Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Samenvatting

Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.

Samenvatting

Celoppervlakeiwitten, waaronder extracellulaire matrixeiwitten, aan alle belangrijke cellulaire processen en functies, zoals groei, differentiatie en proliferatie. Een uitvoerige karakterisatie van deze eiwitten biedt rijke informatie voor de ontdekking van biomarkers, celtype-identificatie, en drug-target selectie, evenals het helpen om ons begrip van cellulaire biologie en fysiologie te bevorderen. Oppervlakte-eiwitten, echter, vormen belangrijke analytische uitdagingen, vanwege hun inherent lage overvloed, hoge hydrofobiciteit, en zware post-translationele modificaties. Profiterend van de heersende glycosylering op oppervlakte-eiwitten, introduceren we hier een high-throughput glycopeptideresistente capture benadering die de voordelen van een aantal bestaande N-glycoproteoomanalyses middelen integreert. Onze methode kan de glycopeptides afgeleid van oppervlakte-eiwitten te verrijken en te verwijderen van hun glycanen voor facile proteomics via LC-MS. De opgeloste N-glycoproteome omvat de informatie eiwit identiteit en kwantiteit als hun sites van glycosylering. Deze methode is toegepast op een reeks studies in gebieden zoals kanker, stamcellen en druggiftigheid. De beperking van de werkwijze ligt in de geringe hoeveelheden oppervlakte-membraaneiwitten, zodat een relatief grote hoeveelheid monsters is vereist voor deze analyse werden studies gericht op cytosolische eiwitten.

Inleiding

Celoppervlakte-eiwitten interageren met de omgeving en relais signalen van buiten naar de binnenkant van een cel. Aldus zijn deze eiwitten, waaronder extracellulaire matrixeiwitten, spelen kritieke rollen in alle aspecten van cellulaire biologie en fysiologie variërend van proliferatie, groei, migratie, differentiatie veroudering enzovoort. Oppervlakte-eiwitten functioneren door interactie met andere cellen, eiwitten en kleine moleculen ^1-3. Moleculaire karakterisering van cel-oppervlakte-eiwitten van groot belang, niet alleen voor biologen, maar ook voor farmaceutische bedrijven, aangezien meer dan 60% van geneesmiddelen gericht op het celoppervlak eiwitten ^4.

Tandem massaspectrometrie (MS), met zijn superieure gevoeligheid, nauwkeurigheid en doorvoer voor de identificatie van eiwitten en peptiden, is een krachtig hulpmiddel voor globale proteomics studies ^5,6. Toch, oppervlakte-eiwitten vormen belangrijke uitdagingen voor MS-gebaseerde proteomics, alsde meeste oppervlakte-eiwitten bestaan ​​in kleine hoeveelheden en met zware modificaties. De membraanoverspannende gebieden van de oppervlakte-eiwitten hen hydrofoob te maken; dit is vooral het geval voor multipass transmembraaneiwitten. Het is dus moeilijk om membraaneiwitten in waterige oplossingen oplossen zonder de hulp van een detergens; echter het gebruik van reinigingsmiddelen onderdrukt het algemeen van de HPLC en MS ^1,7,8 in proteïne-identificatie. Daarom membraaneiwitten zijn slecht gekenmerkt directe LC-MS gebaseerde proteomics.

Glycosylatie is een van de belangrijkste en meest voorkomende post-translationele modificaties die in cel-oppervlakte-eiwitten ^9. De enorme complexiteit en de heterogeniteit van glycanen belemmeren peptiden 'MS signaal ^10. Niettemin hebben verscheidene proteomics methoden deze unieke modificatie gebruikt om oppervlakte-eiwitten te verrijken en de suiker-resten van eiwitten voorafgaand aan LC-MS analyse te verwijderen. Deze methodes onder-lectine gebaseerde affiniteit capture ¹¹ en-hydrazide gebaseerde of boorzuur gebaseerde chemische capture ¹² evenals hydrofiele chromatografie scheidingen ^8,13. De verwijdering van glycanen transformeert membraaneiwitten om regelmatig eiwitten en vereenvoudigt de MS karakterisering drastisch. Omdat glycosylering vindt ook plaats in uitgescheiden eiwitten die een hoge oplosbaarheid in tegenstelling tot eiwitten membraan, zijn veel glycoproteoomanalyse werkwijzen geoptimaliseerd voor oplosbare eiwitten en gewoonlijk minder glycopeptide selectiviteit en gevoeligheid wanneer ingezet eiwitten ^8,14 membraan hebben. Andere methoden bestaan ​​ook te verrijken met name cel-oppervlakte-eiwitten, zoals die met ultracentrifuge ¹⁵ en labeling strategieën ^16. Een gedetailleerde vergelijking van onze werkwijze en andere bestaande methodes voor het karakteriseren membraaneiwitten werd uitgevoerd onlangs ¹⁷ en de resultaten gaven aan dat onze werkwijze evengoed presteren, zonietbeter dan alle vergeleken membraan proteomics methoden, maar met hogere eenvoud.

Om u te helpen onderzoekers gebruiken deze methode, we detail hier een algemeen protocol. Deze methode integreert verschillende voordelen van het bestaande glycoproteoomanalyses strategieën en is speciaal ontworpen voor membraanglycoproteïnen, maar de methode werkt net zo goed voor uitgescheiden eiwitten. De kenmerken van deze methode zijn: 1) een volledige solubilisering van membraaneiwitten, 2) een verrijking van glycopeptiden plaats van glycoproteïnen aan de potentiële sterische hindering te verwijderen bij gebruik van een vast substraat vastleggen, 3) het gebruik van hydrazide chemie covalente bindingen te vormen tussen glycopeptiden en vastleggen substraat, zodat de gebonden glycopeptiden stringente wasbehandelingen voor hoge glycoselectivity kan tolereren, en 4) de mogelijkheid om de gehele vastlegprocedure voeren in een buis voor verminderd monster en verkorte procedure duur. Na de implementatie van deze methode om het bestuderen van een varischappij van biologische monsters zoals cellen en weefsels, observeerden we een hoge selectiviteit (> 90%) aan glycoproteïnen ^8,17,18.

Protocol

1. Harvest Membranen

1. Voeg hypotonische buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM _MgCl2, pH 8,0) met proteaseremmer cocktail op een celpellet (~ 10 ⁸ cellen) en incubeer gedurende 15-30 min. op ijs. Lyseren van de cellen door het monster door injectienaalden (5-10 passages) of homogeniseren van het monster door een Dounce homogenisator (15-30 slagen). Gebruik een hemocytometer en trypan blauw kleuring om de efficiëntie van lysis controleren.
2. Het verkrijgen van de microsomale fractie door een differentiële centrifugatie van het lysaat op 3000 gx 15 min en vervolgens bij 100.000 gx 2 uur. De eerste centrifugatie verkrijgt een pellet die de nucleaire fractie en de daaropvolgende centrifugatie van het supernatant genereert een tweede pellet, die de microsomale fractie die het plasmamembraan en membraangebonden organellen ⁸ bevat. De uiteindelijke supernatant is de cytosolische fractie. Bewaar de microsomale fracties in -80 ° C vriezer voor verdere analyszoals hieronder aangegeven.

2. Los, Denatureren en Digest membraaneiwitten

1. Los de microsomale fractie van de denaturatie buffer (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8) en incubeer de oplossing bij 100 ° C gedurende 10 minuten.
2. Koel de oplossing verwarmd tot kamertemperatuur, voeg ultrazuivere ureum poeder in de oplossing van 8 M eindconcentratie en incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
3. Voeg iodoacetamide voorraadoplossing van het monster naar 15 mM eindconcentratie en incubeer de oplossing in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de vrije thiolen alkyleren in het monster. Voeg DTT voorraadoplossing van het monster naar 10 mM eindconcentratie en incubeer de oplossing gedurende nog 10 minuten bij kamertemperatuur om het buitensporige joodacetamide blussen.
4. Verdun de verkregen oplossing 10x met 40 mM Tris-buffer bij pH 8 en vervolgens trypsine toe te voegen aan het monster bij een 01:20 verhouding van trypsin totale eiwit. Handhaaf de spijsvertering reactie in een 37 ° C oven gedurende de nacht te waarborgen van de reactie af.
5. Beëindig de spijsvertering door het aanzuren van het monster tot pH 1 met HCl, een aandoening die ook breekt het wasmiddel, dwz Rapigest. Degraderen de Rapigest bij 37 ° C gedurende 1 uur, en verwijder de ontwikkelde neerslaan door centrifugeren.
6. Reinig het supernatant dat monster peptiden bevat door een C-18 vaste-fase-extractie (SPE) cartridge en droog het verkregen monster door speedvac.
7. Voer een SDS-PAGE analyse van monsters voor en na trypsine digestie om de destructie efficiëntie bevestigen.

3. Glycopeptide Capture

1. Los het gereinigde peptiden in de koppeling buffer (100 mM natriumacetaat, pH 5,5). Voeg natriumperjodaat in de peptide oplossing bij een eindconcentratie van 10 mM gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Hierdoor wordt de cis-diolgroepen in de glycanen te oxideren tot aldehyden, Die de glycanen te koppelen aan de hars door hydrazide chemie staan. Doof het buitensporige perjodaat met natriumsulfiet in een 20 mM eindconcentratie en pH 5 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
2. Invoering-hydrazide gederivatiseerd hars in de peptide oplossing bij een verhouding van 1:4 (hars oplossing) te koppelen glycopeptiden aan het hars. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 1-2 dagen met end-to-end rotatie voor complete koppeling.
3. Verwijder ongebonden peptiden door het wassen van de hars tweemaal met 1 ml van elk van de volgende: gedeïoniseerd water, 1,5 M NaCl, methanol en 80% acetonitril. Tenslotte was de hars 3x met 1 ml 100 mM NH ₄ HCO ₃ bij pH 8 bij de buffer van het uitwisselingssysteem 100 mM NH ₄ HCO _3.
   1. Verzamel de bovenstaande vloeistof en wassen voor de analyse van ongebonden peptiden (optioneel).
4. Laat de N-glycopeptiden van de hars door PNGase F per nacht incubatie bij 37 ° C met eenn end-to-end rotatie. Verzamel de vrijgegeven peptiden door centrifugeren en een 80% acetonitril wassen. Droog de verkregen oplossing in de speedvac van LC-MS analyse.

4. Verdere fractionering (optioneel)

Verder te vereenvoudigen complexiteit monster, fractioneren de verkregen N-glycopeptiden. Bijvoorbeeld, los het gedroogde peptiden in 10 mM ammonium formate, pH 3 met 20% acetonitril en gebruik sterke kationenwisselaar (SCX) chromatografie om de peptiden fractioneren. Droog de ​​verkregen eluens en vervolgens analyseren van de verkregen peptide fracties door omgekeerde-fase LC-MS ^8,17,18.

Reinigen 5. Van de Uitgebracht N-glycopeptiden (optioneel)

Als bezorgdheid rijzen potentiële vervuiling van de peptiden, los het gedroogde peptiden in 0,1% mierenzuur en gebruik een kolom MCX SPE verder reinigen peptiden voor omgekeerde fase LC-MS analyse.

Opmerking: Database zoeken parameters.

Tijdens de selectieve splitsing van N-glycopeptiden uit het hars, PNGase F zet de N-glycaan asparagine gebonden aan een asparaginezuur. Daarom is er een 0,9840 Da massaverschuiving het vrijgemaakte N-glycopeptiden. Om deze peptiden nauwkeurig te identificeren, deze wijziging moet worden toegevoegd aan de zoekparameters alsmede gemeenschappelijke modificaties zoals de carbamidomethylation van cysteïne en oxidatie van methionine.

Resultaten

Een representatief stroomschema van de experimentele procedure wordt samengevat in figuur 1. De etikettering en verdere fractionering stappen zijn optioneel en details zijn beschreven in een recente publicatie ^18. Een andere optie is om de ongewijzigde peptiden, die niet reageren met de hars te analyseren. De voordelen van het analyseren van de ongewijzigde peptiden zijn de mogelijke identificatie van niet-geglycosyleerde peptiden en proteïnen, zoals Claudins in tight junctions; Een bijkomend...

Discussie

Hier introduceren we een glycopeptide-capture strategie voor het profileren van cel-oppervlakte-eiwitten. De werkwijze kan worden toegepast voor uitgescheiden eiwitten, zoals in bloed, en in andere lichaamsvloeistoffen of celkweek media.

Het succes van de werkwijze berust op het volledige digestie van monsters; Daarom, een SDS-PAGE karakterisatie van de spijsvertering efficiëntie noodzakelijk, vooral voor de eerste keer analyse van een monster. Een volledige digestie kan een uitdaging voor m...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Natriumjodaat	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsine	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Natriumsulfiet	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 trypsine	Sigma	F2006
Ribonuclease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumine	Sigma	A5503
Conalbumine	Sigma	C0755