Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Summary

De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.

Abstract

Immobilisatie van virionen op glasoppervlakken is een cruciale stap in single virion imaging. Hier presenteren we een techniek die is overgenomen uit beeldvormende assays met één molecuul die hechting van enkelvoudige virionen op glasoppervlakken met specificiteit mogelijk maakt. Dit preparaat is gebaseerd op het enten van het oppervlak van het glas met een mengsel van PLL-g-PEG en PLL-g-PEG-Biotine, het toevoegen van een laag avidine en ten slotte het creëren van virionankers door aanhechting van biotinylated virusspecifieke antilichamen. We hebben deze techniek toegepast in een reeks experimenten, waaronder atoomkrachtmicroscopie (AFM) en fluorescentiebeeldvorming met superresolutie. Deze monstervoorbereidingsmethode resulteert in een controleadhesie van de virionen aan het oppervlak.

Introduction

Op lading gebaseerde niet-specifieke interacties worden routinematig gebruikt voor adhesie van virionen in atoomkrachtmicroscopie^1,2. Deze technieken werken vooral goed bij gebruik op niet-ontwikkelde virionen met zeer stijve capsids^3-6. Hoewel deze technieken zeer effectief zijn in het immobiliseren van het monster, voorkomen ze niet dat niet-specifieke binding van eiwitten aan het oppervlak. De aspecifieke binding kan een probleem veroorzaken bij het in beeld brengen van virionen met AFM en superresolutiefluorescentietechnieken die incubaties van het monster met verschillende antilichamen vereisen. Hier schetsen we een monstervoorbereidingsmethode voor specifieke immobilisatie van virionen.

Poly(ethyleenglycol) (PEG) geënt op poly(L-lysine) (PLL) en geadsorbeerd op een glasoppervlak vormt een belangrijk blok voor de elektrostatische interacties van eiwitten met glas⁷. Single molecule assays die immobilisatie van enkele moleculen op glazen oppervlakken vereisen, hebben van deze eigenschap geprofiteerd en deze gebruikt om een specifieke PEG-gebaseerde single molecule immobilisatietechniek^8-10te creëren. Dit preparaat werd ook gebruikt om clathrinekooien op het glasoppervlak¹¹ te immobiliseren en een homogene fibronectinecoating te creëren voor de hechting van de controlecel ¹².

We hebben de monstervoorbereidingsmethode op basis van PLL-g-PEG-adsorptie op glasoppervlakken van beeldvormingsmethoden met één molecuul overgenomen en toegepast op beeldvorming van enkelvoudige virionen van vesiculaire stomatitisvirus (VSV). Deze enkelvoudige virionen werden afgebeeld met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). Soortgelijke experimenten werden ook uitgevoerd op gefunctionaliseerde kralen als een controle. De virionen werden ook afgebeeld door fluorescentiemicroscopie met superresolutie, waarbij een VSV-G-antilichaam met Alexa 647 werd gebruikt om een afbeelding te maken van de envelop van enkele virionen. Fluorescerende beeldvorming met hoge resolutie maakt gebruik van lokalisatie van enkele moleculen om een afbeelding^13-15te maken. fPALM bi-planaire beeldvorming maakt lokalisatie van enkele moleculen mogelijk met 20 nm in vlak en 50 nm resolutie langs de optische as^15,16. Deze bi-planaire techniek werd gebruikt om fluorescerende beelden met superresolutie in beeld te brengen die in deze studie aanwezig waren. Een alternatieve techniek met vergelijkbare resultaten is STORM^13,17,18.

Zowel AFM als superresolutie fluorescerende beelden van VSV die door de in dit document beschreven procedures aan het glas waren verankerd, toonden een specifieke binding van virionen aan het glas met minimale niet-specifieke interacties¹⁹. Hier presenteren we de voorbeeldvoorbereidingsprotocollen voor de AFM en superresolutie fluorescentie beeldvormingsexperimenten. In het kort: Schone glasafdekkingen worden gefunctionaliseerd door een mengsel van PLL-g-PEG en PLL-g-PEG-biotine te adsorberen. Het is typisch voor deze dunne film om tussen 15-25% gefunctionaliseerd biotine op een gecoate oppervlakte te verstrekken. De coverslips worden verder geïncubeerd met tetramere avidin. Een biotinylated viraal antilichaam wordt vervolgens gebruikt om een unieke bindingsplaats voor de virionen te creëren. Binding van het antilichaam kan op twee manieren worden gedaan.

De eerste methode is geoptimaliseerd voor AFM, maar blijft geschikt voor superresolutie fluorescentie beeldvorming. Bij deze methode wordt het avidin gecoate oppervlak behandeld met biotinylated antilichaam voorafgaand aan virale adhesie. De geïmmobiliseerde virionen worden behandeld met Alexa 647 gelabeld antilichaam om de envelop te bedekken en fluorescentiebeeldvorming met superresolutie van de virionen mogelijk te maken.

De tweede methode is om het virus in oplossing aan te vallen met het biotinylated antilichaam en Alexa 647 gelabeld antilichaam voordat de virussen aan het met avidin behandelde oppervlak worden vastgehouden; deze methode is geoptimaliseerd voor superresolutie fluorescentiebeeldvormingsexperimenten waarbij herstel van de virale envelop belangrijk is. Deze methode heeft het voordeel dat uniforme antilichaamcoating op het virale oppervlak mogelijk is. Het biotinylated antilichaam kan worden gemengd met Alexa 647 gelabelde virale antilichamen in verhoudingen die voldoende adsorptie van het virus naar het met avidin behandelde oppervlak mogelijk maken met behoud van een hoge concentratie fluorescerend label aan de buitenkant van de virale envelop. Deze Alexa 647 gelabelde virale antilichamen zijn niet biotinylated en hun overmaat kan worden weggespoeld om achtergrondgeluid te verminderen.

Protocol

1. Voorbereiding van de chemie

1. Bereiding en opslag van PLL-g-PEG-Biotine en avidin:
   1. Los het polymeer PLL-g-PEG-biotine op in PBS-buffer volgens de aanwijzingen van de fabrikant bij een concentratie van 1,0 mg/ml.
   2. Aliquot volgens de grootte van de afdeklip (zie tabel 1)en bewaren bij -80 °C gedurende maximaal één jaar.
2. Bereiding en opslag van Avidin/NeutrAvidin
   1. Los de ongelabelde Avidin/NeutrAvidin op in pbs-buffer volgens de aanwijzingen van de fabrikant bij een concentratie van 1,0 mg/ml.
   2. Aliquot volgens de grootte van de afdeklip (zie tabel 1)en bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 3 jaar.
3. Voorbereiding van virusmonsters: Bereid virusmonsters voor volgens experimentele behoefte en laboratoriumprotocol voorafgaand aan deze test. Gebruik stap 1.3.1 voor methode 5A of 1.3.2 voor methode 5B.
   1. Bereid virusmonsters voor methode 5A voor op fase 2. Gebruik bereide virale monsters binnen 1-2 dagen na bereiding, of aliquot volgens de grootte van de hoesstrook (zie tabel 1)en flash freeze in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C gedurende maximaal één jaar. Bij ontdooiing onmiddellijk gebruiken.
   2. Bereid virusmonsters voor methode 5B vergelijkbaar met 1.3.1. Ontdooi aliquots van het virus vóór 5B en bewaar bij 4 °C niet meer dan 24 uur voordat u zich mengt met antilichamen.
4. Bereid geschikte biotinylated antilichamen voor het experiment voor.

2. Coverslip reiniging ter voorbereiding op chemische behandeling

1. Plaats afdeklips in een teflon afdekliprek van de juiste grootte dat ze verticaal houdt en dompel ze onder in een bekerglas gevuld met gefilterde (0,2 μm) ethylalcohol (190 proof).
2. Soniceer de dekenslips in de gefilterde ethylalcohol (190 proof) gedurende 30 minuten.
3. Verwijder de afdeklips van alcohol en spoel de afdeklips uitgebreid af met ultrapure water.
4. Plaats gespoelde afdeklips in een apart schoon Teflon rek en bekerglas gevuld met 1 M NaOH.
5. Soniceer de coverslips in de 1 M NaOH gedurende 30 min.
6. Verwijder de afdeklipjes van NaOH en spoel ze uitgebreid af met ultrapure water.
7. Droog de gespoelde afdeklips met een stikstofstroom en plaats ze in een schoon, droog Teflon-rek.
8. Controleer de afdeklips op zichtbare film of deeltjes die op de afdeklip achterblijven. Als er zichtbaar materiaal overblijft, is de afdeklip niet goed gereinigd en gespoeld. Als de stap 2.1-2.7 niet goed is gereinigd.
9. Reinig de deklipjes gedurende 2 minuten met zuurstof-plasma. Deze stap is optioneel, maar wordt aanbevolen.

3. Vorming van de PLL-g-PEG Thin Film Layer

1. Onmiddellijk na het drogen in de stikstofstroom (of het optionele zuurstofplasma) plaatst u een afdeklip horizontaal in een steriele petrischaal. Pipet in het midden van de afdekkingenlip een passende hoeveelheid ontdooide PBS gebufferde PLL-g-PEG-biotine (zie tabel 1).
2. Plaats een andere gereinigde hoeslip bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Merk op dat deze methode bestaat uit het hebben van twee coverslips die hun chemische films incuberen door hun chemisch behandelde "actieve gezichten" naar elkaar toe te richten, alleen gescheiden door de huidige chemische laag. Zorg ervoor dat er voldoende vloeistof is, zodat het volume tussen de twee afdeklips volledig gevuld is met vloeistof, maar dat er geen vloeistof uit de afdeklips lekt (zie tabel 1). Het "actieve gezicht" duidt voortaan deklipvlakken aan die in contact zijn geweest met de vloeistof in de sandwichconfiguratie.
3. Plaats het deksel van de Petrischaal over de broodje coverlip en incubeer bij RT gedurende 45-60 min.
4. Verwijder het deksel van petrischaaltje en pak de sandwich op met een pincet. Zorg ervoor dat u overtollig vocht niet uitknijpt. Gebruik de duim en wijsvinger om de sandwich lichtjes te knijpen en schuif de afdeklipjes horizontaal in tegengestelde richting ten opzichte van elkaar en scheid vervolgens de twee afdeklips van elkaar zonder de actieve gezichten aan te raken.
5. Spoel beide actieve vlakken af met ultrapure water door 25 ml ultrapure water 2-4x over het actieve gezicht te gieten en droog vervolgens de afdeklips met een stikstofstroom. Zorg ervoor dat u opmerkt welke coverslipvlakken actief zijn.
6. Gebruik de afdeklips onmiddellijk of bewaar O/N met het actieve gezicht naar boven in een steriele petrischaal die in een stofvrije omgeving met een lage luchtvochtigheid is geplaatst.

4. Avidin Binding Verbetering

1. Plaats een met PLL-g-PEG behandelde hoeslip met actief gezicht naar boven in een steriele petrischaal.
2. Pipetteer een geschikte hoeveelheid ontdooide avidin in buffer (voorbereid in stap 1.2) op het midden van het actieve gezicht.
3. Plaats een andere afdeklip (actief gezicht naar beneden) bovenop de vloeistof in de sandwichmethode. Let op het actieve gezicht van de coverslips. Het is belangrijk dat de actieve gezichten tijdens de incubatie in contact komen met de vloeistof (zie stap 3.2).
4. Plaats het deksel van de Petrischaal over de broodje deklip en incubeer bij RT gedurende 25-30 min.
5. Verwijder het deksel van de Petrischaal en scheid de twee deksellipjes zoals beschreven in stap 3.4, zorg ervoor dat u de actieve vlakken bijhoudt en niet aanraakt.
6. Spoel beide actieve vlakken af met ultrapure water door 25 ml ultrapure water 2-4x over het actieve gezicht te gieten en droog vervolgens de afdeklips af met een stikstofstroom. Let op het actieve gezicht van de coverslips. Onmiddellijk gebruiken voor de volgende fase.

BELANGRIJKE OPMERKING: Er zijn twee verschillende methoden voor het voltooien van de monstervoorbereiding, afhankelijk van het type test dat het experiment met zich meebrengt. De experimenteerder moet doorgaan met stadium 5A waarin het virus aan het glas is verankerd voordat een aanvullende antilichaambehandeling wordt toegevoegd die nodig is voor beeldvorming met superresolutie. 5B beschrijft een alternatieve methode om het virus in oplossing te labelen voordat het aan het glas wordt verankerd. De representatieve gegevens in dit manuscript worden opgesteld met behulp van 5A. Een geschikte methode moet worden gekozen op basis van het experimentele testtype.

5A. Actieve gezichtsantilichaam tether

1. Onmiddellijk na het drogen met een stikstofstroom in fase 4.6, plaatst u een met avidin behandelde hoezenlip actief met het gezicht naar boven in een steriele petrischaal.
2. Pipetteer een geschikte hoeveelheid ontdooid biotinylated antilichaam in buffer op het midden van het actieve gezicht (zie tabel 1).
3. Plaats een andere afdeklip (actief gezicht naar beneden) bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Let op het actieve gezicht van de deklips, het is belangrijk dat de actieve gezichten in contact komen met de vloeistof voor incubatie (zie stap 3.2.).
4. Plaats het deksel van de Petrischaal over de broodje coverlip en incubeer bij RT gedurende 45-60 min.
5. Verwijder het deksel van de Petrischaal en scheid de twee deksellipjes zoals beschreven in stap 3.4, zorg ervoor dat u de actieve vlakken bijhoudt en niet aanraakt.
6. Spoel beide actieve vlakken af met PBS door 25 ml PBS 2-4x over het actieve gezicht te gieten, niet drogen en onmiddellijk gebruiken. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn.
7. Plaats een met antilichamen behandelde deklip actief gezicht omhoog in een steriele petrischaal en pipetteer een geschikte hoeveelheid ontdooid virus in de buffer op het midden van het actieve gezicht.
8. Plaats een andere afdeklip (actief gezicht naar beneden) bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Let op het actieve gezicht, omdat het belangrijk is dat de actieve gezichten in contact zijn met de vloeistof voor incubatie (zie stap 3.2.).
9. Plaats het deksel van de Petrischaal over de broodje coverlip en incubeer bij RT gedurende 45-60 min.
10. Verwijder het deksel van de Petrischaal en scheid de twee deksellipjes zoals beschreven in stap 3.4, zorg ervoor dat u de actieve vlakken bijhoudt en niet aanraakt.
11. Spoel beide actieve vlakken af met PBS door 25 ml PBS 2-4x over het actieve gezicht te pipetten. Droog de afdeklips niet af, maar plaats ze onmiddellijk in een Teflon-rek en beker gevuld met PBS. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn.
12. Gebruik de bereide monsters onmiddellijk of bewaar ze maximaal drie dagen in een geschikte buffer bij 4 °C zonder significant verlies van integriteit.
    
    Belangrijke OPMERKING: Als monsters in een AFM-test moeten worden gebruikt, is het preparaat compleet en kunnen ze onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen zoals beschreven in stap 5A.20 - 5A.21. Als monsters moeten worden gebruikt in een fluorescentiebeeldvormingstest met superresolutie, gaat u verder met de antilichaametikettering die wordt beschreven in stap 5A.12 - 5A.19.
13. Plaats beide met virussen behandelde coverslips met het actieve gezicht naar boven in een steriele Petrischaal en pipet voldoende eiwitblokkeerbuffer op de coverslips om voldoende vloeistofvolume te bedekken om de centrale 95% van de coverslip te bedekken zonder een blokkerende buffer van de afdeklip te laten stromen (meestal 100 - 200 μl.) Incubeer bij RT gedurende 60-90 minuten.
14. Verwijder voorzichtig de blokkeerbuffer door de afdeklips één voor één uit de Petrischaal te verwijderen en de vloeistof van de afdeklip in een afvalbeker te gieten. Pas op dat u de afdeklip niet laat vallen.
15. Spoel beide actieve vlakken af met PBS door 25 ml PBS 2-4x over het actieve gezicht te gieten, niet drogen en onmiddellijk gebruiken. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn.
16. Plaats een enkele blokkerende buffer behandelde coverslip actief gezicht omhoog in een steriele Petrischaal, en pipetteer een geschikte hoeveelheid fluorescerend gelabeld viraal antilichaam in buffer op het midden van het actieve gezicht.
17. Plaats een andere afdeklip (actief gezicht naar beneden) bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Merk op welk gezicht actief is, het is belangrijk dat de actieve gezichten in contact zijn met de vloeistof voor incubatie (zie stap 3.2).
18. Plaats het deksel van de Petrischaal over de deksellip sandwich en incubeer bij RT gedurende 30 minuten.
19. Verwijder het deksel van de Petrischaal en scheid de twee deksellipjes zoals beschreven in stap 3.4, zorg ervoor dat u de actieve vlakken bijhoudt en niet aanraakt.
20. Spoel beide actieve vlakken af met PBS door 25 ml PBS 2-4x over het actieve gezicht te gieten, niet drogen en onmiddellijk gebruiken. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn.
21. Droog de afdeklips niet af, maar plaats ze in een Teflon-rek in een bekerglas gevuld met PBS. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn.
22. Gebruik de bereide monsters onmiddellijk of bewaar ze maximaal drie dagen in een geschikte buffer bij 4 °C zonder significant verlies van integriteit.

5B. In oplossing antilichaamaanval

Deze methode is een optionele verbetering van de etiketteringsstrategie voor de fluorescentiebeeldvorming met superresolutie. Door de in-oplossingsaanval aan te brengen, kan een betere antilichaamcoating op het virale oppervlak worden bereikt.

1. Meng antilichaamoplossingen in verhoudingen volgens experimenten die nodig zijn. Voorbeeld 1:4 verhouding van 0,01 mg/ml biotinylated antilichaam tot 0,01 mg/ml fluorescerend gelabeld antilichaam geeft een goede bindingsaffiniteit en zorgt voor een goed envelopherstel in een beeldvormingstest met superresolutie.
2. Meng gelijke delen van het antilichaam en de virusoplossingen die respectievelijk zijn bereid in (5B.1) en (1.3). Meng voorzichtig door een paar keer op en neer te gaan in de aliquot. Deze resulterende oplossing kan tot 24 uur bij 4 °C worden bewaard.
3. Na voltooiing van stap 4.6 plaatst u een met avidin behandelde deklip met actief gezicht naar boven in een steriele petrischaal.
4. Pipetteer een geschikte hoeveelheid virus met antilichaamoplossing (bereid in stap 5B.2) op het midden van het actieve gezicht.
5. Plaats een andere afdeklip (actief gezicht naar beneden) bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Let op het actieve gezicht, omdat het belangrijk is dat de actieve gezichten in contact komen met de vloeistof voor incubatie (zie stap 3.2).
6. Plaats het deksel van de Petrischaal over de broodje coverlip en incubeer bij RT gedurende 45-60 min.
7. Verwijder het deksel van de Petrischaal en scheid de twee deksellipjes zoals beschreven in stap 3.4, zorg ervoor dat u de actieve vlakken bijhoudt en niet aanraakt.
8. Spoel beide actieve vlakken af met PBS door 25 ml PBS 2-4x over het actieve gezicht te pipetten. Droog de afdeklips niet af, maar plaats ze onmiddellijk in een Teflon-rek en beker gevuld met PBS. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn.
9. Gebruik bereide monsters onmiddellijk of bewaar ze maximaal drie dagen bij 4 °C zonder significant verlies van integriteit.

6. Atomic Force Microscopie Materiaal Eigenschap Meting

1. Schakel de AFM lasers in en open de AFM software. Selecteer de juiste scanmodus voor de gewenste test in het openingsdialoogvenster. Alle benodigde vensters moeten standaard worden geopend; als u de gebruikershandleiding niet raadpleegt om de gewenste vensters te openen.
2. Selecteer een cantilever die geschikt is voor de gewenste meting en plaats deze in de cantileverbehuizing volgens de richtlijnen van de fabrikant. Er zijn een breed scala aan omstandigheden en experimenttypen waarvoor er een verscheidenheid aan cantilevers is. De experimenteerder moet cantilevers onderzoeken op basis van hun behoefte.
3. Plaats de cantileverbehuizing volgens de richtlijnen van de fabrikant in de AFM-kop.
4. Als het monster onder natte omstandigheden moet worden gebruikt, verwijdert u het monster uit de opslagbuffer en gaat u verder met stap 6.7.
5. Als het monster onder omgevings(droge) omstandigheden moet worden gebruikt, verwijdert u het monster uit de opslagbuffer en spoelt u het kort af door het in een bekerglas met ultrapure water te dompelen. Opmerking: Dit laat een dunne hydratatielaag achter op het monster die capillaire aantrekkingskracht kan veroorzaken met cantilevers met een lage veerconstante.
6. Als het monster in omgevingsomstandigheden (droog) moet worden gebruikt, droogt u het monster voorzichtig af met een stikstofstroom.
7. Droog de achterkant van de afdeklip voorzichtig af met een stofvrij filterpapier en zorg ervoor dat u het actieve vlak van het monster niet aanraakt.
8. Plaats het monster in de juiste AFM-monsterhouder en plaats het monster vervolgens op het AFM-podium.
9. Als het monster onder natte omstandigheden moet worden afgebeeld, voert u een kleine hoeveelheid buffer op het midden van het monster (~ 10 μl).
10. Plaats de AFM-kop boven het monster.
11. Als het monster nat is, zorg er dan voor dat de cantilever- en AFM-tip de oppervlaktelaag binnendringen en dat er geen bellen tussen de cantilever- en cantileverbehuizing zitten.
12. Lijn de AFM-laser uit met de cantilever in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant om het optimale signaal te verkrijgen.
13. Meet de cantilever resonantiefrequentie en stel de scanfrequentie in op basis van het experimenttype.
14. Laat de AFM-tip naar de oppervlakte zakken en optimaliseer de signaalinstellingen.
15. Voer een 20 μm vierkante AFM-scan uit in de modus van uw keuze. De tikmodus (AC) werd gebruikt bij het genereren van representatieve gegevens. Identificeer viruskandidaten op geschatte hoogte, die meestal kan worden gezien als scherpe spikes op het glazen oppervlak.
16. Selecteer een viruskandidaat en centreer de scankop erboven.
17. Voer een vierkante scan van 250 nm (of de juiste superresolutiescan) uit over het geselecteerde virus om de topologie en oriëntatie ervan te verkrijgen.
18. Selecteer een punt op het virus voor de materiaaleigenschapsmeting(bijv. het centrum van een bolvormig virus voor de modulusmeting van een Young) en voer de meting uit volgens de aanwijzingen van de fabrikant.

7. Beeldvormingsmethode met superresolutie

1. Open de beeldvormingssoftware met superresolutie en kalibreer de software volgens de richtlijnen van de fabrikant.
2. Kalibreer de beeldvormingsapparatuur met superresolutie in overeenstemming met de aanwijzingen van de fabrikant met behulp van fluorescerende kralen.
3. Stel de monsterbeeldvormingsbuffer samen uit voorraden vlak voor de beeldvorming door 50 μl 1 M MEA en 100 μl 10x Gloxy te combineren met 850 μl voorraadbuffer. Houd de beeldvormingsbuffer op ijs voor de duur van het experiment.
4. Verwijder een voorbereide afdeklip met monster uit de opslagbuffer en spoel deze 5x af door deze in een beker met ultrapure water te dompelen.
5. Droog de niet-actieve hoezenlip met een stofvrij filterpapier. Zorg ervoor dat u het actieve gezicht niet aanraakt.
6. Plaats in een monsterhouder van een beeldvormingssysteem en voeg 250 μl beeldvormingsbuffer toe aan de monsterhouder. Het is redelijk om de beeldvormingsbuffer op het monster om de 2 uur uit te wisselen om consistente resultaten te behouden.
7. Bedek de monsterhouder met parafilm om de atmosferische interactie met de ruimteomgeving te verminderen.
8. Plaats de monsterhouder in de beeldvormingsapparatuur voor beeldvorming.
9. Breng het monster in beeld met behulp van de aanwijzingen van de fabrikant.
10. Beeld het monster volgens de superresolutietechniek die wordt gebruikt. Zorg ervoor dat u de beeldomstandigheden aanpast om het signaal te optimaliseren en tegelijkertijd de activering van fotoschakelbare fluoroforen te verminderen.
    
    BELANGRIJKE OPMERKING: Beeldvormingsomstandigheden zijn afhankelijk van het monster en variëren afhankelijk van de experimentele behoefte. Een typisch experiment met Alexa 647 dat efficiënt is geïnitialiseerd naar hun donkere toestand in de beeldvormingsbuffer, kan vervolgens worden geactiveerd door toepassing van 405 nm UV-licht. Afbeeldingen worden verkregen door een schaarse subset van Alexa 647-moleculen in een dicht gelabeld monster te bekijken en elke fluorofoor te lokaliseren met een precisie die voornamelijk wordt beperkt door het aantal verzamelde fotonen. Deze procedure wordt herhaaldelijk door de software geïntensreerd totdat een gewenst aantal acquisitiecycli heeft plaatsgevonden. De experimenteerder moet deze instelling laten correleren met elke fluorofoor in het monster die op de foto is gebleekt.
11. Wanneer de beeldvorming is voltooid, sluit u de beeldvormingsapparatuur af volgens de aanwijzingen van de fabrikant. De software kan open blijven voor gegevensanalyse.
12. Data-analyse is sterk afhankelijk van experiment; identificeer virussen echter in alle gevallen aan de slag met hun volledige breedte op maximaal de helft, wat wordt vergeleken met de bekende virusafmetingen, waarbij rekening wordt gehouden met de extra grootte van fluorescerende etiketten.
13. Voor een betere visualisatie bekijkt u voorbeelden door gebruik te maken van de optie Isosurface rendering of de volumetrische renderingoptie, die beide meestal worden gevonden in imaging-software met superresolutie.

Results

Single virion imaging met afm:

Het hierboven beschreven monstervoorbereidingsprotocol werd gebruikt bij het verankeren van virionen van het wilde type aan het glasoppervlak. VSV virionen zijn kogelvormig 180 nm lang en 80 nm in diameter. Omdat er een verscheidenheid aan virionen zijn waarvoor deze techniek kan worden toegepast, wordt het concept hier ook gedemonstreerd op biotinylated 36 nm kralen. De daaruit voortvloeiende AFM-experimenten zijn weergegeven in figuur 1. Het is belangrijk op te merken dat de VSV virionen een lagere Young's modulus (100 MPa) hebben in vergelijking met de niet-ontwikkelde virussen (GPa). De specifieke beelden van single virion VSV werden verkregen onder tapmodus in omgevingsomstandigheden met een stijve cantilever. Het doel was om het virus zo te vervormen dat de extra eiwitdichtheid binnen het virus zichtbaar wordt als een bult binnen het AFM-imago. Deze methode wordt gebruikt om de extra eiwitdichtheid in de virusholte te detecteren¹⁹.

Single virion super resolutie beeldvorming:

Alexa 647 gelabelde VSV-G antilichamen werden gebruikt om de envelop van individuele VSV virionen te coaten voor superresolutie experimenten met behulp van methode 5A. Om de tetheringdichtheid en de lage aspecifieke binding aan te tonen, wordt in figuur 2Aeen grote scan van het monster weergegeven . Het herstel van de virale envelop op een representatieve virion is weergegeven in figuur 2B (blauwe isosurface).

Figuur 1. AFM beeldvorming van kralen en VSV op het gefunctionaliseerde PEGG oppervlak. AFM-scan van 36 nm biotinylated beads (A, B) en een VSV virion (C) verankerd aan het oppervlak met een biotinylated VSVG antilichaam. AFM werd gedaan in ac lucht topografie scan modus. De tipradius is <25 nm en metingen werden uitgevoerd onder krachtmodulatie en lichttikken. De tip had een krachtconstante van 3 N/m en resonantiefrequentie 75 kHz met onzekerheid van 15 kHz. Terwijl de kralen hun hoogte behouden tijdens de AFM-scan, heeft de VSV virion een aanzienlijk kleinere jonge modulus en is het aanzienlijk vervormd in hoogte. In deze afbeelding werd de virion specifiek afgebeeld met een stijve cantilever in tapmodus die een kleine xy convolutie produceerde (gebruikt om de tip versus het stompe uiteinde van het virus te bepalen) en het hoogteverschil tussen de punt en het stompe uiteinde van het virus wordt gebruikt om extra eiwitdichtheid aan het stompe uiteinde van het virus te detecteren¹⁹.

Figuur 2. Fluorescentie gebaseerde beeldvorming van VSV virionen op het PEGG gefunctionaliseerde oppervlak. A) recombinante VSV-virionen geïmmobiliseerd op het PEGG-oppervlak met behulp van een biotinylated anti VSVG-antilichaam afgebeeld in brede veldfluorescentie. B) Fluorescentiereconstructie met hoge resolutie van de envelop van VSV die aan het PEGG-oppervlak is bevestigd door middel van een biotinylated anti VSVG-antilichaam en versierd met Alexa 647 gelabelde anti-VSVG-antilichamen (methode 5A werd gebruikt voor het maken van deze afbeeldingen). Het blauwe oppervlak is een 2D isosurface projectie. Links ziet u een model van het kogelvormige virus. 

Coverslip Grootte	vloeistof
40 mm	65 μl
35 mm	50 μl
30 mm	36 μl
25 mm	25 μl
20 mm	16 μl

Tabel 1. Vloeibare aliquots volgens coverslip grootte.

Discussion

Enkelvoudige virion imaging met AFM en High-resolution fluorescentie imaging kan worden gebruikt als alternatieve methodologie voor CryoEM tomografie. Elk van deze methodologieën heeft zijn specifieke sterke punten. Afm kan bijvoorbeeld worden gedaan op WT virionen zonder dat het monster of de interne virale eiwitten hoeven te worden getagd. De locatie van virale structuren is gedeconvoleerd van hun bijdragen aan de elastische eigenschappen van het virion.

Single virion super-resolution imaging in combinatie met de nieuw ontwikkelde virale reverse genetische benaderingen wordt een krachtige techniek voor het lokaliseren van lage copy number virale eiwitten²⁰. Recombinante virussen met vervanging van hun eiwitten door eiwitten versmolten met fluorescerende eiwitten kunnen worden gemaakt en gezuiverd met behulp van deze omgekeerde genetische benaderingen. Hoewel beeldvorming met superresolutie specificiteit heeft, deels vanwege de genetische tagging, vereist het het gebruik van de mutante virussen.

AFM en superresolutiebeeldvorming zijn complementaire methoden die zeer vergelijkbare monstervoorbereidingen gebruiken. De methoden die in dit artikel worden beschreven, die worden aangenomen, vormen eerdere beeldvormingstesten met één molecuul, maken verankering van enkelvoudige virionen mogelijk met weinig effecten op de topologie van de virionen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass coverslips (fPALM)	Electron Microscopy Services	72225-01	25 mm Coverslips
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)	SuSoS	-	Stock: 0,5 mg/ml in PBS
NeutrAvidin biotin-binding protein	Invitrogen	A2666	Stock: 0,25 mg/ml in PBS
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21245	1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7,2 buffer
α-VSV-G	Invitrogen	ab34774	1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7,2 buffer
Gluox	Sigma	G2133-250KU	Glucose oxidase type zeven van Aspergillius
Catalase	Sigma	C40-100mg	Catalase van Runderlever
MEA	Sigma	30070-10G	Cysteamine (MEA
Stock Buffer			50 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 10 mM NaCl + 10% glucose
NTE			10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA
Slide-A-Lyzer, mini dialyse-eenheid	Thermo Scientific		10.000 MW
Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1	Fisherbrand	35 CIRCLE #1