Methodenartikel

Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel

DOI:

10.3791/51365

⸱

28 maart 2014

 ,  , 
1Pharmacology & Chemical Biology Department, University of Pittsburgh School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier laten wij het gebruik van fluorescente Alexa kleurstof gekoppeld met α-bungarotoxine aan GABAA-receptor oppervlak lokalisatie en endocytose in hippocampale neuronen meten. Door het gebruik van constructies, voorzien van een korte extracellulaire tag die bindt α-bungarotoxin, kan de analyse van plasmamembraaneiwit endocytische mensenhandel worden bereikt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het wordt steeds duidelijker dat de neurotransmitter receptoren, waaronder ionotrope GABA A-receptoren (GABAAR), vertonen zeer dynamische handel en celoppervlak mobiliteit 1-7. Om receptoroppervlak cel lokalisatie en endocytose bestuderen, de hier beschreven techniek combineert het gebruik van TL-α-bungarotoxin met cellen die constructen die een α-bungarotoxin (SW) bindingsplaats (BBS). De BBS (WRYYESSLEPYPD) is gebaseerd op de α-subeenheid van de spier nicotine acetylcholine receptor, die Bgt bindt met hoge affiniteit 8,9. Opneming van het BBS site kan oppervlak lokalisatie en metingen van receptor inbrengen of verwijderen onder toepassing van exogeen fluorescente Bgt, zoals eerder beschreven in het volgen van GABAA en GABAB metabotrope receptoren 2,10. Naast de BBS plaats, hebben wij een pH-gevoelige GFP (pHGFP 11) tussen aminozuren 4 en 5 van het rijpe GABAAR subeenheid van standaard molecular biologie en PCR klonering strategieën (zie figuur 1) 12. De BBS 3 'van de pH-gevoelige GFP reporter, gescheiden door een 13-aminozuur alanine / proline linker. Voor verhandelen studies in deze publicatie die gebaseerd zijn op gefixeerde monsters beschreven, de pHGFP dient als een reporter totale gelabeld GABAAR subeenheideiwit niveaus, zodat normalisatie van de Bgt gemerkte receptor populatie totale receptor populatie. Dit minimaliseert cel om Bgt vlekken signaal variabiliteit als gevolg van hogere of lagere baseline expressie van het tagged GABAAR subeenheden cel. Verder is de pHGFP tag maakt een eenvoudige identificatie van construct tot expressie brengen van levende of vaste imaging experimenten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van fluorescent gekoppelde α-bungarotoxine receptor lokalisatie en dynamica studie is ontwikkeld in studies van de nicotine acetylcholine receptor 13-15, het toxine endogene doelwit. Vervolgens heeft incorporatie van de minimale Bgt bindend peptide (BBS) is gebruikt om de handel van zowel prikkelende en remmende ligand-gated ionkanalen en G-eiwit gekoppelde receptoren 2,10,16-21 bestuderen. Dit BBS-gebaseerde techniek biedt voordelen voor andere benaderingen gebruikt voor mensenhandel studies zoals oppervlakte biotinylatie methoden, antilichaam etikettering van levende cellen met antilichamen tegen extracellulaire epitopen, en fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP). Tijdens celoppervlak biotinylatie vrije amines covalent gemodificeerd, met de potentie om cellulaire activiteit beïnvloeden. Antilichamen gebaseerde studies vaak gehinderd door oppervlakte-antigeen clustering of aftopping, die handel gebeurtenissen kan veranderen. Door het bleken stap FRAP studies, een belangrijke zorg is beschadiging van de onderliggende cellulaire structuur. Een bijkomend voordeel is dat BBS gemerkte constructen kunnen ook worden gebruikt voor biochemische methodologieën met biotine gekoppeld bungarotoxin om te beoordelen receptor handel. Deze techniek is direct voor cellijnen en primaire cellen. Voor gebruik in cellen die nicotine acetylcholine (nAChR) receptoren, moet de nAChR antagonist tubocurarine het hele protocol gebruikt worden zoals aangegeven. Het uitvoeren van een eenvoudige oppervlak Bgt labeling (gelijk aan T = 0 tijdstip voor de endocytose Protocol) op getransfecteerde cellen in de afwezigheid van tubocurarine zal bewijzen endogene nAChR verschaffen.

Een belangrijke overweging voor deze techniek is geschikt inbrengen van de BBS zodat was aanwezig op een extracellulaire locatie wanneer het eiwit van interesse wordt aan de plasmamembraan. Bijvoorbeeld, de N-eindstandige domeinen van GABAAR subeenheden in de vesiculaire lumen bevinden tijdens TRAFficking en word extracellulaire receptor na inbrengen in de plasmamembraan, waardoor specifieke etikettering van celoppervlak receptoren en beoordeling van hun verwijdering uit het celoppervlak door endocytisch evenementen. We hebben eerder aangetoond dat de toevoeging van GFP, myc of BBS epitopen dit domein GABAAR subeenheden functioneel stil. Standaard controles moeten worden uitgevoerd zodat de gecodeerde eiwit tot expressie op niveaus vergelijkbaar met een niet-gecodeerd construct, dat het een goed gelokaliseerd en dat het geen invloed receptorfunctie. Deze karakterisering van getransfecteerde constructen zal ook helpen bij het oplossen van problemen overexpressie zorgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle protocollen die hieronder worden beschreven zijn in overeenstemming met de IACUC en IRB institutionele review boards van de Universiteit van Pittsburgh School of Medicine.

1. Voorbereiding van de hippocampus neuronale kweken in weefselkweek kap

Opmerking: Gebruik steriele techniek en reagentia hele protocol 1.

  1. Bereid poly-D-lysine (0,1 mg / ml in H2O) gecoate dekglaasjes als substraat voor de neuronale kweek.
    1. Plaats 4-5 ronde dekglaasjes in elk 3,5 cm weefselkweek schotel.
    2. Spot 70 ul poly-D-lysine op elke 12 mm dekglaasje. Opmerking: voor live-imaging, een glazen bodem 3,5-cm weefselkweek schotel kan worden gebruikt (ter plaatse 200 ul poly-D-lysine op ingebedde 14 mm glas dekglaasje).
    3. Laat de bereide gerechten in de weefselkweek kap O / N. Poly-D-lysine verdamping te minimaliseren en oppervlakken steriel in de weefselkweek kap, sluiten de schuifraam en zet ee blower O / N. Opmerking: UV lampen worden niet gebruikt tijdens de O / N incubatie.
    4. De volgende ochtend, de afwas 3x met 2 ml H 2 O.
    5. Na het verwijderen van de laatste H 2 O wassen, voeg 2 ml van media om elke 3,5 cm schotel en laat gerechten incubator totdat klaar om de neuronen plaat in stap 1.4.
  2. Hippocampale neuronen worden bereid uit embryonale dag 18-19 (E18-19) ratten (gemodificeerd van Goslin 22).
  3. Transfecteren net losgemaakte neuronen op de dag van het kweken met 1-4 ug maxiprepped construct DNA.
    Opmerking: typisch 3 ug DNA getransfecteerd in 1-2.000.000 neuronen, met een levensvatbaarheid van 50% en een transfectie-efficiëntie van 60% (bijv. ab 2 miljoen neuronen: ((2 x 10 6 neuronen x 0,5) 0,6) bepaalt ca. 1.000.000 neuronen;.. 600.000 daarvan zijn getransfecteerd 1 Verschillende hoeveelheden construct DNA getransfecteerd kunnen worden bij het ​​oplossen van mogelijke problemen vanoverexpressie, gevolgd door passende karakterisering van construct lokalisatie en functie.
  4. Plate de getransfecteerde neuronen op de poly-D-lysine-gecoate dekglaasjes bij een uiteindelijke dichtheid van ongeveer 200.000 neuronen per 3,5 cm schotel. Opmerking: voor een glazen bodem schaal, bord 40.000-50.000 neuronen op de 14 mm glasoppervlak.
  5. Vervang de media 4-24 uur na bereiding van neuronale culturen, laat dan neuronen te ontwikkelen in de couveuse tot 14-17 dagen in vitro (DIV) of gewenst stadium.

2. Endocytose Assay

LET OP: Let op α-bungarotoxin en afval en behandeling tubocurarine:

  1. Afhandeling van alle peptide neurotoxins wordt aanbevolen in de richtlijnen van Biosafety Level-2 (BL-2) onderzoeksprotocollen. Alle juiste persoonlijke beschermende kleding gedragen worden. Gevriesdroogd toxine poeders moet bereid worden volgens de instructies van de fabrikant. Toxine afval Should worden afgevoerd in overeenstemming met de Environmental Health and Safety richtlijnen van de betreffende instelling.
  2. Om potentiële peptide aggregaten die tijdens de opslag kunnen gevormd hebben, α-bungarotoxine monsters worden kort vóór gebruik gecentrifugeerd en het supernatant worden gebruikt voor het experiment.
  3. α-bungarotoxine (SW) voorraden worden opnieuw gesuspendeerd tot een concentratie van 1 mg / ml in steriel H2O en opgeslagen in 10 pi aliquots bij -20 ° C. Fluorescent gekoppeld Bgt voorraden worden gebruikt op 3 pg / ml. Tubocurarine wordt gebruikt bij een eindconcentratie van 150 uM.
  1. Stel bench top kachel blok naar 16 ° C in een koude kamer met dunne aluminium of roestvrij stalen plaat bovenop. Alternatief, indien beschikbaar, een tafelmodel koel / verwarmingsinrichting kan worden gebruikt voor elke stap vereist 16 ° C.
  2. Cool extracellulaire Hepes-gebufferde zoutoplossing (HBS bevat in mM: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 glucose, 1,2 MgCl2 en 2,5CaCl2, pH 7,4) tot 16 ° C in een waterbad.
  3. Transfer neuron gerechten om aluminium plaat bij 16 ° C en koel gedurende 5 minuten.
  4. Verwijder media (houden geconditioneerde media en reserve in incubator voor stap 2.8, endocytose assay tijdstippen) en te vervangen door 1 ml van 16 ° C HBS + tubocurarine (150 uM) gedurende 2 minuten.
  5. Verwijder HBS + tubocurarine gelabelde afvalbak en vervangen door 1 ml 16 ° C HBS + tubocurarine (150 pM) + α-bungarotoxine Alexa 594 [3 ug / ml], incuberen bij 16 ° C gedurende 15 minuten.
  6. Verwijder HBS + tubocurarine + α-bungarotoxin Alexa 594 tot afvalcontainer geëtiketteerd en afwassen 3x met 2 ml van 16 ° C HBS (de wasbeurten kan via aspiratie worden opgevangen in een vacuüm kolf met 50 ml van 50% bleekwater).
  7. Voor live-imaging tijdreeksen experimenten volgende receptor endocytose met behulp van een glazen bodem 3,5 cm cultuur schotel, stappen 2,1-2,6 uitvoeren, dan schotel transfer naar verwarmde podium(Peltier-apparaat) op de microscoop, en beginnen beeldvorming met een confocale of TIRF microscoop setup.
  8. Transfer T = 0 tijdstip dekglaasjes in een schaal van RT 4% paraformaldehyde / 4% sucrose gedurende 20 minuten, verder te gaan met andere dekglaasjes naar stap 2.9.
  9. Voor andere tijdstippen, vervang HBS met airconditioning in evenwicht 37 ° C media (gereserveerd in stap 2.4) en terug te keren naar incubator voor endocytose bij 37 ° C. Opmerking: gesuggereerd extra tijd punten van T = 15, 30, en 60.
  10. Op tijdstippen nodig, neem gerechten uit incubator was snel tweemaal met 2 ml DPBS RT (DPBS zonder calcium, magnesium) bevestig in 4% paraformaldehyde / 4% sucrose gedurende 20 minuten.
  11. Na 20 min fixatie, verwijderen 4% paraformaldehyde / 4% sucrose afvalverpakking afwassen tweemaal met 2 ml RT DPBS.
  12. Incubeer dekglaasjes bij KT gedurende 10 min in immunofluorescentie blokkeeroplossing (blokkeeroplossing = 5% paardenserum, 0,5% BSA in DPBS) bevattende 0,2% Triton X-100 aan doorlaatbaarheidize de neuronen en staat anti-GFP immunokleuring van intracellulaire receptor zwembad en / of de etikettering van andere eiwitten van belang.
  13. Verwijder blok + 0,2% Triton X-100 en incubeer dekglaasjes in immunofluorescentie blok oplossing zonder Triton X-100 gedurende 20-30 minuten.
  14. Voer primaire antilichaam incubaties van dekglaasjes in blok enkele uren bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Opmerking: incubatie van dekglaasjes met primaire bij 4 ° CO / N routinematig levert betere resultaten immunofluorescentie.
  15. Wassen coverslips 3x met DPBS (5 min voor elke wasstap).
  16. Incubeer dekglaasjes met secundaire antilichamen in blokkeeroplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  17. Wassen coverslips 3x met DPBS (5 min voor elke wasstap).
  18. Mount dekglaasjes, hanteren elk dekglaasje individueel: verwijder de overtollige vloeistof uit de achterkant van dekglaasje met lab weefsel, keer dan dekglaasje op 4 pl montage medium op een glasplaatje.
  19. Toestaan ​​dia drogen bij kamertemperatuur afgedekt gedurende 30 minuten dan sterts bij 4 ° C tot klaar voor microscopie.
  20. Afbeelding acquisitie en analyse van het experiment met confocale microscopie (blind voor experimentele conditie). 60X olie NA 1.49 immersie objectief met de volgende lasers: Argon gas 488 nm, 561 diode, 640 diode.
    1. Met dezelfde beeldaanwinst instellingen, verwerven enkele beelden Z gedeelte met de neuronale cel lichaam en verscheidene dendritische processen focus.
    2. Kwantificeren α-bungarotoxine Alexa fluorescentiesignaal en GFP immunokleuring langs 20 urn 3-4 proximale dendrieten per neuron, met dezelfde drempel voor analyse van endocytose gegevens.
    3. Analyseer gegevens 10-12 neuronen voor elk tijdstip, het experiment te herhalen met verschillende onafhankelijke neuronale culturen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karakterisatie van een BBS gelabeld construct belangrijkste bedienings zoals bepalen of het tot expressie gebrachte eiwit assembleert correct (met name receptoren bestaan ​​uit meerdere subeenheden), traffics naar het celoppervlak en lokaliseert gepast. Remmende synapsen zijn samengesteld uit GABA A receptor oppervlak clusters die colocalize met de remmende steiger eiwit gephyrin en worden apposed presynaptische remmende terminals, geïdentificeerd door de vesiculaire remmende aminozuur transporter dat GABA en glycine ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De BBS gebaseerde vaste en levende technieken die hier beschreven kan worden gebruikt om receptor of andere plasmamembraaneiwit handel in cellijnen, neuronen en andere primaire cellen te volgen. Deze werkwijze is met succes gebruikt voor membraan insertie en verwijdering van ligand-gated ionkanalen en GPCR bestuderen en veranderingen in de handel deze door de aanwezigheid van receptor agonisten en modulatoren. Belangrijke aspecten bevatten passende lokalisatie van het label om een ​​extracellulaire locatie en het uitvoe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondersteuning werd verleend door startup-fondsen van de biologie afdeling Farmacologie en Chemical aan de Universiteit van Pittsburgh School of Medicine. Erkenning van Jacob lab-leden die naar de homevideo bijgedragen: Nicholas Graff.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
P3 Primary Cell 4D kit LonzaV4XP-3024
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugateMolecular ProbesB35450
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugateMolecular ProbesB13422
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugateMolecular ProbesB13423
(+)-Tubocurarine chlorideTocris2820
Montagemedium DAKOcS703
DPBS zonder calcium, magnesiumInvitrogen14190-136
Poly-D-lysine SigmaP6407
Gephyrin antilichaamSynaptic Systems147 0111:300
VIAAT/VGAT antilichaamSynaptic Systems131 0021:1.000
anti GFPLife TechnologiesA64551:2.000
Glasbodem weefselkweekschaalMatTek CorporationP35G-1.5-14-C - Mattek Dishes
Dekvlakken (ronde dekglas), #1 dikte, 12 mmWarner Instruments640-0702

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
  2. Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
  3. Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
  4. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  5. Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
  6. Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
  7. Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
  8. Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
  9. Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
  10. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  11. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  12. Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
  13. Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
  14. Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
  15. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
  16. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
  17. Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
  18. Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
  19. Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
  20. Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
  21. Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
  22. Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bindingplaats voor alfa bungarotoxinereceptorlokalisatie op het oppervlakreceptorendocytoseconfocale microscopieimmunofluorescentiekleuringhippocampale neuronenpH gevoelige GFP reporterfluorescent alfa bungarotoxinereceptor trafficking assay

Gerelateerde artikelen