Drie dimensionaal culturen: Een hulpmiddel om te studeren Normaal Acinaire Architectuur versus maligne transformatie van cellen borst

Samenvatting

Drie dimensionale cultuur van mammaire epitheelcellen op een gereconstitueerde basaalmembraan is een handige methode om de in vivo architectuur van de goedaardige borst herhalen, en het maligne fenotype onderscheiden van goedaardige borst fenotype. Belangrijk is dat dit systeem worden toegepast invasieve carcinomen studie in weefsels.

Samenvatting

Invasieve borstkankers zijn een groep van kwaadaardige epitheliale tumoren worden gekenmerkt door de invasie van aangrenzende weefsels en neiging tot metastaseren. Het samenspel van signalen tussen kankercellen en hun micro-omgeving oefent een krachtige invloed op de groei van borstkanker en biologisch gedrag ^1. De meeste van deze signalen uit de extracellulaire matrix verloren of hun relevantie onderbestudeerd wanneer cellen worden gekweekt in cultuur tweedimensionale (2D) als een monolaag. De laatste jaren heeft driedimensionale (3D) kweek op een gereconstitueerde basaalmembraan voren gekomen als een voorkeurswerkwijze voor de weefselarchitectuur van goedaardige en kwaadaardige borstcellen recapituleren. Cellen gekweekt in 3D behoudt de belangrijkste signalen van de extracellulaire matrix en een fysiologisch relevante ex vivo systeem ^2,3. Van de nota, is er steeds meer aanwijzingen dat de cellen zich anders gedragen wanneer ze groeien in 3D in vergelijking met 2D ^4. 3D cultuureffectief kan worden gebruikt als middel om het kwaadaardige fenotype onderscheiden van goedaardige borst fenotype en onderbouwing van de cellulaire en moleculaire signalering betrokken ^3. Een van de onderscheidende kenmerken van goedaardige epitheliale cellen is dat ze gepoold zodat de apicale cytoplasma naar het lumen en de basale cytoplasma rust op het basale membraan. Dit apico-basale polariteit verloren invasieve borstkankers, die worden gekenmerkt door cellulaire desorganisatie en vorming van anastomose en vertakkende buisjes die willekeurig infiltreert de omliggende stroma. Deze histopathologische verschillen tussen goedaardige klier en invasief carcinoom kan worden gereproduceerd in 3D ^6,7. Met de juiste uitlezingen zoals de kwantificering van ronde acinaire structuren of differentiële expressie van gevalideerde moleculaire markers voor celproliferatie, polariteit en apoptose in combinatie met andere moleculaire en celbiologie technieken, 3D cule kan een belangrijk instrument om beter inzicht in de cellulaire veranderingen tijdens maligne transformatie en voor de afbakening van de verantwoorde signalering te bieden.

Inleiding

Driedimensionale cultuur (3D) van borst epitheelcellen op gereconstitueerde basale membraan is een belangrijk modelsysteem om de complexe fenotype en de bijbehorende signalering van normale borst en borstkanker ^2,3 bestuderen. De functionele eenheid van borst is de terminal kanaal lobulaire eenheid (TDLU) die bestaat uit een kleine buis die zich vertakt in acini. De acini zijn zeer georganiseerde structuren, bestaande uit twee cellagen, epitheliale en myo cellen, die worden omgeven door een basale membraan ^5. De meest onderscheidende kenmerken van normale acini zijn cellulaire polarisatie, bevestiging aan de onderliggende basale membraan en gespecialiseerde cel-cel contacten. Dit ingewikkelde organisatie is verstoord bij invasieve carcinomen. De gebruikte 2D culturen, waarbij cellen worden gekweekt als monolagen, niet mogelijk de vorming van acini. Aldus wordt de monolaagkweek ontbreekt verschaffen van een systeem om de complexe relatie tussen epitheelcellen vangenin normale borst en de deregulering bij borstkanker. Functionele monotypisch epitheliale culturen van borstcellen ontwikkeld in verschillende laboratoria ^2,3. 3D cultuur behelst de groei van borstkanker cellen op Matrigel, een oplosbaar extract uit Engelbreth-Holm-Swarm muizen sarcoma cellen en is commercieel verkrijgbaar. Andere 3D substraten zoals collageen I worden gebruikt. De borst cellen kunnen in 3D worden gekweekt door 3D ingebed assay, waarbij cellen gekweekt ingebed in Matrigel ^2. Als alternatief kunnen de cellen worden gekweekt door 3D bovenop test, ook wel 3D-overlay-test, die is kosteneffectief als het vereist minder volume van Matrigel, en vergemakkelijkt time lapse monitoring van de kolonie de vorming van fase contrast beeldvorming en is ideaal voor in situ imaging ^{2 -3.} De 3D bovenaan assay werd gebruikt om de correlatie tussen de acinaire fenotype en genexpressieprofiel ⁷ definiëren.

3D cultuur kan worden effectivEly gebruikt om normale en goedaardige cellen onderscheiden van invasief carcinoom. Normale en goedaardige borst cellen vormen groei gearresteerd gepolariseerde structuren met een goed gedefinieerde lumen in het centrum op Matrigel terwijl invasief carcinoom cellen groeien overvloedig en lukraak, zonder verrekening van het lumen. E6/E7 onsterfelijke, menselijke borstklieren epitheliale cellen en MCF10A cellijn, dat is een spontaan vereeuwigd cellijn geïsoleerd uit een 36-jarige patiënt met fibrocystische veranderingen, zijn met succes gebruikt om de goedaardige borst fenotype heroveren in 3D ^3,8 en hebben gediend als een modelsysteem voor de oncogene en tumor suppressor functie van verschillende moleculen ^8,9 bestuderen. Deze goedaardige cellen kunnen worden ontworpen om gen (en) plaats manipuleren door introductie van lentivirus / retrovirus. Als het gen (en) van belang is een tumor suppressor, zal shRNA gemedieerde knockdown leiden tot een maligne transformatie terwijl als het betreffende gen is een oncogen overexpressie in goedaardige cellenmoet een maligne fenotype. In beide gevallen is de acinar structuren gevormd in 3D kan het maligne transformatie vast te leggen.

Goedaardige enkele cellen uitgeplaat in 3D beginnen te groeien en vormen ronde bolvormige structuren. Overdag 5-8 deze bolvormige aggregaat van cellen differentiëren in een omringende gepolariseerde laag van cellen die in contact met de Matrigel, en een binnenste massa van minder gepolariseerde cellen, die contact met de Matrigel ontbreekt. In de komende 10-15 dagen zal de binnenste cellen beginnen te sterven door apoptose het vormen van een duidelijk lumen. De kwaadaardige cellen groeien lukraak verlies van hun polariteit. Zeer kwaadaardige cellen vormen meestal vertakkende structuren. Deze verschillen in fenotype kan worden opgevangen door tijdsverloop fase contrast beeldvorming en door in situ immuunkleuring met relevante moleculaire merkers. De meest gebruikte merkers zijn alfa 6-integrine, een basale polariteit marker, in combinatie met de proliferatie merker fosfo-histon 3 en apoptotic marker gekloofd caspase-3. Dit laatste is belangrijk om te bepalen of er lumen formatie in het midden van de acini, een kenmerk van normale en goedaardige borstcellen. Andere polariteit en cel-cel contact merkers omvatten GM130, laminin, ERM, E-cadherine. Afwisselend borstkanker cellijnen kunnen worden ontworpen om het gen van belang te manipuleren. In dit geval terugkeer tot een groei opgepakt kunnen goedaardig fenotype worden gebruikt als een uitgelezen te onderscheiden van het kankerfenotype.

3D cultuur kan zorgvuldig worden gebruikt om de signalerende wegen betrokken bij maligne transformatie ^10-11 bakenen. Met behulp van bovenstaande uitlezingen, farmacologische remmers blokkerende antilichamen of recombinante eiwitten kunnen gebruikt worden wijzen op moleculair signalering leidt tot maligne transformatie. Met voortdurende inspanning van verschillende laboratoria is het mogelijk om de cellen extraheren van 3D RNA isoleren en ook lysaten voorbereiden immunoblotting en immunoprecipitation. Deze strategieën zijn beschreven stapsgewijs en gedetailleerd in het protocol.

Protocol

1. Voorbereiding van Materialen en Cultuur Media

1. Dooi groeifactor gereduceerd (GFR) Matrigel bij 4 ° CO / N.
2. Warming-up compleet media voor nodig cellijn bij 37 ° C. MCF10A-ATCC gespecificeerde media; HME-Ham's F-12 medium aangevuld met 5% foetaal runderserum, 1 ug / ml hydrocortison, 5 ug / ml insuline, 10 ng / ml epidermale groeifactor, en 100 ng / ml choleratoxine; SUM149-Ham's F-12 medium aangevuld met 5% FBS, 2 ug / ml hydrocortison en 5 ug / ml insuline; en MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
3. Precool een 8-well kamer glijbaan op ijs.
4. Bereid weefselkweek kap en benodigdheden.

2. Driedimensionale cultuur in 8-well Kamer Slide

1. Coat elk putje van de 8-goed glijbaan met 40 ul van GFR Matrigel. Voeg de Matrigel in het midden van de schuif en spreid met een P200 pipetpunt. Probeer zo gelijkmatig mogelijk verdeeld, het vermijden van bubbels en een vleugel die kan leiden totmeniscus formatie.
2. Incubeer de glaasjes bij 37 ° C onder 5% _CO2. Terwijl de Matrigel wordt stollen, trypsinize de cellen, te verzamelen en te draaien op 150 xg in weefselkweek centrifuge gedurende 4 minuten.
3. Tel de cellen en verdun tot 12.500 cellen / ml in compleet medium van de betreffende cellijn. Voeg GFR Matrigel tot 2% en voeg 400 ul aan elk putje van een Matrigel voorgelakt kamer dia.
4. Incubeer de glaasjes in de CO ₂ incubator. Geef verse complete media verandert elke 4 ^e dag tot 15 dagen.
5. Behandeling met farmacologische remmers: Voor remmer studies commentaar kleine molecule inhibitoren complete media op het uitplaten gevolgd door vers medium aangevuld met veranderingen remmers drie dagen, terwijl het kweken van de cellen op Matrigel GFR.
6. Behandeling met gezuiverde eiwit:
   1. Plate de cellen volgende stappen 2.1-2.3. Laat de culturen groeien voor 4 dagen, gevolgd door serum starvatigedurende 16 uur.
   2. Op dag 5, behandelen van de cellen met geschikte concentratie gezuiverd eiwit in 0,1% FBS aangevuld medium het serum uitgehongerde cellen. Geef verse media verandering met gezuiverde eiwit na 2 dagen.
   3. Op dag 10 wordt de geconditioneerde media met complete HME media. Laat de kweken groeien voor nog 5 dagen.
7. Immunofluorescentie kleuring van acinaire structuren gekweekt op Matrigel:
   1. Bereid 2% paraformaldehyde, 0,5% Triton X-100 en 100 mM glycine in 1x PBS, pH 7,4. Bereid buffer immunofluorescentie (IF-buffer) die bestaat uit 1 x PBS bevattende 0,1% runderserumalbumine, 0,2% Triton X-100, 0,05% Tween-20.
   2. Gebruik een P200 pipet tip om de geconditioneerde media zorgvuldig aspireren.
   3. Bevestig de acinaire structuren met 2% vers bereide paraformaldehyde bij kamertemperatuur (KT) gedurende 20 minuten.
   4. Permeabilize de cellen met 0,5% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
   5. Was de cultuurs drie keer met 100 mM glycine, 10-15 minuten voor elke wasbeurt.
   6. Blokkeer de cellen met 10% geit serum in IF-buffer, genoemd primair blok, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   7. Incubeer de kweken met 20 ug / ml geit anti-muis F (ab ') ₂ fragment primaire blok buffer gedurende 30 minuten. Deze stap is belangrijk om de immunoreactieve muis IgG soorten in de Matrigel blokkeren.
   8. Incubeer met primair antilichaam in de tweede blokkerende oplossing (Basis blok 20 ug / ml geit anti-muis F (ab ') 2 fragment) O / N bij 4 ° C.
   9. Was driemaal uit met IF-buffer gedurende 10-15 minuten elk met zachte wiegen.
   10. Incubeer met fluorescerende geconjugeerde secundaire antilichamen in IF-buffer gedurende 45 minuten.
   11. Wash 3x 10 minuten elk met IF-buffer met zachte wiegen.
   12. Monteer de dia's met anti-fade reagens dat DAPI om de kernen te visualiseren.
   13. Laat de dia drogen O / N bij kamertemperatuur.
   14. Beeldacquisitie: Acquire confocale beelden op de kolonie midsection van cellen gekweekt op de top van Matrigel. Voor meer informatie te verkrijgen van een reeks optische secties over de gehele lengte van de acinaire structuur door Z stapelen.

3. Driedimensionale cultuur in 2-goed Kamer Dia's voor Immunoblotting

1. Precool een 2-kamer goed glijbaan op ijs. Volg stappen 2.1-2.4 opschaling de reagentia voor de 2 putjes kamer dia bijv. laag met 160 ui Matrigel en voeg 1,6 ml cellen / Matrigel mix aan elk putje van de 2-well slide.
2. Oogst de acinar structuren uit de Matrigel met behulp van de in de handel verkrijgbare 3D-cultuur cel oogsten kit volgens de instructies van de fabrikant.
3. Verdun de cel wassen en cel oogsten buffers tot 1x en precool tot 4 ° C. Wassen en loskomen van Matrigel moet op ijs worden uitgevoerd.
4. Was de acinar structuren 3x met de celwasbuffer.
5. Verzamel de acini in 15 ml centrifugebuis behulp van mobiele oogsten buffer gevolgd door 30 minuten incubatie op een rocker bij 4 ° C. Meng ophanging goed met een pipet 1 ml. Dit zal de Matrigel breken in kleine stukjes en laat de meeste cellen in de cel oogsten buffer.
6. Pellet de cellen bij 200 xg in een cultuur centrifuge. Verwijder de drijflaag van hydrogel uit het ingehulde cellen met een P200 pipet tip.
7. Resuspendeer de lysaten in SDS monsterbuffer die bij de kit. RIPA lysis buffer kan worden gebruikt.

4. Kwantificering van maligne versus Goedaardige Borst Phenotype

1. Groeien cellen in drievoud voor elke behandeling set volgende stappen 2,1-2,4.
2. Neem fasecontrastbeelden van acinaire structuren uit elk putje in 5X en 10X resolutie met behulp van een fasecontrastmicroscoop bevestigd aan een dia shifter en een computer. Neem de beelden door de schuifbalk van het ene naar het andere deelvenster en waarmee zij de gehele put van de chambered glijbaan.
3. Tel het aantal acinaire structurenhet aantal alleenstaande ronde platte acini en het aantal multiacinar structuren of lukraak groeiende structuren ontbreekt organisatie en met vertakking processen die uitgaan van het.
4. Bereken het percentage alleenstaande ronde platte acinar structuren versus kwaadaardige structuren en plot als kolom grafiek. Bereken de betekenis van Student's t-test.

Resultaten

3D cultuur kan effectief worden gebruikt om kwaadaardige fenotype van menselijke borst epitheelcellen onderscheiden van goedaardige borst. Enkele goedaardige cellen op Matrigel groeien georganiseerde bolvormige structuren die gemakkelijk kan worden afgebeeld als ronde platte acini in een vlak met fasecontrast. De enige kwaadaardige cellen op Matrigel groeien lukraak, vertonen zeer hoge brekingsindex en moeilijk afbeelding in een vlak. Zoals getoond in figuur 1, de goedaardige HME en MCF10A cellen vormen...

Discussie

We hebben hier beschreven driedimensionale kweek van borst epitheelcellen op een gereconstitueerde basaalmembraan en de bruikbaarheid van dit systeem te maken tussen kwaadaardige tegen goedaardige borst fenotype. Dit systeem kan ook worden gebruikt voor cultuur verschillende celtypen van andere klieren weefsels en is gemeld zijn met succes gebruikt om cultuur prostaat epitheliale, bronchiale epitheel en schildklier epitheelcellen, een paar te noemen ^12-14. Het belang van 3D cultuur ligt in het feit dat het ee...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Vermijd herhaal vries-dooicycli
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Voorkoel op ijs
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Voorkoel op ijs
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Bekijk de website van Molecular Probes
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 verdunning voor IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 verdunning voor IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 verdunning voor IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 verdunning voor IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 verdunning voor IF