Multiplex testen kunnen nuttige informatie verschaffen voor basis cellulaire mechanismen en elimineren van verspilling van reagentia en onnodige herhaalde experimenten. We beschrijven hier een multiplex caspase-3/7 activiteit test, met fluorescerende-en-luminescente gebaseerde methoden, levensvatbaarheid van de cellen bepaald in een in vitro model hypothalamus na oxidatieve uitdaging palmitinezuur.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De mogelijkheid om multiplex assays in studies van complexe cellulaire mechanismen elimineert de noodzaak voor herhaalde experimenten, verschaft interne controles en vermindert afval kosten en reagentia. Hier beschrijven we optimalisatie van een multiplex assay apoptose beoordelen na een palmitinezuur (PA) uitdaging in een in vitro model hypothalamus, waarbij zowel fluorescerende en luminescerende gebaseerde bepalingen om levensvatbare cellen en caspase-3/7 te meten in een 96 putjes microtiterplaatformaat. Na PA uitdaging, werden levensvatbare cellen bepaald door een-resazurin gebaseerde fluorescentie. Caspase-3/7 activiteit werd vervolgens bepaald met een luminogenic substraat, DEVD en genormaliseerd naar het aantal cellen. Dit multiplexing test is een nuttige techniek voor het bepalen van veranderingen in caspase activiteit na een apoptotische stimulus, zoals verzadigde vetzuren uitdaging. De verzadigde vetzuren PA kan verhogen hypothalamus oxidatieve stress en apoptose, met vermelding van de mogelijke invoernce assays zoals beschreven hier bestuderen van verbanden tussen verzadigde vetzuren en neuronale functie.
Inleiding
Diëten rijk aan verzadigde vetzuren zoals palmitinezuur (PA) zijn verbonden met obesitas en andere comorbiditeiten, waaronder cardiovasculaire ziekte en diabetes 1, 2. Vetrijke diëten hebben ook aangetoond dat oxidatieve stress, apoptose en neuronale degeneratie in de hypothalamus, een belangrijke regulator van de eetlust en het energieverbruik verhogen 3-7. Inzicht in het mechanisme waardoor blootstelling vetrijke dieet induceert hypothalamus ontregeling is dus belangrijk voor de ontwikkeling van farmacologische behandelingen voor zwaarlijvigheid. Echter, de cellulaire mechanismen waardoor vet in de voeding van invloed op neuronale functie blij....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Plating en onderhoud van Cultuur van de Cel
- Warm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) cultuur media (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine / Neomycine) tot 37 ° C.
- Verkrijgen voorraad van bevroren A12 cellen van -80 ° C.
- Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad; eenmaal ontdooid, zachtjes pipet cellen over te dragen aan een 75 cm 2 geventileerde kolf en voeg 10 ml van de cultuur media.
- Incubeer kolf overnacht in 5% CO 2 incubator bij 37 ° C. Zuig media na 24 uur en te vervangen door vers medium. Blijven groeien cellen tot 70-80% confluentie verkregen (2-3 dagen groei).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het protocol hierboven beschreven resultaten multiplexing twee assays mechanismen van celdood bepalen. Figuur 1 toont een overzicht van het protocol levensvatbaarheid van de cellen en caspase-3/7 activiteit te bepalen. Caspase activiteit significant verhoogd in cellen geprikkeld met PA na 2 uur incubatie (Figuur 2A en tabel 1). Verlies van celmembraanintegriteit een morfologische verandering geassocieerd met de inductie van apoptose, die zichtbaar is in cellen na 2 uur .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De multiplex test is een algemeen aanvaarde techniek die is gebruikt door wetenschappers in talrijke toepassingen zoals PCR microarrays, immunodetectie en andere op eiwit gebaseerde detectiemethoden 13, 14. Onlangs hebben multiplexing assays steeds gebruikt in in vitro-plaat gebaseerde experimenten en zijn gevalideerd als een nauwkeurige methode om de cytotoxiciteit en de levensvatbaarheid 12. In het bovenstaande protocol, we tonen de effectiviteit van multiplexing TL-en lichtgeve.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Het hier beschreven onderzoek werd gefinancierd door het Amerikaanse Department of Veterans Affairs Biomedische Laboratorium Onderzoek en Ontwikkeling BX001686-1A1 en VA Revalidatie Onderzoek en Ontwikkeling.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
Referenties
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
