Methodenartikel

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: Een nieuwe aanpak voor de nanodeeltjes's Mapping en kwantificering in orgaanweefsel

13K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51353

⸱

18 juni 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ILM-FENNEC UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1, 2ILM-PUBLI UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1, 3ILM-SOPRANO UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1

In dit artikel

Samenvatting

Laser-induced afbraak spectroscopie uitgevoerd op dunne orgaan-en tumorweefsel met succes natuurlijke elementen en kunstmatig geïnjecteerd gadolinium (Gd), die met ingang van Gd-gebaseerde nanodeeltjes aangetroffen. Afbeeldingen van chemische elementen bereikt een resolutie van 100 micrometer en kwantitatieve sub-mm gevoeligheid. De verenigbaarheid van de setup met standaard optische microscopie benadrukt het potentieel om meerdere beelden van een zelfde biologisch weefsel te bieden.

Samenvatting

Emissie spectroscopie van laser geïnduceerde plasma werd toegepast voor elementaire analyse van biologische monsters. Laser geïnduceerde afbraak spectroscopie (LIBS) uitgevoerd op dunne secties knaagdier weefsels: nieren en tumor, maakt de detectie van anorganische elementen zoals (i) Na, Ca, Cu, Mg, P en Fe, van nature aanwezig in het lichaam en (ii) Si en Gd, geconstateerd na de injectie van gadolinium gebaseerde nanodeeltjes. De dieren werden gedood 1 tot 24 uur na intraveneuze injectie van deeltjes. Een twee-dimensionale scan van het monster uitgevoerd met een gemotoriseerde micrometrische 3D-fase kon de infrarode laserstraal verkennen het oppervlak met een laterale resolutie van minder dan 100 μ m. Kwantitatieve chemische beelden van Gd element in het orgel werden verkregen met sub-mm gevoeligheid. LIBS biedt een eenvoudige en robuuste methode om de distributie van anorganische materialen te bestuderen zonder enige specifieke labelIng. Bovendien, de verenigbaarheid van de setup met standaard optische microscopie benadrukt het potentieel ervan om meerdere beelden van hetzelfde biologisch weefsel te voorzien van verschillende soorten respons: elementair, moleculaire of cellulaire.

Inleiding

De brede ontwikkeling van nanodeeltjes voor biologische toepassingen drong er bij de parallelle verbetering van analytische technieken voor hun kwantificering en beeldvorming in biologische monsters. Meestal zijn de detectie en het in kaart brengen van de nanodeeltjes in organen door fluorescentie of confocale microscopie. Helaas zijn deze methoden vereisen de etikettering van de nanodeeltjes door een nabij-infrarood kleurstof die de biologische verdeling van de nanodeeltjes kunnen wijzigen, in het bijzonder voor zeer kleine nanodeeltjes vanwege de hydrofobe eigenschappen. De detectie van gelabelde nanodeeltjes, en vooral de zeer kleine nanodeeltjes (grootte <10 nm), kan aldus interfereren met hun biologische verdeling op het gehele weegschaal maar ook op de weefsels en cellen niveaus. De ontwikkeling van nieuwe apparaten om nanodeeltjes te detecteren zonder etikettering biedt nieuwe mogelijkheden voor de studie van hun gedrag en kinetiek. Bovendien is de rol van sporenelementen zoals ijzer en koper in de hersenen ziekten eend neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer 1, Menkes 2,3 of Wilson 4 suggereren het belang bestuderen en lokaliseren deze elementen in weefsels.

Verschillende technieken zijn gebruikt om elementaire mapping of microanalyse van verschillende materialen. In hun overzichtsartikel gepubliceerd in 2006, R. Lobinski et al.. Gaf een overzicht van de beschikbare standaard technieken voor elementaire analyse in biologische omgeving, een van de meest uitdagende omgevingen voor analytische wetenschappen 5. De elektronen microprobe, die bestaat uit energie dispersieve röntgen microanalyse in een transmissie elektronenmicroscoop, kan op talrijke studies als het element voldoende concentratie (> 100-1000 ug / g). Lagere detectielimieten te bereiken, zijn de volgende technieken gebruikt:

  • ionenbundel microprobe behulp deeltje geïnduceerde röntgenstraling μ-PIXE (1-10 ug / g) 6
  • synchrotron straling microanalyse μ-SXRF (0,1-1 ug / g) 7
  • secundaire ionen massaspectrometrie SIMS (0,1 ug / g) 8
  • laser ablatie inductief gekoppelde massaspectrometrie LA-ICP-MS (tot 0,01 ug / g) 9,10

De bovengenoemde technieken die micrometrische resolutie zoals weergegeven in tabel 1 onttrokken Lobinski et al..

3D-reconstructie van seriële 2D onderzoek kan ook worden voorgesteld voor de wederopbouw van diepere weefsels 11. Echter, alle apparaten en systemen vereisen beide gekwalificeerde professionals, matig tot zeer dure apparatuur en langdurige experimenten (meestal meer dan 4 uur voor een 100 urn x 100 urn voor μ-SXRF en 10 mm x 10 mm voor LA-ICP-MS ) 12. In totaal hebben deze eisen te maken elementaire analyse zeer beperkende en onverenigbaar met conventionele optische imaging-systemen,fluorescentie microscopie of niet-lineaire microscopie. Een ander punt dat we hier kunnen noemen is dat de kwantitatieve meting mogelijkheid is nog vrij beperkt en afhankelijk van de beschikbaarheid van matrixgekoppelde laboratorium normen. De verdere veralgemening van het gebruik van elementaire analyse in de industrie processen, geologie, biologie en andere domeinen van de aanvragen zal belangrijke conceptuele en technologische doorbraken te genereren.

Het doel van dit manuscript oplossingen voor kwantitatieve elementaire mapping (of elementaire microanalyse) in biologische weefsels voorstellen met een tafelblad instrumentatie volledig compatibel met conventionele optische microscopie. Onze benadering is gebaseerd op de laser-geïnduceerde afbraak spectroscopie (LIBS technologie). In LIBS, wordt een laserpuls gericht op het monster van belang zijn voor de afbraak en vonk van het materiaal te maken. De atomaire straling die in het plasma wordt vervolgens geanalyseerd door een spectrometer en de elementaireTal concentraties kan worden opgehaald met kalibratie metingen vooraf 13,14. De voordelen van LIBS omvatten gevoeligheid (ug / g voor bijna alle elementen), compactheid, zeer eenvoudig monstervoorbereiding, geen contact met het monster, onmiddellijke reactie en nauwkeurig gelokaliseerd (micro) oppervlakteanalyse. De toepassing van weefsel chemische beeldvorming blijft een uitdaging omdat de laser ablatie van weefsel fijn worden geregeld om kaarten te voeren met hoge ruimtelijke resolutie met gevoeligheid in ug / g bereik 15,16.

Met een dergelijke oplossing, is de toevoeging van tracers of etikettering agenten niet nodig, die het mogelijk maakt het opsporen van anorganische elementen rechtstreeks in hun eigen omgeving in biologische weefsels. De LIBS instrument ontwikkeld in ons laboratorium heeft een huidige resolutie lager dan 100 urn voor een gevoeligheid voor Gd beneden 35 ug / g, overeenkomend met 0,1 mM 16, waardoorhet in kaart brengen van grote monsters (> 1 cm 2) binnen 30 minuten. Daarnaast zelfgemaakte software vergemakkelijkt de verwerving en exploitatie van de gegevens. Dit instrument wordt gebruikt voor het detecteren, kaart, en kwantificeren van de weefsel verdeling van gadolinium (Gd)-gebaseerde nanodeeltjes 17-18 in de nieren en de tumor monsters van kleine dieren, 1-24 uur na intraveneuze injectie van de deeltjes (grootte <5 nm) . Anorganische elementen, die intrinsiek in een biologisch weefsel, zoals Fe, Ca, Na, en P, zijn ook gedetecteerd en afgebeeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Biologische Monstervoorbereiding

Alle in deze studie beschreven experimenten werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de CECCAPP (Lyon, Frankrijk) (machtiging # LYONSUD_2012_004), en de experimenten werden uitgevoerd onder toezicht van bevoegde personen (L. Sancey, DDPP toestemming # uitgevoerd 38 05 32).

  1. Voeg 1 ml H2O tot 100 umol gadolinium (Gd) gebaseerde nanopartikels Wacht 15 minuten en voeg 20 ul van 50 mM HEPES, 1,325 M NaCl, CaCl2 20 mM tot 100 ui H2O en 80 gl van de primaire oplossing van Gd-gebaseerde nanodeeltjes een 200 pi oplossing te verkrijgen bij 40 mM ready-to-inject (Plaats: Villeurbanne op lab).
  2. Spuit de 200 ul Gd-gebaseerde nanodeeltjes oplossing intraveneus in verdoofde tumor-dragende knaagdieren (Stad: Lyon Sud (Oullins), 15 km van het lab).
  3. 1-24 uur na injectie, offeren de muizen eend in isopentaan gekoeld door vloeibare stikstof zet de biologische monsters. Bewaar de monsters bij - 80 ° C (Stad: Lyon Sud (Oullins), 15 km van het lab).
  4. Snijd de sample (Stad: meestal Grenoble, 100 km van het lab, ik zal proberen om een ​​toegang in Lyon Sud hebben) in 100 micrometer dikke dia's en zet de biologische dia's over specifieke plastic schaaltjes (petrischaal). Bewaren bij -80 ° C.
    Opmerking: Plastic borden zijn in principe een zeer zuivere polymeer monster. Ze worden gebruikt om interferentie met elementen in het weefsel te vermijden.

2. Monstervoorbereiding voor kalibratie

  1. Bereid flesjes met toenemende doses van Gd-gebaseerde nanodeeltjes in water (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 500 uM, 1 mM en 5 mM).
  2. Zet een 5 pl-druppel van elke oplossing op regelmatige afstand van 3 mm aan de petrischaal.
  3. Droog bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.

3. LIBS Experiment

  1. Initialiseren van de LIBS Setup
    1. Laser-instellingen. Na het inschakelen van de instrumenten, wacht 10-20 min bij laserpulsenergie stabilisatie en afkoelen van de ICCD camera tot -20 ° C. Stel de puls energie met de demper.
      Opmerking: De optimale laser parameters voor het toewijzen van weefsels zijn 5 ns pulsduur, 1064 nm golflengte, en puls energie van ongeveer 4 mJ. De laser gebruikt een typisch Nd: YAG laser nanoseconde.
    2. LIBS Instellingen. Stel de laser focus positie (ten opzichte van het monsteroppervlak) de krater kleinere diameter te verkrijgen (ongeveer 50 urn of minder).
      Opmerking: Dit komt overeen met een laserpuls focalisatie 100 urn onder het monsteroppervlak.
    3. Spectrometer Instellingen. Gebruik de Czerny-Turner spectrometer in combinatie met een 1200 lijnen / mm raspen en een hoge tijdsresolutie ICCD camera. Controle al deze apparaten via de computer. Stel de ingang spleet waarde tot 40 micrometer. Stel het spectrale bereik regarding het element worden geanalyseerd. Gebruik het spectrale bereik die 325-355 nm Gd detecteren met een hoge gevoeligheid, alsook Na, Ca en Cu. Stel de ICCD parameters met een vertraging van 300 ns, een poort van 2 usec, en een winst van 200.
  2. Mapping Meting
    1. Plaats het biologische monster op de LIBS gemotoriseerde monsterhouder.
    2. De hoogte van het monster volgens de laser focuspositie.
    3. Neem een ​​hoge resolutie foto van het monster slice.
    4. Zet het in kaart brengen van de module LIBS acquisitie software om een ​​kaart uit te voeren met meestal 100 x 100 meetpunten gescheiden door een resolutie van ongeveer 100 micrometer.
    5. Start de overname. Vanaf dit punt automatiseren alles; de bewegende sequentie en het spectrum opnemen en opslaan. 40 minuten zijn nodig voor een toewijzing van 10.000 punten (equivalent aan 1 cm 2 100 micrometer resolutie). Hergroeperen alle opgenomen spectra in een zelfde bestand.
    6. Wanneer finished, neem een ​​tweede foto van het monster slice
  3. Kalibratiemeting

Met dezelfde experimentele parameters, het meten van de kalibratie monsters (voor de bereiding meer informatie, zie hoofdstuk 2). Voer een kaart of opnemen 25 spectra (verkregen uit meetlocaties in het middelste gedeelte van de daling) in elk van de kalibratie druppels.

4 LIBS Spectrum Analyse:. Construeren van Chemical Afbeeldingen

  1. Noteer alle LIBS spectra uit het weefsel in kaart brengen en plaats ze in de LIBS software analyse. Aftrekken van de basislijn voor elk spectrum en de bouw van de chemische beelden met een relatieve intensiteit schaal met behulp van een valse kleuren.
    Opmerking: Een algoritme haalt specifieke lijn intensiteiten, zoals Gd, Cu, Na of Ca.
  2. Voer dezelfde handeling op de spectra gemeten vanaf de geijkte steekproef naar de kalibreringskrommen berekening (verhouding tussen intensiteit en concentratie) mogelijk te maken en te bouwen aquantitative kaart of voor Gd (of ander element van belang).
  3. Breng de passende behandelingen om de chemische afbeeldingen, zoals interpolatie of afvlakking. Sla de intensiteit of concentratie kaarten in beeld formaat (bitmap).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals getoond in figuur 1, de straal van een Nd: YAG laser in de fundamentele golflengte van 1064 nm verticaal naar beneden op het weefsel segment werd gefocusseerd door een lens kwarts van 50 mm brandpuntsafstand. De puls energie was 4 mJ en de herhalingsfrequentie 10 Hz. Om het genereren van plasma in lucht te voorkomen, werd de laserbundel gericht om 100 urn onder het oppervlak van het monster. Geen lucht plasma waargenomen bij deze aandoening. Tijdens de experimenten werd het monster bewogen door ee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Toegepast op biologisch monster, deze techniek maakt het mogelijk de chemische beeldvorming, namelijk het in kaart brengen en kwantificeren, van Gd en Si uit geïnjecteerd Gd-gebaseerde nanodeeltjes in verschillende organen. Van de belangrijkste kritische instellingen, de controle laser eigenschappen (golflengte, pulsenergie, focus en stabiliteit) is essentieel voor een nauwkeurige en fijne weefsel ablatie (bijvoorbeeld mapping resolutie) en voor gevoeligheid. Werken bij hoge energie zorgt voor een bete...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs zeer erkentelijk voor de financiële steun door de Labex-Imust.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Laser nanosecond Nd:YAGQuantelBrillant5 nsec pulsbreedte, golflengte 1.064 nm
SpectrometerAndor TechnologyShamrock 303met 1.200 lijnen/mm geblazed op 300 nm rooster
Detector ICCDAndor TechnologyIstar2 nsec temporele resolutie
LIBS-eenheidILMHuisgemaakte instrumentatie
Gd-gebaseerde nanodeeltjesNano-Hdeeltjes
HEPESSigma-AldrichH4034voor verdunning van deeltjes
CaCl2Sigma-Aldrich21108voor verdunning van deeltjes
NaClSigma-AldrichS5886voor verdunning van deeltjes
MuizenCharles Riverafhankelijk van dierenfokkerij
IsofluraanCoveto / Virbacvoor anesthesie - Isofluranum
IsopentaanSigma-Aldrich59060om het monster langzaam te bevriezen
Vloeibare stikstofAir Liquideom het isopentaan af te koelen
CryostatLeicaCM-3050Som de monsters te schuiven
PetrischalenDutscher353004om het monster vast te plakken

Referenties

  1. Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
  2. Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
  3. Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes' disease. Lancet. 1, 613 (1973).
  4. Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
  5. Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
  6. Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
  7. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
  8. Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
  9. Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
  10. Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
  11. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
  12. Pornwilard, M. -M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
  13. Cremers, D. A., Radziemski, L. J. Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , Wiley. (2006).
  14. Miziolek, A. W., Palleschi, V. Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
  15. Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
  16. Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
  17. Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).
  18. Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Elementanalysenanopartikelmappingweefselcoupesgadoliniumdetectiegemotoriseerde micrometrische tafelinfrarode laserstraalchemische beeldvormingkalibratiemetingenplasma emissie

Gerelateerde artikelen