venster "Well Configuration". Groep afzonderlijke putjes op de gemiddelde presenteren.
   3. Koos parameter weer te geven uit de bovenste werkbalk (Z, R of C).
   4. Selecteer het type grafiek uit de bovenste werkbalk (T = tijd, F = frequentie, 3D = waterval blot).
   5. Definieer grafiek offset en bereik met de sliders onder de grafiek raam of in de exacte waarden in de aangrenzende controles te vullen.
   6. Koos uit de basis "Time-Series Opties" in de sectie "Analyze" naar standaarddeviatie uitvoeren, lopend gemiddelde of normalisatie van de gegevens.
   7. Activeer Expert Toolbar in het Help-menu voor meer geavanceerde bewerkingen zoals Nyuist plot en Fourier transformatie.
   8. Gebruik "Weergave-opties" in de sectie "Analyze" naar ra definiërenNSE van x-en y-assen en export grafiek.
   9. Exporteer geselecteerde gegevens naar een Excel-bestand via File -> Gegevens exporteren -> naar Excel (geselecteerd) en het gebruik van een derde partij software van de keuze voor diepgaande analyse, statistiek en vertegenwoordiging als nodig is.
2. Modellering van Rb en ​​Alpha.
   OPMERKING: Bij het modelleren is het aanbevolen om een ​​cel-vrij, medium goed gevuld als referentie gebruiken.
   1. Finish MFT meting of belasting MFT dataset.
   2. Als een cel-vrij referentie goed beschikbaar is, drukt ofwel zoeken naar de referentiewaarde of instellen dat de cel vrije tijd punt handmatig selecteren van "Freq. Scan Modeling" in de sectie "analyseren" automatisch te selecteren.
   3. Als er geen cel-vrije referentie, importeer een referentiewaarde van een andere dataset. Open de referentie dataset (zorg ervoor dat dezelfde array en medium werd gebruikt) en gebruik zoeken of instellen dat de referentiewaarde te selecteren.Navigeer vervolgens naar de gemeten gegevens in en druk op Get.
   4. Als er geen cel-vrije referentiegegevens vastgestelde beschikbaar gebruik de fabrieksinstellingen.
   5. Druk model de berekeningen te starten. Modeling kan enkele minuten afhankelijk van de grootte van de dataset te nemen.
3. Berekening van microbeweging.
   NB: Deze berekening is geen onderdeel van de meetsoftware, maar kan worden uitgevoerd met elk signaal processing software.
   1. Finish RTC meting of laden RTC dataset.
   2. Normaliseren van gegevens door de gemiddelde weerstand van de gehele periode te stellen.
   3. Breek dataset in segmenten met een lengte van 256-datapunten en reinig elk segment door een Hanning venster.
   4. Voer een 256-punts Fouriertransformatie en gemiddelde verkregen frequentiespectra een enkelzijdige 129 punten vermogensspectrum willekeurige ruis te minimaliseren en versterkt de biologisch signaal.
   5. Plot frequentie tegen amplitude in een log-log grafiek en toe te passenkleinste kwadraten lineaire fit.
   6. De helling van de lineaire fit is een maat voor de totale ruis in het signaal en daarmee microbewegingen van de cellen.

Results

Het opzetten van een experiment is vrij eenvoudig en de meting zelf is volledig automatisch, maar zoals vaak het geval is, correcte analyse en interpretatie van de gegevens zijn cruciaal. In de representatieve sectie data van een gids wordt verstrekt voor de interpretatie van de belangrijkste parameters die door impedantie spectroscopie met ECIS. Dit zal nuttig zijn om te beslissen voor welk soort wetenschappelijk probleem een ​​ECIS meting kan nuttig zijn en welke parameters moeten worden geregistreerd zijn.

Een typische experimentele uitlezing kan algemeen worden onderverdeeld in een groeifase na celinoculatie en een plateau-fase wanneer de cellen bereiken samenvloeiing. Elk van deze fasen levert informatie over de verschillende cellulaire eigenschappen. Een representatieve meting wordt getoond in figuur 2 en in vier subfases A) celhechting analyseren spreiding en proliferatie, b) vorming van een rijping EG blok; C) celmigratie na het genereren van een elektrischeal wond, en D) de cellulaire respons op stimulatie met het vasoactieve middel trombine. Fase-contrast en immunofluorescentie beelden werden direct uit de meting elektrode opgedaan tijdens de verschillende subfasen om het verband tussen elektrode dekking, cel-status, en opgenomen impedantiesignaal illustreren.

Hechting, verspreiden en proliferatie

Elk celtype heeft zijn karakteristieke hechting en groeicurve die kan worden gemanipuleerd door het variëren zaaidichtheid, bekleden met extracellulaire matrixeiwitten of andere stimuli. Een van de grote moeilijkheden om deze processen te bestuderen is om tussen hechting, spreiding en proliferatie. Wegener et al.. ¹¹ heeft een gedetailleerde beschrijving van het gebruik van een combinatie van weerstand en capaciteit onderscheid te maken tussen deze parameters en in figuur 3 wordt duidelijk hoe weerstand en capaciteit elkaar kunnen aanvullen. Het is belangrijkde studie van adhesie en verspreiding naar de invloed van de meetfrequentie begrijpen, omdat hier het elektrisch veld veroorzaakt een polarisatie van het celmembraan van de cellen in suspensie ^8, waarbij de stroom uitsluitend stroming rond de cellen dwingt. Wanneer de cellen hechten ze beginnen om de stroom te beperken door het verspreiden via elektrode en capaciteit vermindert lineair met het percentage open gebied op de elektrode (fractionele gebied). Daarom kan de hechting, spreiding en proliferatie best worden gekwantificeerd, bij opname capaciteit bij een frequentie hoger dan 40 kHz (figuur 3B), waarbij de afname in capaciteit is direct evenredig met de dekking elektrode. Alternatief weerstand op de gevoeligste meetfrequentie is een directe maat voor de differentiatie en rijping van cellen in een confluente barrière (Figuur 3A). Naast de gefractioneerde gebied, Wegener et al.. Twee geïntroduceerdparameters hechting en elektrode dekking kwantificeren: t _1/2 (half maximum capaciteit), dat de tijd tot 50% van de elektrode bedekt met cellen (Figuur 3B, insertie) en de helling van de capaciteit curve (s, niet weergegeven) als de snelheid van de cel verspreiden en proliferatie.

Resistentie als maat voor de kwaliteit barrière

Weerstand is het deel van de impedantie die beschrijft barrière kwaliteit en functionaliteit het beste, omdat het verwaarloost capacitieve componenten uit membraan, elektrode en medium. Hier wordt de term barrière kwaliteit en niet permeabiliteit wordt gebruikt, aangezien permeabiliteit is per definitie alleen afhankelijk van cel-cel contacten. De weerstand wordt echter bepaald door het vermogen van cellen en de cel-cel en cel-matrix interacties de stroom blokkeren. Dienovereenkomstig verschillende celtypen (klonen en passages) hun specifieke weerstandswaarden (figuur 4A). Hoewel weerstand geeft een veel clearer idee over de cel barrière, de impedantie signaal moet altijd rekening worden gehouden.

Modellering van Rb en ​​Alpha

De ECIS software herbergt een bepaalde functie, de mogelijkheid model twee parameters, die onderscheid maken tussen cel-cel en cel-matrix adhesies (Figuren 4B en 4C). Rb (in cm x ² ohm), is de weerstand van cel-cel contacten stroom en daardoor een omgekeerde maat voor klassieke permeabiliteit. Hoge Rb impliceert lage permeabiliteit naar de stroom. Alpha (in cm x ^0,5 ohm), is een maat voor de impedantie bijdragen die voortvloeien uit de cel-elektrode kruispunten. Het model cel-cel en cel-matrix-contacten kwantificeren werd geïntroduceerd 1991 door Giaever en Keese en is gebaseerd op de aanname dat cellen cirkelvormige, schijfvormige objecten die een isolerend membraan hebben muisaanwijzer op de elektrode en zijn gevuld met geleidende elektrolyt ² . Deisolerende eigenschap van het celmembraan laat drie trajecten voor de stroom: a) tussen ventrale oppervlak van de cellen en elektrode, b) tussen de cel-cel contacten, en c) door de cellen (waarschijnlijk alleen als een hoge meetfrequentie wordt gebruikt ). Een meer gedetailleerde afleiding en uitleg is te vinden in de papieren van Lo et al. ^3,12.

Microbeweging

Het is aangetoond dat kleine fluctuaties in de weerstand signaal (figuur 4A) zijn door subtiele, willekeurig celbewegingen in confluente cellaag alsook cellen bewegen en uit de elektrode in verspreide culturen ^2. Dit aspect van ECIS tijd-cursus data beschreven door Lo en Opp et al.. ^13,14 wordt vaak over het hoofd gezien en het beste te zien bij het ​​meten met de 1E arrays en op de meest gevoelige frequentie ter verantwoording voor para-en subcellulaire huidige-paden. De berekening van deze cel veroorzaakte lawaai (micromotion) geen deel uitmaakt van the standaard meetsoftware, maar in de nieuwste versie Fast Fourier Transformation (FFT) is geïntegreerd. Opnemen RTC gegevens met een bemonsteringsfrequentie van 1 Hz gedurende 1 uur bij 4 kHz voldoende resolutie voor de berekening van EG microbeweging. Deze berekening levert een enkele waarde en kan direct worden gebruikt voor statistische analyse. Een uitgebreide discussie over het gebruik van frequentie-analyse voor micromotion kan elders ¹⁵ worden gevonden. Als alternatief voor FFT andere analysetechnieken kunnen worden gebruikt, zoals variantie van de stappen. Variantie is gevoelig voor kleine veranderingen in microbewegingen, maar daardoor de gevoeligheid, van de afzonderlijke experimenten moeilijk. De hellingen van het vermogensspectrum een robuuster meting van microbeweging (figuur 4D). Hier is het gebied onder de curve kan worden gezien als de hoeveelheid microbeweging of ruis cellen maken. Derhalve hoe steiler de helling van het vermogensspectrum hoe kleiner het gebied onder de curveen hoe kleiner de microbeweging.

Elektrische wondgenezing assay

Om migratie van cellen te bestuderen, worden meestal mechanische wonden door krabben cellen uit de cultuur plaat met pipet tips, mobiele schrapers of specifieke stempels en volgen hun remigratie microscopisch ¹⁶ toegepast. Deze werkwijze heeft het duidelijke nadeel dat de grootte van de kras varieert en is meestal te groot om de invloed van celproliferatie op de wond genezingsproces verwaarlozen. De verwonding functie van de ECIS maakt gebruik van een hoog voltage, hoge frequentie puls naar een cel vrij elektrode te krijgen en vervolgens volgt remigratie van naburige cellen tot de dood cellen (figuur 5A) te vervangen. Een voordeel van deze methode ten opzichte van standaard geautomatiseerde, arbeidsintensief kras assays is dat het ECIS produceert een zeer reproduceerbare wond met een precieze diameter van 250 urn, dat binnen een paar uur sluit, pure migratie bestuderen. Verder is de elektrische puls doenes niet verwijderen eiwit coating en uitgescheiden extracellulaire matrix. Onder de aanname dat de cellen remigreren op de elektrode van alle kanten, kan de migratie snelheid eenvoudig worden berekend door gewikkeld straal te delen door de tijd die nodig is voor wondsluiting ^17. Als alternatief voor elektrische verwonding, onlangs de zogenaamde elektrische methode afrastering geïntroduceerd (niet getoond). Hier hoge stroom pulsen voorkomen hechting en migratie van cellen op de elektroden na inenting. De cellen groeien rond de meetelektrode en beginnen te migreren naar binnen zodra de elektrische pulsen worden uitgeschakeld. Het voordeel van het schrikdraad via elektrische verwonding is dat het elektrodeoppervlak niet is veranderd door celgroei of celverwijdering, wat belangrijk is voor invloeden van verschillende coatings op celmigratie gemeten.

Cel stimulatie

Naast de studie van celmigratie wordt impedantiespectroscopie perfect geschikt voormeten van de effecten van geneesmiddelen en toxines op cellen. Figuur 5B stelt een klassiek stimulatie / inhibitie experiment waarbij trombine werd gebruikt om hyper-permeabiliteit induceren in de confluente EG barrière door samentrekking en gap vorming van cellen, die zich manifesteert als een voorbijgaande daling van de weerstand . Door pre-incubatie met de Rho kinase remmer Y-27632 de meeste van de trombine reactie wordt verminderd door het verlagen van basale cel spanning ¹⁸ en het blokkeren van stress vezelvorming ^19. Vervolgens werd de Rho kinase blocker gebruikt op verschillende tijdstippen na trombine toevoeging, wat leidt tot een onmiddellijke en volledige herstel van het EG-barrière. Hier het voordeel van een continue impedantie meetsysteem acute cellulaire responsen studie duidelijk wordt. In normale eindpunt assays (bijv. immunofluorescentie kleuring of macromolecuul passage), zou dit acute reactie op de gebruikte blocker zeer moeilijk zo niet onmogelijk te detecteren en kwantificeren. Belangrijk om op te merken is dat met impedance meting de permeabiliteit richting ionen wordt beschreven en niet op macromoleculen. Raadpleeg Aman et al.. ^20, waar een uitstekende vergelijking tussen ECIS metingen en macromoleculen passage experimenten wordt verstrekt.

Figuur 2. Representatieve meting. MVEC werden gekweekt op een gelatine beklede 8W1E arrays met een lage seeding dichtheid van 5000 cellen / cm ² en MFT opname werd uitgevoerd over 10 dagen. De meting toont de verschillende uitlezingen van een ECIS experiment A) hechting, spreiding en proliferatie, B) de vorming en rijping van een confluente cel blok; C) wondheling bij de toepassing van een elektrisch wond D) stimulatie met de vasoactieve middel trombine. De twee pijlen geven medium drankjes, die werden uitgevoerd in intervallen van 4 dagen en een idee over de gevoeligheid van de metingen naar mechanische stimuli en veranderingen in temperatuur en pH. De afbeeldingen in het bovenste paneel komen overeen met de meting en rechtstreeks vanuit de meetelektrode verkregen. De fase-contrast beeld links toont de endotheelcellen 24 uur na inoculatie begint de elektrode bedekken. De immunofluorescentie afbeeldingen in het midden en rechts onderhavige F-actine kleuring van de confluente endotheellaag voor en na stimulatie met trombine (1 U / ml). Trombine veroorzaakt samentrekking van endotheelcellen door de vorming van zogenaamde stress-vezels en de tijdelijke opening van inter-endotheliale openingen (pijlen en beeld inserts), herkenbaar in de ECIS signaal door een daling van weerstand tegen basislijn. Hier de gevoeligheid van de meting wordt duidelijk hoe veranderingen in de cellaag correleren met de impedantie signaal.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Celhechting en groei. MVEC van dezelfde donor werden geënt met drie verschillende dichtheden op gelatine beklede 8W10E arrays en celgroei werd geregistreerd bij verschillende frequenties voor 60 uur. A) Weerstand waarden voor de drie voorwaarden op hun optimale frequentie van 4 kHz te meten barrière vorming. Alle drie zaaien dichtheden vestigde een samenvloeiing barrière van ca. 1200 Ω aan het einde van de meting;. De proliferatiesnelheden echter (hellingen van de curven) verschilt aanzienlijk B) Meting van capaciteit op 64 kHz om beter te begrijpen hechting en spreiding. Hechting is de invrijwaart de oorspronkelijke plateaufase de capaciteit curve (tussen 2-8 uur). Het verspreiden, die lineair verband met de dekking elektrode, wordt weergegeven door de helling van de curve en voltooid na 10-30 uur afhankelijk van de entdichtheid. Het tijdstip t _1/2 (half-maximale dekking) kunnen worden gebruikt voor statistische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Karakterisering van de confluente barrière. Twee MVEC donors met verschillende passage nummers (doorgang 3 en 6) werden gezaaid op gelatine beklede 8W1E arrays en MFT meting werd gedurende 30 uur aan de EG barrière. A) Weerstand karakteriseren metingen blijkt dat de jongere donor 1 heeft een hogere weerstand van ca. 11.000 Ω in vergelijking met de ca. 7500 Ω van de oudere donor 2. BC) De modelleringsmogelijkheden van het ECIS zijn gebruikt om de oorzaak van de lagere weerstand vinden. Modeling bleek een vergelijkbare cel-cel interacties en Rb aangegeven verzwakte cel-matrix interacties Alpha als mogelijke oorzaak. D) RTC werd uitgevoerd om microbeweging kwantificeren in de confluente cellaag door Fouriertransformatie, wanneer het oppervlak onder de kromme evenredig met microbeweging . Analyses van de spectra toont minder microbewegingen van de oudere donor 2 en daarbij ondersteunen wat al kan worden uitgegaan van de weerstand signaal (minder variantie). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

5 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/>
Figuur 5. Celmigratie na elektrische verwonding en de effecten van trombine stimulatie. Impedantie opnames werden uitgevoerd bij 4 kHz met maximale temporele resolutie. A) MVEC donor 1 werd gebruikt in passage 3 en donor 2 in passage 6 op gelatine gecoate 8W1E arrays en uitgegroeid tot samenvloeiing. Vervolgens werd een elektrisch wond door toepassing van twee 5 V pulsen bij 60 kHz met een duur van 20 seconden elk. De jongere donor 1 vertoonden betere wondgenezende mogelijkheden gebaseerd op een snellere wondsluiting (migratie hellingen van de curven) en een hogere weerstand na verwonding in vergelijking met de oudere donor 2. B) HUVEC werden gekweekt op met gelatine beklede 8W10E arrays. Bij samenvloeiing werden de cellen serum-verhongerd gedurende 1,5 uur door vervanging van het volledige cultuurmedium met basismedium plus 1% humaan serum albumine (HSA). Onsleeftijd van vlakte medium met HSA is een belangrijke stap, omdat serumcomponenten blokkeren de trombine reactie. Zodra een stabiele weerstand plateau werd gedetecteerd, werd trombine direct aan de putjes toegevoegd en voorzichtig gemengd met 200 ul pipet. De maximale trombine effect is zichtbaar na 30 minuten, gekenmerkt door een voorbijgaande daling van weerstand tegen basislijn en een ca. 30-50% lagere weerstand na herstel. De cellen werden ofwel gepreïncubeerd met de Rho kinase blocker Y-27632 gedurende 30 minuten of de blocker werd 20, 30, of 40 minuten na trombine toevoeging, die de trombine onmiddellijk van kracht afgenomen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .

Discussion

ECIS is een uitstekend hulpmiddel voor het screenen van cel eigenschappen en het gedrag en voor de kwantificering van de effecten van bekende en onbekende stoffen. Waardoor de cellen worden gehouden onder standaard kweekomstandigheden, kan impedantie continu worden bewaakt met een hoge temporele resolutie en gecorreleerd met optische signalen. Zo het optimale tijdstip voor cellulaire manipulaties kunnen worden gekozen op basis van de morfologische en functionele celstatus. Helaas, deze hoge resolutie meting komt met de prijs dat kleine veranderingen in de temperatuur, pH of mechanische stimulatie van cellen (gemiddeld verandering) de impedantie signaal direct van invloed zal zijn.

De toepassing van de kleine meting stroom naar de cellen maakt de ECIS meting niet-invasieve, niet-destructieve en label-free, maar als gevolg alleen passieve bio-elektrische eigenschappen kunnen worden gemeten (geen actiepotentialen). Een belangrijk kenmerk is dat een aantal parameters der kan ived van een enkele meting, de gegevens combineren uit verschillende klassieke tests, zoals permeabiliteit of wondgenezing assays. Hier het bijzonder interessant aspect is dat wiskundig gemodelleerde gegevens kunnen worden gebruikt om wijzigingen in weerstand en capaciteit staand en verwijzen ze naar verschillende cellulaire structuren (bijv. cel-contacten of celmembraan). Belangrijk om op te merken is dat de impedantie spectroscopie biedt altijd een gemiddeld signaal van alle cellen op de meet-elektrode, die niet zorgen voor studies over enkele cellen en ook het wiskundige model is alleen geldig in samenvloeiing cellagen. Daarom moeten endotheelcellen in de samenvloeiing staat worden gehouden voor ten minste een dag eerder gebruikt voor het modelleren om volwassen cel-adhesie en latente cellen zorgen. Ook moeten elektrische wonden alleen worden toegepast op cellagen confluente gebruik van meerdere korte verwonding pulsen met hoge frequentie, een optimale efficiëntie verwonding en beschadiging van de elektroden te voorkomen.

jove_content "> De maximale hoeveelheid informatie van een ECIS meting, zoals in elke assay verschillende parameters zoals de combinatie van matrix substraat, coating en zaaidichtheid voor de individuele celtype moeten worden getest en geoptimaliseerd voor een experiment.

Een belangrijke beperking van ECIS is dat de meting geen directe informatie op over het moleculaire niveau. Zo ECIS metingen zijn meestal het meest informatief aan het begin van een experimentele serie te helpen associëren een wetenschappelijk probleem met cellulaire structuren of eigenschappen en zorgen voor een significante input voor het genereren van een toetsbare hypothese. Daarom is de modulaire opbouw van ECIS biedt een breed spectrum van toepassingen met de mogelijkheid maat arrays. De laatste reeks ontwikkelingen duiden op een toekomstige focus op high throughput impedantie screenings voor celproliferatie en elektrische verwonding en de opmars van speciale stroom arrays voor de simulatie van in vivo shear stress met verschillende stroom profielen.

Verdere literatuur
Raadpleeg ook de website van Applied Biofysica (www.biophysics.com) voor application notes, webinars en een gedetailleerde lijst van publicaties die het hele ECIS spectrum.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W10E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
L-Cystein	Merck Millipore	102838
Gelatin	Merck Millipore	104070
Bovine Thrombin	Merck Millipore	604980
Albuman (Human Serum Albumin)	Sanquin
Y-27632	Tocris Biosciences	1254
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Pen/Strep	Lonza	17-602E