Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Samenvatting

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Samenvatting

Het is nu bekend dat de cellen en weefsels micro-omgeving zijn kritische toezichthouders beïnvloeden tumor initiatie en progressie. Bovendien heeft de extracellulaire matrix (ECM) is aangetoond dat een kritische regulator van celgedrag in cultuur en homeostase in vivo. De huidige benadering van het kweken van cellen op tweedimensionale (2D), kunststof oppervlakken leidt tot verstoring en verlies van complexe interacties tussen cellen en hun micromilieu. Door het gebruik van driedimensionale (3D) cultuur assays, worden de voorwaarden voor cel-interactie micro vastgesteld lijkt de in vivo micro-omgeving. Dit artikel geeft een gedetailleerde methodologie om borstkanker cellen groeien in een 3D basaal membraan eiwit matrix, tekenend is voor het potentieel van de 3D-cultuur in de beoordeling van de cel invasie in de omgeving. Daarnaast bespreken we hoe deze 3D assays hebben de potentie om het verlies van signalering Molec onderzochtules dat epitheliale morfologie reguleren door immuunkleuring procedures. Deze studies helpen belangrijke mechanistische informatie te verkrijgen in de processen reguleren invasie, vereist voor de verspreiding van borstkanker.

Inleiding

Migratie en invasie van individuele of collectieve cellen zijn twee kenmerken van kanker, en die nodig zijn voor de metastatische verspreiding van kankercellen ^1-4. Het vermogen van kanker cellen om metastase te starten hangt af van hun vermogen om te migreren en binnen te dringen in het naburige weefsel met behulp invadopodia aan de basale membraan van de cellen af ​​te breken. Invadopodia zijn dynamisch actine-rijke matrixafbraak uitsteeksels die afbraak van de extracellulaire matrix mogelijk door het vrijkomen van matrix-afbrekende proteasen ^5. Kankercel invasie omvat de afbraak van de matrix gevolgd door de migratie van kankercellen en dit gepaard met een reorganisatie van de driedimensionale (3D) matrix milieu ^2. Zo te dringen door de matrix, een cel moet zijn vorm veranderen en interactie met de extracellulaire matrix (ECM) ^2.

Het onderhoud van het borstweefsel integriteit afhankelijk van strak controlled weefselarchitectuur aangezien cel-ECM en cel-cel adhesie verbindingen beïnvloeden genexpressie en verstoring van epitheliale polariteit kan leiden tot het ontstaan ​​van kanker ^6-10. Echter, de meeste in vitro migratie en invasie assays zoals transwell kamer assays of wond krassen testen zijn tweedimensionale (2D) en bijgevolg deze verwaarlozing de wisselwerkingen tussen cellen en hun onmiddellijke omgeving ^3,6,8,11-14. Aanzienlijke morfologische en functionele diversiteit, waaronder variaties in cellulaire morfologie, celdifferentiatie, cel-matrix adhesie en genexpressie patronen zijn ontdekt door het kweken van cellen in 3D culturen die vaak ontbreken in 2D-assays ^2,6,8,11. Aldus gebruikt 3D assays aanzienlijk gunstig indient een fysiologische in vivo toestand, waardoor een betere vertaling baanbrekende bevindingen basisonderzoek naar de kliniek ^6-10. Er moet echter worden opgemerktOndanks de vele voordelen die het gebruik van 3D culturen, dit model niet alle van de complexiteit van de in vivo tumormicromilieu dat verschillende celtypen omvat vangen. Het is echter mogelijk om stromale cellen nemen in de 3D-modellen (bijv. fibroblasten, leukocyten en macrofagen) het effect van tumor-stromale interacties over kanker celadhesie en invasie ^15-17 bestuderen.

Borst epitheliale cellen in kweek groeien het meest effectief wanneer ECM eiwitten zoals laminine en collageen aanwezig zijn. Met deze bekende, is een commercieel verkrijgbaar mengsel matrix afgeleid van Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muriene en staat bekend als Matrigel basaalmembraan matrix ^2,8. Een aantal technieken zijn ingesteld om epitheelcellen 3D kolonies groeien basaalmembraan matrix ^2,8. De 3D basale membraan matrix model effectief is voor het vaststellen van zowel maligne en niet-maligne borstcelgroei, lijkt op wat er gebeurt in de in vivo omgeving ^18,19. MCF10A cellen niet-maligne mamma epitheelcellen. Wanneer gekweekt in basaalmembraan matrix deze cellen vertonen in vivo eigenschappen van normale borstcellen ondergaan gecontroleerde celproliferatie, polarisatie en apoptose het lumen ruimte ^8,12,20 stellen. Ook het uiterlijk van celkernen van MCF10A cellen die acini in 3D culturen dichter op die van mammaire epitheelcellen in weefsel dan gekweekt in monolaag ^21. Studies van Bissell en collega's waren de eerste om te tonen dat kwaadaardige borst cellen kunnen worden onderscheiden van niet-kwaadaardige borstcellen wanneer gekweekt in een laminine-rijke omgeving, aangezien de kwaadaardige cellen vertonen een zeer ongeorganiseerd fenotype, verhoogde proliferatie, verminderde cel- celadhesie, verhoogde expressie van mesenchymale markers en een toename van het aantal invasieve structuur gevormd ^3,6,22.

Afwijkingen van de cel milieu tumorvorming ²⁰ beïnvloeden. De 3D kweekmethode kan worden gebruikt om effectief bestuderen communicatie die plaatsvindt tussen de tumorcellen en hun omgeving en bepalen hoe eiwitexpressie invloeden communicatie ^14,20,21,23. Dit artikel geeft een gedetailleerde methodologie voor MDA-MB-231 borstkankercellen groeien in 3D culturen invasiveness te analyseren, en om het verlies van epitheliale morfologie met een epitheliale marker laminin, een onderdeel van de cel basale membraan ^{18,19,24 bestuderen, 25.} De voorschriften bieden de mogelijkheid om nauwkeurig en reproduceerbaar kwantificeren stervormige (invasieve) structuurvorming door een invasieve kankercel en niet beperkend voor de gemeenschappelijke borstkankercellijnen (zoals MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 of T47D ). Zo kan deze bepaling als platform voor het evalueren hoe eiwitexpressie in cellen of behandeling met pro-of anti-invasieve verbindingen regelen extracellulaire matrix degradatie, door een of meerdere cellen.

Protocol

1. Driedimensionale Cultuur van borstkankercellen in Basement Membrane Matrix (De Verankering Techniek)

1. Omgaan Matrigel basaal membraan matrix: Ontdooi op ijs overnacht bij 4 ° C. Basaalmembraan matrix vloeibaar is bij lage temperatuur, maar stolt op kamertemperatuur. Houd basale membraan matrix op ijs (figuren 1A-B).
2. Bedek de Confocale No.1 glazen bodem schaal met 50 gl basaalmembraan matrix door middel van verspreiding van de matrix met de punt van een Pipetman P-200 in een spiraalvormig patroon (figuur 1C). Wees voorzichtig bij het verspreiden van het basaal membraan matrix om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Ook voorkomen dat de verspreiding van de matrix dicht bij de randen van de glazen bodem gerecht meniscus te voorkomen. Als onervaren handling basaal membraan matrix, dan voorgekoeld de schotel, P-200 Pipetman en pipetten kan op ijs (alternatief gedurende de nacht in een koelkast bij 4 ° C). Deze stap aanbiedingenextra tijd om het basaal membraan matrix uitspreiden voor het stollen. Zet de schaal (n) in een cel incubator (bij 37 ° C met 5% _CO2) gedurende ten minste 30 minuten aan de basale membraan matrix staat te stollen (figuur 1D).
3. Terwijl de matrix ondergaat stollen, trypsinize een 70-80% confluent 100-mm plaat van cellen. Wanneer de cellen eenmaal zijn begonnen tillen van de plaat, resuspendeer ze in 10 ml RPMI 1640 medium dat 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS), de trypsine (figuur 1E) inactiveren. Daarna brengt de geresuspendeerde cellen in een 15 ml conische buis (figuur 1F).
4. Draai de cellen (aanwezig in conische buis) bij 100 xg gedurende 3 minuten in een specifieke celkweek centrifuge (fig. 1G-H).
5. Terwijl de cellen worden afgedraaid, aliquot 50 pi matrix in een 1 ml microcentrifugebuis (let op: wordt elke glazen bodem schaal toegewezen een microcentrifugebuisje, vandaar, indienhet experiment vereist 3 gerechten, dan volgt daaruit dat 3 microcentrifugebuizen nodig ook), en plaats de buis vervolgens op ijs (Figuur 1B).
6. Zuig het medium van de conische buis uit stap 1.4, terwijl het verlaten van de pellet ongestoord (Figuur 1I). Resuspendeer cellen (die zijn gecentrifugeerd) in 1 ml FBS aangevuld RPMI-medium (fig. 1J).
7. Zodra de cellen geteld met een hemocytometer (fig. 1K), of een cel deeltjesteller aliquot 2,5 x 10 ⁴ cellen in de microcentrifugebuis en het af met geschikte media om totaal volume van 50 pl (Figuur 1L) te verkrijgen.
8. Meng de cellen van stap 1.7 (25.000 cellen in 50 ul) met de matrix bevattende microcentrifugebuis van stap 1.5 in een 1:1 verhouding; uiteindelijke volume zal 100 pi (figuur 1 M).
9. Voorzichtig plaat 100 pl van de matrix: cel mengsel uit stap 1.8 op de solidified basaal membraan-matrix gecoate schaal van stap 1.2 (figuur 1 N). Hierdoor kunnen cellen worden ingebed in basaalmembraan matrix.
10. Breng de schaal (sen) in de celkweek incubator (bij 37 ° C met 5% _CO2) en laat de matrix: celmengsel stollen ten minste 30 minuten.
11. Zodra de matrix: celmengsel is gestold, voeg 2 ml FBS aangevuld RPMI-media om de schaal (figuur 1O) en neem het gerecht terug de incubator waar deze wordt opgeslagen voor de rest van het experiment (Figuur 1P).
12. Opnieuw media elke dag gedurende 5 dagen (of per vereist voor een test, de duur van de test voor MDA-MB-231 cellen 5 dagen lang).
13. Met behulp van een lichtmicroscoop, neem differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van de MDA-MB-231 kolonies gesuspendeerd in basaal membraan matrix (figuur 3A). Afbeelding 20 representatieve gebieden op 10X doel een keer per dagvoor vijf dagen naar kolonie morfogenese (figuur 3C) te bepalen.
14. Analyseer beelden blindelings naar cel kolonie gestraalde vorming (Figuur 3B) te bepalen. Een kolonie wordt geacht stellaatcellen als een of meer projecties van de bolvormige cellen worden waargenomen. Het percentage invasieve gestraalde kolonies te bepalen, verdeel het aantal gestraalde kolonies door het totaal aantal celkolonies per verworven imago, en dan het gemiddelde van de gestraalde kolonies percentages van de 20 beelden voor elke dag.

Figuur 1. Driedimensionale cultuur van MDA-MB-231 borstkankercellen in basaal membraan matrix (de inbedding techniek). AB) Een schematische weergave van de experimentele opstelling (uitgevoerd in de zuurkast). C) Het goed van de glazen bodem schaal gecoat50 ui basaalmembraan matrix. D) Schotel (sen) in een celkweek incubator (bij 37 ° C met 5% _CO2) aan de matrix toe te stollen ten minste 30 minuten. E) F Cellen werden getrypsiniseerd. ) Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in een 15 ml conische buis. GH) cellen (aanwezig in conische buis) werden gecentrifugeerd bij 100 xg gedurende 3 minuten in een weefselkweek centrifuge. I) celpellet. J) cellen (die zijn gecentrifugeerd) werden geresuspendeerd in 1 ml FBS-medium aangevuld RPMI. K) cellen werden geteld met een hemocytometer. L) 2,5 x 10 ⁴ cellen verdeeld in de microcentrifugebuis en afgewerkt met geschikte media om totaal volume van 50 ui te verkrijgen. M ) Meng cellen van stap 1.7 (25.000 cellen in 50 ul) met de matrix bevattende microcentrifugebuis van stap 1.5 in een 1:1 verhouding; uiteindelijke volume zal 100 μ.; L N) plaat voorzichtig 100 pi van de matrix: cel mengsel van stap 8 op de gestolde matrix-gecoate schaal van stap 1.2 O) Zodra de matrix: celmengsel is gestold, voeg 2 ml FBS-aangevuld RPMI media. de schotel. P) Plaats de schaal in de incubator waar deze wordt opgeslagen voor de rest van het experiment.

2. Onderzoek van morfogene Kenmerken van 3D Culturen met immunofluorescentie

1. Stel een ijs lade koude fosfaat gebufferde oplossing (PBS), 20% aceton: 80% methanol (fixeeroplossing), en 3% runderserumalbumine (BSA; blokkerende oplossing) (Figuur 2A) voordat de schaal (es) uit de incubator.
2. Zet de schaal (sen) op het ijs lade en zuig media, vervolgens 3x wassen met 2 ml koude PBS (figuur 2B).
3. Zodra de laatste PBS was wordt opgezogen, voeg 2 ml 20% aceton: 80% methanol-oplossing in de schaal (es) (figuur 2C ) aan de cellen gedurende 20 minuten vast bij 4 ° C (op ijs of in de koelkast) (Figuur 2D).
4. Zodra de 20 min fixatie wordt beëindigd, brengt de schotels terug op kamertemperatuur zuig het fixeermiddel en vervolgens 3x wassen met PBS. Zodra de uiteindelijke PBS-wassing wordt afgezogen, 2 ml van 3% BSA om de schotel (n) bij blok ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 2E).
5. Gedurende de blokkeringsperiode verdunningen bereiden van primaire (laminine V 1:100) en secundaire antilichamen (op geschikte verdunning) opgelost in 3% runderserumalbumine (BSA) blokkerende buffer. Let op: 400-500 pi de 'BSA + primaire antilichaam-oplossing direct te worden toegevoegd aan de matrix: celmengsel.
6. Zodra de 30 min blokkering verstreken, voeg de primaire antilichamen en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur (Figuur 2F). Let geen PBS wast worden uitgevoerd na 30 min blocking periode.
7. Na voltooiing van stap 2.6, verwijder de 'BSA + primaire antilichaam' oplossing, en was 3x met PBS.
8. Voeg het tweede antilichaam opgelost in 3% BSA (op geschikte verdunning) direct op de matrix: celmengsel, omvatten de gerechten en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (Figuur 2G).
9. Haal de 'BSA + secundair antilichaam' oplossing, en was 3x met PBS.
10. Voeg 2 ml van Hoechst 33258 (1:10.000), opgelost in PBS voor kernen kleuring, en incubeer gedurende 5 minuten onder aluminiumfolie (of bedekken met een ondoorzichtige container photobleaching beperken) (figuur 2H).
11. Zodra de 5 min incubatie met Hoechst 33258t zijn verstreken, was het gerecht (es) 5x met PBS.
12. Voeg fixeermiddel direct op de matrix: celmengsel in de confocale schaal dek met glazen dekglaasje voorzichtig voorkomen induceren verstoringen van de integriteit van de kolonies in de basaalmembraan matrix: celmengsel (figuur 2I).
13. Laat de schaal (n) bij nacht drogen (of 24 uur) bij kamertemperatuur (figuur 2I). Eenmaal droog, kan de schotel (es) worden bewaard bij -20 ° C, maar het wordt ten zeerste aanbevolen dat zij zo snel mogelijk moet worden afgebeeld.
14. Acquire beelden met behulp van een fluorescentiemicroscoop met geschikte laser golflengten van antilichamen gebruikt (figuren 3D-E).

Figuur 2. Onderzoek van 3D culturen met immunofluorescentie. . A) Een schema van de experimentele opstelling B) Schotel (es) geplaatst op het ijs dienblad en media opgezogen; Vervolgens werden de cellen driemaal gewassen met 2 ml koude PBS C) 2 ml 20% aceton:. 80% methanoloplossing toegevoegd in de schaal (sen) D) Bevestig de cellen.20 min bij 4 ° C (op ijs of in een koelkast). E) 2 ml 3% BSA toegevoegd aan de schaal (n) bij blok ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. F) Na de 30 min blokkeren verstreken, voeg de primaire antilichamen en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur G) Secundaire antilichamen opgelost in 3% BSA (op geschikte verdunning) werden direct toegevoegd aan de basale membraan matrix. celmengsel; . Vervolgens gerechten bedekt en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur H) 2 ml Hoechst (1:10.000, opgelost in PBS) toegevoegd aan de dishe (sen) en cellen geïncubeerd gedurende 5 minuten onder aluminiumfolie I) fixeermiddel rechtstreeks toegevoegd. op de matrix: cel mengsel in de confocale schotel en de schotel is bedekt met glas dekglaasje. Schotel (n) te drogen overnacht (of 24 uur) bij kamertemperatuur geroerd.

Resultaten

Een voorbeeld van de MDA-MB-231-cellen invasie in 3D matrix wordt getoond in figuur 3C. De cellen zijn ingebed in matrix (dag 1), en start de vorming invasief (stervormige) structuren op dag 3, en volledig binnendringen in de matrix tegen Dag 5 (figuur 3C). Het aantal gestraalde gevormde koloniën geteld, en uitgedrukt als een percentage van het totale aantal kolonies per schaal (invasieve en niet-invasief). Bovendien, aangezien de metingen dagelijks uitgevoerd gedurende vijf dagen, de m...

Discussie

De ontwikkeling van 3D celkweektechnieken heeft onderzoekers toegestaan ​​om de transformatie van borst epitheelcellen bestuderen, zodat we de dramatische morfologische veranderingen zichtbaar. Naast het analyseren celinvasie, kan het een of multicellulaire sferoïden mammaire epitheliale worden om veranderingen in cellulaire adhesie, proliferatie, maat en basale-apicale polariteit beoordelen. In tegenstelling tot eerder beschreven methoden waarbij de cellen bedekt met ECM ^8, onze methode sluit de cellen in EC...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	Steriele, wegwerp
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Steriele, wegwerp
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Steriele, wegwerp
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Steriele, wegwerp
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Steriele, wegwerp
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Steriele, wegwerp
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Voorgekoeld voor gebruik
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Gebruikt bij 3% voor IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed	Life Technologies	A11029	1:250 voor IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A11011	1:1,200 voor IF
Anti-Beta-Catenin	BD Transduction Laboratories	610153	Muis-monoklonaal; Gebruikt bij 1:100 voor IF
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Gebruikt bij 10% (v/v)
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water	Life Technologies	H3569	Gebruikt bij 0.1% (1:10.000 verdunning)
InVivo Analyzer Suite	Media Cybernetics		Gebruikt voor 3D-cultuurbeeldvorming (DIC-beelden bij 10X en 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10)	EZ Biolabs	PT0512100601	Gebruikt bij 100 nM
Anti-Laminin	Cedarlane	AB19012(CH)	Konijn-polyklonaal volledige lengte mens; Gebruikt bij 1:100 voor IF
LSM-510 META laser scanning microscope	Zeiss		Gebruikt bij 63X objectief; olie-immersielens
Matrigel phenol red free (BD356237)	VWR	CACB356237	Lot No.2180819; 10,4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Gebruikt voor 3D-cultuurbeeldvorming (DIC-beelden bij 10X en 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Antibioticum (toegevoegd aan media; gebruikt bij 0,01%)
10 ml pipette	VWR	CA53300-523	Steriele, wegwerp
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Gebruikt voor het kweken van MDA-MB-231-cellen
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red	Life Technologies	25200-072	Gebruikt om MDA-MB-231-cellen te trypsiniseren
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Gebruikt voor het kweken van MCF10A-cellen