Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Samenvatting

Bloed leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een marker van algemene bio-energetische gezondheid van een individu en dus de potentie om pathologische processen en het effect van behandeling te controleren. Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en meten mitochondriale functie en de oxidatieve uitbarsting in deze cellen.

Samenvatting

Mitochondriale dysfunctie is bekend een belangrijke rol in een aantal pathologische aandoeningen zoals atherosclerose, diabetes, septische shock, en neurodegeneratieve ziekten, maar om veranderingen in de bio-energetische functie bij patiënten uitdaging. Hoewel ziekten zoals diabetes of atherosclerose onderhavige klinisch specifieke orgaan stoornis, de systemische onderdelen van de pathologie, zoals hyperglycemie of ontsteking, kan bio-energetische kunnen veranderen in circulerende leukocyten en trombocyten. Dit concept is enige tijd bekend, maar de wijdverbreide toepassing is beperkt door het grote aantal primaire cellen nodig voor bio-energetische analyse. Deze technische beperking overwonnen door het combineren van de specificiteit van de magnetische kraal isolatietechnieken, celadhesie technieken, waarmee cellen worden gehecht zonder activering microplaten, en de gevoeligheid van nieuwe technologieën ontworpen voor high throughput microplate respirometry. Een voorbeeld van dit materiaal het extracellulaire flux analysator. Dergelijke instrumenten gebruikt doorgaans zuurstof en pH-gevoelige probes mate van verandering van deze parameters in hechtende cellen, die vervolgens kunnen worden gerelateerd aan metabolisme meten. Hier hebben we detail de methoden voor de isolatie en beplating van monocyten, lymfocyten, neutrofielen en bloedplaatjes, zonder activering, uit menselijk bloed en de analyse van bio-energetische mitochondriale functie in deze cellen. Daarnaast hebben we aantonen hoe de oxidatieve burst in monocyten en neutrofielen ook worden gemeten in dezelfde stalen. Aangezien deze methoden gebruiken slechts 8-20 ml menselijk bloed hebben ze mogelijkheden voor het bewaken van reactive oxygen species generatie en bio-energetica in een klinische setting.

Inleiding

Monitoring van de bio-energetische gezondheid van immuuncellen (monocyten, lymfocyten, neutrofielen) en bloedplaatjes uit het bloed is sedert enige tijd als een potentieel nuttig diagnostisch hulpmiddel om de algehele bio-energetische gezondheid van een individu te beoordelen. Er is een nieuwe hoeveelheid literatuur toeschrijven een aantal ziekten zoals kanker, cardiovasculaire ziekten en neurodegeneratieve ziekten mitochondriale dysfunctie ^1,2. Dit is klinisch belangrijk omdat mitochondriale dysfunctie een reeks van cellulaire gebeurtenissen die pro-inflammatoire signaalwegen bevorderen of leiden tot celdood kunnen initiëren. Verschillende studies hebben mitochondriale functie van perifere mononucleaire bloedcellen en bloedplaatjes bij aandoeningen zoals fibromyalgie, diabetes, septische shock, en ziekte van Alzheimer ^3-7 gekarakteriseerd. Bijvoorbeeld, een recente studie evalueerde de bio-energetica van bloedplaatjes als een marker voor de mitochondriale functie en vond dat bloedplaatjes aan type 2 diabetIC patiënten hadden mitochondriale zuurstof verbruik ^7,8 verminderd. Uit deze bevindingen en anderen blijkt dat monocyten, lymfocyten, neutrofielen en bloedplaatjes als plaatsvervangende markers veranderingen in bio-energetica kan dienen onder pathologische omstandigheden aangezien overzien de systemische circulatie en kunnen lokale en globale metabolische wijzigingen. Om te bepalen of deze benadering prognostische of diagnostische waarde high throughput analysemethode en consistente werkwijze voor celbereiding vereist.

De methoden om mitochondriale functie van leukocyten en bloedplaatjes te meten hebben eerder betrokken isolatie van mitochondriën of beoordeling van cellulaire bio-energetica in intacte cellen ^4,9. Het voordeel van cellulaire bio-energetische evaluatie middels een extracellulaire flux (XF) analysator is dat de mitochondriale functie in cellen kunnen worden opgesteld endogene substraten en respiratoire parameters zoals proton lekkage en maximale respiratoirecapaciteit kan worden bepaald. Wij en anderen hebben gebruik gemaakt van deze technologie aangetoond dat bioenergetische profielen bloedplaatjes, monocyten en lymfocyten uit humaan bloed geïsoleerd kan worden vastgesteld en vergeleken tussen celtypes ^8. Bovendien, zowel neutrofielen en monocyten bezit een oxidatieve uitbarsting hoedanigheid waarin NAPDH oxidasen worden geactiveerd en verbruiken zuurstof superoxide. Belangrijk is dat deze route is een belangrijk onderdeel van het aangeboren immuunsysteem en wordt gemoduleerd door systemische ontsteking. Zo is aangetoond dat veranderingen in de oxidatieve burst capaciteit wordt geassocieerd met verschillende auto-immuunziekten zoals multiple sclerose, artritis en recidiverende infecties ^10,11. Momenteel zijn er geen hoge doorvoer kwantitatieve bepalingen waarover de oxidatieve uitbarsting in klinische monsters te bepalen. Dit is belangrijk aangezien de karakterisering van de oxidatieve uitbarsting aantal neutrofielen en monocyten kan ook dienen als een belangrijk diagnostisch hulpmiddel voor meerdere patholoogGies.

De belangrijkste technische uitdagingen lage gevoeligheid voor de meting van zuurstofconsumptie behulp van conventionele technieken polarografische en de noodzaak gehechte cellen gebruiken wanneer u gevoeliger microplaat fluorometrische technieken. In deze praktische video beschrijven we de technische oplossing voor deze problemen. We detail de methoden voor de isolatie, beplating en het meten van bio-energetica van monocyten, lymfocyten, neutrofielen en bloedplaatjes en de oxidatieve uitbarsting van monocyten en neutrofielen uit menselijk bloed. Deze methode is geschikt voor de klinische beoordeling van bio-energetica en oxidatieve burst voor onderzoekers die hebben toegang tot een patiëntenpopulatie en de mogelijkheid om nieuw bloed monsters.

Protocol

Alle protocollen in dit manuscript voor bloedafname, isolatie en analyse beschreven zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board goedgekeurd aan de Universiteit van Alabama in Birmingham.

1. Cel Isolatie (Gewijzigd uit Histopaque Sigma-Aldrich Protocol 1119 en Miltenyi Biotec microbeads Positieve en negatieve selectie protocollen)

1. Centrifuge volbloed (in ACD of EDTA-buizen) bij 500 xg gedurende 15 minuten in een centrifuge met een swingende-bucket rotor (versnelling = 5-6, en geen rem).
2. Verwijder de bovenste laag die de bloedplaatjes rijk plasma (PRP) bevat met een transfer pipet tot 1 cm blijft boven de cellaag (erytrocyten / buffycoat). Vernietiging van het PRP bij kamertemperatuur latere verwerking.
3. Breng de buffycoat een steriele 50 ml conische buis, verdund tot 24 ml met basale RPMI of ten minste 4x de beginnende bufferlaagvolume.
   Opmerking: De bovenste helft van de RBC laag kan have op te nemen, hoewel dit zal resulteren in het verhogen van het volume RPMI proportioneel.
4. Bereid de dichtheidsgradiënt met lage dichtheid Ficoll met een dichtheid van 1,077 (1077) voor de bovenste laag en hoge dichtheid Ficoll met een dichtheid van 1,119 (1119) voor de onderste laag in drie 15 ml conische buizen (elk 3 ml). Om deze stap uit te voeren, eerst toevoegen 1077 aan elke buis. Met behulp van een 5 ml pipet smalle voeg 1119 aan de bodem van de buis door het plaatsen van de pipetpunt onder 1077 en langzaam het reagens vrij te mengen met de bovenste verloop. Een totaal van 6 ml dichtheidsgradiënt media moet aanwezig zijn in dit stadium met een zichtbare fase scheiding aan het 3 ml streepje.
5. Met behulp van een automatische pipet, voeg 8 ml verdunde bloed (uit stap 1.3) voorzichtig aan elke gradiënt buis met behulp van de low-power instelling om te voorkomen dat het verstoren van de helling lagen. Het totale volume moet 14 ml bij deze stap.
6. Centrifugebuizen bij 700 xg gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (acceleratierantsoen 6, geen rem).
   Opmerking: In dit stadium dient drie verschillende cel banden zichtbaar (figuur 1A) zijn. De bovenste banden (tussen 1077 en plasma) bevat mononucleaire cellen (MNC) en bloedplaatjes, en de middelste band (tussen 1007 en 1119) bevat polymorfonucleaire cellen (PMN) en onderste band (onder 1119) bevat RBC.
7. Verzamel de MNC en PMN afzonderlijk door steriele glazen pipetten zonder verstoring van de andere cel bands. Combineer de MNC bevolking van elke buis in een steriele 50 ml conische buis. Herhaal dit voor de PMN bevolking ook.
8. Voeg 4 volumes RPMI aan elke buis met de MNC en PMN fracties respectievelijk de dichtheidsgradiënt verdunnen.
9. Centrifugebuizen bij 700 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
10. Resuspendeer MNC celpellet en PMN celpellet in 1 ml RPMI met 0,5% ultrazuiver vetzuurvrij BSA (RPMI-BSA) en overbrengen in steriele 1,5 ml buizen. Pellet de cellen met behulp van een tafelmodel picofuge voor 30seconde
11. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke cel pellet in 80 ul RPMI-BSA.
12. Voeg 20 ul van magnetische bead-gemerkte antiCD14 antilichaam aan de buis met de MNC fractie voor positieve selectie van monocyten. Voor de buis met de PMN celfractie, voeg 20 ul van magnetische bolletje gelabeld-antiCD15 antilichaam voor positieve selectie van neutrofielen. Incubeer elke celsuspensie gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
13. Was beide celsuspensie met 1 ml RPMI-BSA media en pellet voor en resuspendeer elke pellet in 500 ui RPMI-BSA.
14. De gelabelde cellen worden gescheiden in het magnetische veld van de magnetische geactiveerde celsortering (MACS) separator. De MACS LS kolom (een voor elke celsuspensie) Bereid door het plaatsen van de kolom MACS afscheider en wassen met 3 ml RPMI-BSA vóór toevoeging van de celsuspensie.
15. Na het aanbrengen van celsuspensies, wassen elke kolom 3x met 3 ml RPMI-BSA media (zorg ervoor dat u laat de media drain geheel tussen de wasbeurten). Verzamel de celsuspensie doorstroming en kolom wast in een steriele buis.
16. Om monocyten en neutrofielen isoleren, verwijder de kolom uit het magnetische veld na de laatste wassing en elueer de positief geselecteerde cellen in een steriele buis met 5 ml RPMI-BSA via de kolom plunjer.
17. Isoleren lymfocyten pellet de doorstroom-wasfractie van de MNO uit stap 1,15 bij 300 xg gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 80 ul RPMI-BSA. Voeg 20 ul van CD61 en CD235a antilichamen en incubeer celsuspensie gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Herhaal de MACS scheiding als voorheen en het verzamelen van de stroom al met de lymfocyten.
18. Om monocyten, neutrofielen en lymfocyten fracties, centrifuge pellet als voorheen (stap 1.9) en gooi supernatant. Celpellets moet worden gesuspendeerd in 1 ml extracellulaire flux media (XF-DMEM) voor het tellen.
    Opmerking: 8 ml volbloed moet resulteren in 1-5 x 10 ⁶ monocyten / ml en 5-20 x 10 ⁶ lymfocyten en neutrofielen / ml.
19. Bloedplaatjes, centrifuge PRP (stap 1.2) isoleren gedurende 8-10 minuten bij 1500 xg bij kamertemperatuur. Verwijder het plasma en was celpellet eenmaal met 5 ml steriele PBS aangevuld met 1 ug / ml _PGI2, repellet en schorten uiteindelijke pellet in 1 ml PBS-buffer BGA _2.
20. Bepaal bloedplaatjes door turbidimetrie als de bloedplaatjes in PBS-buffer BGA ₂ worden opgehangen spectrofotometer zoals beschreven door Walkowiak et al. met de volgende vergelijking: [6,23 / (2,016 - Abs _800)] - 3.09 x verdunningsfactor = # x 10 ^8. bloedplaatjes / ml ^12.

2. Beplating van de cellen

1. Voorbereiding van de Cell-Tak (cel lijm): Voeg 90 ul cel lijm tot 180 ul DiH ₂ 0, 540 pl van 0,1 N natrium bicarbonaat (pH 8,0), en de pH op 7,2-7,8 ​​met 1 N NaOH. Bereid XF platen (24-well, V7 microplates) door het bekleden van elk putje met 30 pi van bereide cel lijm.
   Opmerking: De cel lijm moet vers voor elk gebruik worden voorbereid.
2. Incubeer plaat bij 37 º C gedurende 20-30 min. vervolgens aspireren cel lijm en was putten met PBS twee keer (1 ml / putje).
3. Voer een celgetal op geïsoleerde monocyten, lymfocyten, neutrofielen en bloedplaatjes en breng aan de juiste volume met XF-DMEM een seeding dichtheid van 250k cellen / putje zorgen voor monocyten, lymfocyten en neutrofielen, en 25 x 10 ⁶ / goed voor bloedplaatjes. Als alternatief voor oxidatieve burst respons te meten, neutrofielen kunnen worden gezaaid met 125k cellen / well. Het uiteindelijke zaaien volume voor elke celsuspensie moet 200 pl / putje is.
4. Centrifugeer de plaat bij 200 xg gedurende 1 sec zonder rem. Draai de plaat 180 ˚ en centrifuge opnieuw zonder rem bij 300 x g.
5. Breng definitief goed volUME 660 ul DMEM met XF-en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min voor XF assay. Opmerking: Microfoto van geplateerde cellen voor en na de test kan worden gebruikt om adequate plateren waarborgen en sluiten cel onthechting.

3. Bereiding van een 24-wells extracellulaire Flux assayplaat (XF24)

1. Hydrate XF probes met kalibratieoplossing ten minste 2 uur voorafgaand aan analyse.
2. Bereid 10x voorraden van 0,5 pg / ml oligomycin, 0,6 uM FCCP, en 10 uM antimycine A in XF-DMEM en de belasting 75 ul van voorraad-oplossingen in cartridge injectie poorten in bovenstaande volgorde. Indien oxidatieve burst metingen te verkrijgen, kan injectie van 10x voorraad van 100 ng / ml PMA worden geïnjecteerd na antimycine-A.
3. Kalibreer de gehydrateerde en geladen cartridge en voer de XF assay. De gedetailleerde methoden voor analyse en interpretatie van zowel het zuurstofverbruik en pH-veranderingen zijn beschreven in eerdere publicaties ^9,13,14 en worden niet discussed hier in detail.
4. Na XF assay, zuigen alle, maar de laatste 50 ul van XF-DMEM na test om het verlies van cellen te voorkomen dat de plaat en voeg 50 ul RIPA cellysisbuffer en uitvoeren van een proteïne test voor normalisatie.

Resultaten

Om de bio-energetica van bloedcellen kunnen beoordelen, wordt volbloed dat bij menselijke proefpersonen door venapunctie in een EDTA-of ACD vacutainer collectie buis. De isolatie van leukocyten en bloedplaatjes na bloedafname wordt gevisualiseerd in figuur 1A zoals beschreven in het protocol. Hele bloedmonsters worden binnen 8 uur van collectie naar celdood en activering te voorkomen. Langdurige opslag keer groter dan 8 uur zijn niet getest, maar kan resulteren in gewijzigde bio-energetica en minder representatief zijn voor fysiologische omstandigheden. Zuur citraat dextrose (ACD-8 ml) en EDTA Vacutainer buisjes zijn gebruikt voor mobiele isolaties geen waarneembaar effect op de bio-energetische functie van geïsoleerde cellen. Anticoagulantia zijn nodig omdat stolsels verminderen het aantal cellen verkregen interfereren met de juiste fase formatie tijdens Ficoll gradiënt centrifugatie en resulteren in weinig tot geen bloedplaatjes verkregen serum gecentrifugeerd. Alle bloed is een biological gevaar en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen moeten gedurende de gehele procedure, ook na celpopulaties worden geïsoleerd of cellysaten worden gegenereerd worden uitgevoerd. Monsters moeten worden afgevoerd in overeenstemming met de menselijke normen van de instelling afvalverwijdering.

Volbloed wordt gecentrifugeerd om de bloedplaatjes rijke plasma gescheiden van de bufferlaag, de witte laag boven de rode bloedcellen die leukocyten bevat. De bufferlaag wordt toegepast dichtheidsgradiënten en gecentrifugeerd om de perifere mononucleaire cellen (monocyten en lymfocyten) en polymorfonucleaire cellen (granulocyten) te verkrijgen. RBC verontreiniging van de individuele MNC en PMN mobiele fase is gebruikelijk in dit stadium tijdens de MACS zuivering worden opgelost. De verschillende celtypen worden dan verkregen door incubatie met magnetische antilichamen zuivere fracties te verkrijgen. Monocyten worden verzameld door incubatie van de PBMC-fractie met CD14, de doorstroming van thij Monocyten bevatten lymfocyten, die vervolgens worden uitgeput van RBC en bloedplaatjes. De neutrofielen worden verkregen door incubatie van de polymorfonucleaire cellaag met CD15 antilichaam (Figuur 1A). Daarna kan de bloedplaatjes worden gepelleteerd door centrifugeren van het bloedplaatjes rijke plasma en gewassen met ander plasma componenten te verwijderen. Na deze selecties van de bloedplaatjes, CD14 + monocyten, lymfocyten, CD15 + neutrofielen kunnen worden geteld en uitgeplaat op een cel adhesie-medium gecoat XF analyzer plaat voor bio-energetica en oxidatieve burst analyse.

Elke fase van de procedure moet worden uitgevoerd in steriele omstandigheden en wordt aangemoedigd om de voortijdige activering van de oxidatieve burst respons in monocyten en neutrofielen te voorkomen. Een indicator van minder dan steriele omstandigheden tijdens de isolatie is duidelijk wanneer neutrofielen, die weinig tot geen zuurstofverbruik hebben onder basale omstandigheden, beginnen de extracellulaire flux test met verhoogde OCR metingen diegeleidelijk toenemen of afnemen gedurende de test. We benadrukken het belang van het afbeelden van cellen met behulp van lichtmicroscopie bij 200X of hoger zodat geen morfologische tekenen van activatie vóór de test hebben voorgedaan. Bijvoorbeeld, neutrofielen normaal wordt afgerond tot een onregelmatige vorm met uitgesproken cel grenzen zoals getoond in figuur 1B. Echter, deze cellen plat tegen het oppervlak van de plaat wanneer geactiveerd en verliezen hun onderscheidende celmorfologie. We hebben eerder gemeld de morfologische veranderingen van geactiveerde leukocyten en bloedplaatjes met dit protocol en aanvullende maatregelen moeten worden genomen om steriele omstandigheden of ondervindt activatie ^8.

Een vereenvoudigd schema van het protocol is te zien in figuur 2 als een tijdschema waarin de belangrijkste stappen van de cel isolatie, XF plaat voorbereiding en XF assay zijn gedetailleerd. Isolatie uit de dichtheid gradiënt scheiding van celtypes engevolgd door magnetische scheiding. Parallel aan de celisolatie proces, XF plaat voorbereiding is noodzakelijk om vertragingen in cel plating of het begin van de XF-test te vermijden. Dit is essentieel omdat aanzienlijke vertragingen kan leiden tot cel activatie en verminderde bio-energetica parameters.

Onvoldoende celconcentraties na isolatie is een veelvoorkomend probleem en optimaliseren van elk centrifugatiesysteem moet celverlies voorkomen. Succesvolle isolaties werden uitgevoerd op slechts 6 ml bloed, maar wijzigingen aangebracht kunnen worden afhankelijk van circulerende concentraties van het gewenste celtype. Als de dichtheid gradiënt niet goed is voorbereid, kan verschillende mobiele fasen niet zichtbaar zijn en het verlies van cellen kunnen optreden (zie Jupiter instructie video voor een visuele demonstratie). Onvoldoende bloedplaatjes geïsoleerd van de PRP is zeldzaam, maar heeft voorgedaan als wassen buffer niet _PGI2 bevatten of indien de isolatie neemt onder kamertemperatuur plaats. Het risico van een bloedplaatjesctivation vaak voorkomen als bloedplaatjes de laatste cellen worden geïsoleerd, maar als bloedplaatjes blijven wasbuffer langdurig de bio-energetica worden beïnvloed. Er zijn gevallen van kleinere bloedplaatjes bevolkingsgroepen die niet pellet tijdens de 1500 xg centrifugeren en de bio-energetica van deze cellen niet uitgebreid gekarakteriseerd geweest. Zie tabel 2 voor een meer complete handleiding voor probleemoplossing.

De bio-energetische profielen van leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden bepaald met de XF analysator real time O ₂ consumptie in cellen meet invasief. Elk celtype wordt uitgeplaat op XF24 plaat met vijf herhalingen zoals in de figuur 3A. Tabel 1 geeft de verwacht basale en oxidatieve burst waarden door celtype tijdens de test en de gemiddelde concentraties eiwit per putje. Hogere doorvoer technologieën beschikbaar, zoals de XF96, die zorgt voorvier donoren om gelijktijdig te worden beoordeeld als getoond in figuur 3B. Na de test worden de gegevens geëxporteerd naar een werkplek computer voor analyse met de juiste XF en Microsoft Excel. De OCR waarden werden genormaliseerd aan totale eiwitten in de overeenkomstige putjes en uitgedrukt als pmol / min / mg eiwit. De vertegenwoordiger van de bio-energetische-oxidatieve uitbarsting profielen van elk celtype werden onlangs gemeld door onze groep ^8. Verdere analyse van bio-energetische parameters van de test (basale, ATP-gebonden, proton lek, maximale, nonmitochondrial en oxidatieve burst) kan worden berekend voor afzonderlijke putjes zoals eerder getoond en hieronder beschreven ^8.

De basale zuurstof verbruik (OCR) wordt door de eerste 3 metingen zoals getoond in figuur 4A. Oligomycin (0,5 ug / ml), een remmer van mitochondriale ATP-synthase wordt geïnjecteerd in de XF medium te schatten OCR gekoppeld ATP synthese en vertegen ted ATP verbonden. De resterende OCR minus de nonmitochondrial OCR kan worden toegeschreven aan proton lek. Dan FCCP een ontkoppelaar toegevoegd bepalen de maximale OCR, gevolgd door antimycine-A, een remmer van mitochondriale ademhaling, om nonmitochondrial bronnen zuurstof verbruik te bepalen. Reservecapaciteit is een maat voor de hoeveelheid ATP die onder energieke vraag kan worden geproduceerd en kan worden berekend als het verschil tussen de maximale snelheid van de ademhaling en de basale. Om de oxidatieve burst capaciteit bepalen, forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) een PKC agonist wordt geïnjecteerd om de NADPH-oxidase activiteit verhogen, en de toename van zuurstofverbruik tarief voor PMA stimulatie kan worden gemeten met de XF analysator. Figuur 4B laten zien hoe de verschillende parameters van de mitochondriale functie en oxidatieve burst berekenen.

1301/51301fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg "/>
Figuur 1. Isolatie van leukocyten en bloedplaatjes uit volbloed. A) Vers verzamelde monsters worden in hun plasma en cellulaire componenten door centrifugeren gescheiden en gezuiverd door Ficoll dichtheid en Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) door positieve (monocyten en neutrofielen) of negatieve selectie (lymfocyten), terwijl de bloedplaatjes worden geïsoleerd door hoge snelheid centrifugeren van de bloedplaatjes rijke plasma. B) afbeeldingen van de geïsoleerde celpopulaties eenmaal geresuspendeerd in DMEM XF en vergulde bij bepaalde cel dichtheden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg "/>
Figuur 2. Voorbereiding van de XF24 platen voor Bioenergetic studies van leukocyten en bloedplaatjes. Gedetailleerde tijdlijn voor de bereiding van een XF24 assayplaat door cel isolatie en beplating en cartridge hydratatie en inspuitpoort laden.

Figuur 3. Lay-out van leukocyten en bloedplaatjes op XF24 en XF96 analyzer platen. A) Leukocyten (125-250k cellen / well) en bloedplaatjes (25 x 10 ⁶ cellen / putje) van een enkele donor worden uitgeplaat op de XF24 assayplaat onder achtergrond controles. 75 pl 10x voorraden oligomycin (0,5 ug / ml), FCCP (0,6 uM), antimycine-A (10 uM) en PMA (100 ng / ml) verdund in XF media in geladende aangegeven injectiepoorten. B) Leukocyten (75-150k cellen / putje) en plaatjes (10 x 10 ⁶ cellen / putje) van maximaal vier donoren worden uitgeplaat op XF96 in een totaal volume van 180 ul DMEM-XF. 20 ui 10x voorraden oligomycin (1,0 ug / ml), FCCP (0,6 uM), antimycine-A (10 uM) en PMA (100 ng / ml) verdund in DMEM-XF worden geladen in de aangegeven injectiepoorten.

Figuur 4. Analyse van Bioenergetic indices. A) Vertegenwoordiger spoor van zuurstof verbruik (OCR) van mitochondria en oxidatieve uitbarsting van monocyten. Basale OCR is vastgesteld (eerste 3 prijzen aangeduid met getallen in cirkels). Dan opeenvolgende toevoegingen van oligomycin (O, 0,5 ug / ml), FCCP (F, 0,6 uM) en antimycin-A (A, 10 uM) worden geïnjecteerd om mitochondriale en nonmitochondrial ademhaling van niet-geactiveerde cellen te bepalen. Tenslotte PMA (100 ng / ml) wordt toegevoegd aan oxidatieve burst. Maatregel B) Modulaire analyse van mitochondriale functie en oxidatieve burst wordt berekend door de verschillen in zoals aangegeven.

	Optimale entdichtheid	Gem. Basale OCR (pmol O 2 / min)	Gem. Oxidatieve Burst OCR (pmol O 2 / min)	Gem. eiwit (pg) / goed
Monocyten	250k cellen / well	83,9 (± 13,0)	300.3 (± 58,8)	19,0 (± 2,4)
neutrofielen	250k cellen / well	6,1 (± 2,2)	1411,8 (± 233.3)	20,6 (± 2,7)
Lymfocyten	250k cellen / well	52,9 (± 7,7)	15 (± 4,1)	13.2 (± 2.1)
Bloedplaatjes	25 x 10 6 cellen / putje	199.4 (± 20,3)	24 (± 2,7)	47,5 (± 3,1)

Tabel 1. Normale parameters voor de XF24 assay: De gemiddelde basale (Rate 3) en oxidatieve burst (Rate 7) OCR niet gecorrigeerd naar nonmitochondrial OCR of eiwit worden getoond door celtype uitgezet bij de aangegeven cel dichtheden. De gemiddelde eiwitgehalte per putje wordt uitgevoerd door een DC Lowry assay. Deze gegevens geven de gemiddelde waarden van6-8 gezonde donoren met haakjes bevatten ± SEM.

Stap	Probleem	Mogelijke oorzaak	Oplossing
1.2	duidelijk plasma	bloedplaatjes pellet tijdens centrifugeren	tot 10 min of langzaam tot 400 xg verlagen centrifugeertijd
	melkachtige plasma	overmaat lipiden	voorkomen postprandiale collectie
1.6	incomplete cel bands gevormd	kaboutertouwslager gradiënt voorbereiding, koude reagens	niet te verstoren gradiënt tijdens pipetteren, gebruik kamertemperatuur reagens
	klonten in cel bands	stolling van het bloed kan hebben plaatsgevonden	Verzamel bloed met behulp van anticoagulantia zoals ACD of EDTA
1.10	geen mobiele pellet	zie stap 1.6	Als bovenstaande wazig zie hieronder
	wazige supernatant	Zware Ficoll gradiënt besmetting besmetting bloedplaatjes	Verhoog centrifugeersnelheid tot 900 xg, diluit met meer RPMI
1.16, 1.17	lage opbrengst van leukocyten	RBC zware vervuiling, niet genoeg volbloed, stolling	Dubbele antilichaam en RPMI-BSA volumes, verzamel meer bloed, voeg antistollingsmiddel
1.19	bloedplaatjesaggregatie	BGA 2 weggelaten, blootstelling aan koude media, langdurige opslag in plasma	toevoegen PGI2 aan bloedplaatjes wasbuffer, gebruik kamertemperatuur reagentia
1.20	laag aantal bloedplaatjes	verlies tijdens primaire centrifugeren, de aggregatie van bloedplaatjes	Zienstappen 1.2 en 1.19
2.3	RBC besmetting		Herhaal MACS scheiding

Tabel 2. Leukocyten en bloedplaatjes isolement oplossen van problemen. Tabel geeft voorkomende problemen tijdens leukocyten en bloedplaatjes celisolatie uit volbloed en oplossingen die gebruikers kunnen begeleiden door het proces van probleemoplossing.

Discussie

Dit protocol geeft de compilatie van meerdere technieken vaak gebruikt voor bloedcel isolatie op een wijze die geschikt is voor bio-energetica analyse. De aangrenzende technieken die voordelig voor andere isolatiemethoden (bijvoorbeeld FACS-analyse) voor hun vermogen om grote aantallen cellen te isoleren in gecontroleerde media omstandigheden met minimale spanningen die op de geïsoleerde cellen. Het heeft het nadeel van langdurige isolaties, zelfs met minimale onderbrekingen. Dit protocol dient als basis voor de isolatie van primaire bloedcellen van proefpersonen, die kan worden geëxtrapoleerd naar klinische instellingen en translationeel onderzoek.

MACS scheiding betrouwbaar celisolatie techniek die het mogelijk isoleren van cellen uit bloed heeft, maar vereist deze werkwijze grotere hoeveelheden antilichaam en niet optimaal is voor de isolatie van vier verschillende celtypes zoals beschreven in deze werkwijze. Er heeft bEEN geen bewijs om aan te tonen dat de positieve selectie van leukocyten door MACS scheiding resulteert in de activering met behulp van onze isolatie-protocol. MACS kolommen functioneren van sekwestratie van gelabelde cellen in een magnetisch veld met behulp van antilichamen geconjugeerd aan 50 nm superparamagnetische deeltjes. Gelabelde cellen worden vervolgens geëlueerd uit de kolom. Positieve en negatieve selecties zijn geïmplementeerd in dit protocol om snelle isolatie en zuiverheid garanderen. Indien onvoldoende aantal cellen verkregen uit geïsoleerd of zuiverheid betrokken, kan meer antilichamen aan het monster worden toegevoegd volgens de instructies van de leverancier en de tweede doorgang door de kolom LS kan leiden tot een grotere zuiverheid (Tabel 2). Ons laboratorium gevonden hoge zuiverheid en plating efficiëntie met behulp van het bestaande protocol door het analyseren finale celsuspensies door FACS-analyse ^8.

Extracellulaire flux analysers hebben de mogelijkheid om zowel het zuurstofverbruik en media verzuring in real time boven dat van othaar elektroden. Het zuurstofverbruik zoals waargenomen door de oxidatieve burst respons in monocyten en neutrofielen is NADPH oxidase afhankelijk zoals aangetoond door remming met DPI ^8. We hebben een tijdsafhankelijke verlies in oxidatieve burst capaciteit langdurige isolatie of uitgebreide XF assays gezien. Dit protocol werd ontworpen en ontwikkeld voor gebruik op XF24 maar is ook compatibel met de XF96 ongeveer eenderde tot de helft van de XF24 cel zaaien dichtheden (figuur 3).

In het ontwerp van dit protocol, is de naleving van de bestaande protocollen voor elke techniek die nodig is voor optimale prestaties met wijzigingen uitsluitend media voorwaarden voor bio-energetische analyse te beheersen. Na het beheersen van technieken, kan een dergelijk protocol worden gebruikt in een breed scala aan translationeel en wetenschappelijke toepassingen om de toxiciteit of effectiviteit van de behandeling strategieën te meten, onderzoeken metabole kenmerken van de ziekte, en oxidant productie door monocyten en neutrophils in inflammatoire aandoeningen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-094-833
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-501
CD61 MicroBeads, human  voor bloedplaatjes	Miltenyi Biotec	130-051-101
CD14 MicroBeads, human  voor monocyten	Miltenyi Biotec	130-050-201
CD15 MicroBeads, human  voor granulocyten	Miltenyi Biotec	130-046-601
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
BD Vacutainer ACD Bloedopvangbuisjes	Fisher	02-684-26
RPMI 1640	Gibco	11835-030	met L-glutamine en zonder fenolrood
Prostaglandine I2, natriumzout	Cayman	18220
1,5 ml semi-micro cuvettes	Phenix Research Products	SC-2410
Histopaque dichtheidsgradiënt, specifiek gewicht 1,077	Sigma	10771
Histopaque dichtheidsgradiënt, specifiek gewicht 1,119	Sigma	11191
Bovine Serum Albumine Fractie V	Roche	3117405001	vetzuur ultra-vrij
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat	Sigma	P8139
XF24 FluxPak	Seahorse Biosciences	100850-001
DMEM	Fisher	MT90113PB	zonder glucose, L-glutamine, Pyruvaat, Fenolrood en Bicarbonaat
L-Glutamine, 200 mM (100x)	Invitrogen	25030-081
D-Glucose	Sigma	G7528
Natriumpyruvaat	Sigma	P8574
Cell-Tak (celkleefmiddel)	BD Biosciences	CB-40242
Oligomycin	Sigma	O4876
Antimycine A	Sigma	A8674
(FCCP) Carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy)fenylhydrazon	Sigma	C-2920
DC Protein Assay Reagens A	Bio-Rad	500-0113
DC Protein Assay Reagens S	Bio-Rad	500-0015
DC Protein Assay Reagens B	Bio-Rad	500-0114
Seahorse	Seahorse Biosciences
QuadroMACS Separator en MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-090-976 en 24039
Spectrofotometer