Methodenartikel

Methoden voor het vergemakkelijken van microbieel groei op afvalstromen van pulpmolens en karakterisering van het biodegradatiepotentieel van gekweekte microben

DOI:

10.3791/51373

⸱

12 december 2013

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University, 2Department of Forest Biomaterials, North Carolina State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Industriële afvalstoffen kunnen worden verzameld en gemodificeerd om microbiële groei te analyseren. Technieken voor de extractie van lignocellulose leveren componenten om specifieke biologische afbraakcapaciteit te analyseren. Gaschromatografie-massaspectrometrie identificeert fermentatieproducten van micro-organismen die zijn gekweekt op pulpafval. Deze methoden bepalen het metabolische vermogen van micro-organismen om pulpafval af te breken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het kraftproces wordt toegepast op houtsnippers voor de scheiding van lignine van de polysacchariden binnen lignocellulose voor pulp die een hoogwaardig papier zal produceren. Zwarte liquor is een pulpafval dat wordt gegenereerd door het kraftproces en dat potentieel heeft voor downstream bioconversie. Echter, de recalcitrante aard van de lignocellulosebronnen, zijn chemische derivaten die het grootste deel van de beschikbare organische koolstof binnen zwarte liquor vormen, en de basische pH vormen uitdagingen voor microbiële biodegradatie van dit afvalmateriaal. Methoden voor het verzamelen en modificeren van zwarte liquor voor microbieel groei zijn gericht op het gebruik van dit pulpafval om de lignine, organische zuren en polysaccharide afbraakbijproducten om te zetten in waardevolle chemicaliën. De gepresenteerde lignocellulose-extractietechnieken bieden een reproduceerbare methode voor de bereiding van lignocellulose-groeisubstraten voor het begrijpen van de metabolische capaciteiten van gekweekte micro-organismen. Gebruik van gaschromatografie-massaspectrometrie maakt de identificatie en kwantificering mogelijk van de fermentatieproducten die resulteren uit de groei van micro-organismen op pulpafval. Deze methoden kunnen, wanneer ze samen worden gebruikt, de bepaling van de metabolische activiteit van micro-organismen vergemakkelijken met potentieel om fermentatieproducten te produceren die een grotere waarde zouden bieden aan het pulpsysteem en afvalwatervervuiling te verminderen, waardoor de potentiële winst van papiermolens toeneemt en aanvullende toepassingen voor zwarte liquor worden geboden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het pulpen van hout is een chemisch intensief proces dat gedurende vele jaren is geoptimaliseerd om een systeem met minimale afval te creëren. Sommige uitkomsten van dit proces kunnen echter worden gebruikt om producten met een hogere waarde te produceren. Zwarte liquor is een voorbeeld hiervan. Het wordt gegenereerd door het kraftproces, de dominante methode voor chemische pulping, die 85% van de wereldwijde lignineproductie vertegenwoordigt1. Het kraftproces (Figuur 1) gebruikt temperatuur (160-200 °C), druk (120 psig) en de chemicaliën in witte liquor (natriumhydroxide en natriumsulfide) om de lignine uit de houtvezels op te lossen2,3. Zwarte liquor bevat lignine, organische zuren en polysacharide-afbraakbijproducten4. Het wordt verbrand om stoom te produceren en chemicaliën terug te winnen in de terugwinningsketel die thermische energie levert voor downstream papier- en pulpproductieprocessen. Het volume zwarte liquor dat wordt gegenereerd door het pulpen, kan de hoeveelheid overschrijden die de terugwinningsketel effectief kan verwerken. Het lozen van de zwarte liquor als effluent heeft een negatieve invloed op aquatische flora en fauna en is dus geen optie. Toepassing van microbiële organismen die zwarte liquor voor groei kunnen gebruiken, zou voordelig zijn in termen van verhoging van chemische terugwinning en de generatie van waardetoegevoegde producten die de algehele levenscyclusanalyse van het pulpingsysteem zou verbeteren. Chemische en biologische omzetting van lignine-afgeleide monomeren heeft met succes vanilline en kaneelzuur geproduceerd voor gebruik als zoetstoffen en geuradditieven, fenol dat wordt gebruikt voor kunststof en harsen, en cyclohexaan, dat kan worden gebruikt als brandstof5.

Eerder onderzoek naar de biodegradatie van dit pulpafval was gericht op lignine depolymerisatie. Het International Lignin Institute (ILI) meldt dat er jaarlijks tussen de 40 en 50 miljoen ton lignine wordt geproduceerd (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Slechts 1,5% van die lignine wordt gebruikt voor commerciële industriële processen6. Lignine depolymerisatie door laccase en peroxidase-enzymen geproduceerd door witrot-zwammen van de Phanerochaete en Trametes-geslachten is uitgebreid bestudeerd7. Bodembacteriën die bekend staan om het afbreken van aromatische verbindingen zoals Nocardia en Rhodococcus8, Pseudomonas putida mt-29 en Streptomyces viridosporus T7A10 zijn ook gebleken capabel te zijn in lignine-afbraak. Bacteriële afbraak van pulpafval is veelbelovend omdat sommige bacteriën kunnen gedijen in de zoute en alkalische (pH 10-14) omstandigheden die kenmerkend zijn voor de pulpafval-effluenten11. Terwijl lignine het belangrijkste bestanddeel van zwarte liquor is, kunnen micro-organismen ook de andere componenten die zwarte liquor vormen, afbreken. Deze technieken identificeren niet uitsluitend lignine-afbrekende micro-organismen, maar dienen om micro-organismen te identificeren die direct kunnen worden toegepast op de zwarte liquor van pulpafval in plaats van op de verder verwerkte bestanddelen.

Zwarte liquor werd verzameld en aangepast voor microbieel groei door neutralisatie en filter-sterilisatie. Groeivereisten voor micro-organismen werden geïdentificeerd voor een omgevingsmicrobiologisch isolaat door minimale mediagroei-experimenten op lignocellulose-componenten geproduceerd door een nieuw lignocellulose-extractieprotocol. Groeimedia werden geanalyseerd door gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) om de metabolische producten van het omgevingsmicrobiologisch isolaat te bepalen wanneer het werd gekweekt op zwarte liquor als enige koolstofbron. De combinatie van deze technieken biedt een beoordelingsinstrument om de metabolische capaciteit van een micro-organisme te bepalen wanneer het wordt gekweekt op pulpfabrieksafval zoals zwarte liquor. Het gebruik van dergelijke technieken biedt ook inzicht in de waarde van de toepassing van specifieke micro-organismen op pulpfabrieksafval voor de generatie van bijproducten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Verzameling van zwarte liquor en voorbereiding van zwarte liquor voor groeiculturen

  1. Verzamel een monster zwarte liquor uit de uitlaatklep bevestigd aan de kraftdigester in een steriele glazen fles en laat het afkoelen tot kamertemperatuur voordat u doorgaat met de volgende stappen.
    Neutralisatie
  2. Voeg 100 ml zwarte liquor monster toe aan een 500 ml beker uitgerust met een roerlat.
  3. Plaats de beker op een roerplaat en pas de snelheid aan op medium.
  4. Voeg langzaam druppels fosforzuur toe tot de zwarte liquor viskeus wordt (viscositeit vergelijkbaar met glycerol).
  5. Aliquoteer alle zwarte liquor oplossing door het langzaam in 50 ml kegelbuizen te gieten en centrifugeer gedurende 30 min bij 9.300 x g.
  6. Plaats het supernatant in de beker en meet de pH met behulp van pH-testlinten. Het pellet van geprecipiteerd lignin kan worden weggegooid en behandeld als niet-gevaarlijk vast afval.
  7. Ga door met het toevoegen van fosforzuur en centrifugeer de oplossing totdat de pH-strips een neutrale pH van het supernatant aangeven.
    Steriliseren
  8. Leidt de oplossing door een 0,22 µm filter om eventuele verontreinigende bacteriën te verwijderen en plaats de gefilterde oplossing in een steriele container voor opslag. Bewaar bij kamertemperatuur.

2. Lignocellulose Extractie

Koolhydraat Separatie

  1. Plaats 5 g switchgrass, dennen of Bermuda gras (gemalen tot 1 mm of kleinere deeltjesgrootte) in een 500 ml Erlenmeyer kolf. Voeg vervolgens 200 ml gedistilleerd of gedeïoniseerd water, 7,5 g NaClO2, 2,5 ml glazuur azijnzuur en een roerlat toe aan de kolf.
  2. Plaats de kolf in een oliebaad geplaatst op een roerplaat bij 80 °C gedurende 1 uur. Pas de snelheid van de roerplaat aan op medium.
  3. Voeg een extra 7,5 g NaClO2 en 2,5 ml glazuur azijnzuur toe aan de kolf. Blijf roeren bij 80 °C in het oliebaad gedurende 30 min.
  4. Herhaal de vorige stap 2x (Opmerking: een totaal van 30 g NaClO2 en 10 ml glazuur azijnzuur wordt toegevoegd aan de kolf met de lignocellulose biomassa). Koel de oplossing af tot kamertemperatuur.
  5. Plaats een blad filterpapier in een Büchner trechter. Plaats de trechter bovenop een zijarmkolf en bevestig deze aan een vacuüm.
  6. Giet de oplossing langzaam in de trechter.
  7. Was het vaste materiaal 3x met 100 ml gedistilleerd of gedeïoniseerd water. Gooi het filtraat weg na het wassen van het vaste materiaal.
  8. Reserveer 1 g van het vaste materiaal en plaats het op een schoon blad filterpapier.
  9. Droog dit vaste materiaal een nacht in een 50 °C oven. Nadat u de steekproef uit de oven hebt gehaald, plaats deze in een opslagviaal gelabeld ‘holocellulose’.
  10. Voeg het resterende vaste materiaal toe aan 250 ml van 10% NaOH (v/v) in een 500 ml Erlenmeyer kolf. Sluit de kolf met een stop.
  11. Plaats de oplossing in een incubator bij 70 °C gedurende 1 uur schudden bij 250 rpm.
  12. Koel de oplossing gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
  13. Verwijder het vaste materiaal met behulp van filterpapier en een Büchner trechter bevestigd aan een zijarmkolf.
  14. Breng het vaste materiaal op een schone blad filterpapier over naar een 50 °C oven en laat het een nacht drogen.
  15. Nadat het residu is opgedroogd, plaats het in een opslagviaal en label het ‘cellulose’.
  16. Breng het filtraat van stap 2.13 over naar een 500 ml Erlenmeyer kolf en voeg 30 ml azijnzuur en 250 ml isopropyl alcohol toe. Sluit de kolf en plaats de oplossing op de werkbank gedurende ten minste 8 uur bij kamertemperatuur.
  17. Breng alle oplossing over naar 50 ml kegelbuizen en centrifugeer de oplossing gedurende 30 min bij 9.300 x g. Pipet de oplossing voorzichtig uit de kegelbuis en gooi weg.
  18. Resuspendeer het pellet in 30 ml gedistilleerd of gedeïoniseerd water door te vortexen.
  19. Herhaal stappen 2.17-2.18 15x om het pellet grondig te wassen.
  20. Verwijder het supernatant en bewaar het pellet voor vriesdrogen. Eenmaal vriesgedroogd, verzamel het monster en plaats het in een viaal gelabeld ‘hemicellulose’.
    Lignine scheiding
    Lignine scheiding protocol gebaseerd op Karaaslan et al.12
  21. Voeg 5 g switchgrass, dennen of Bermuda gras (gemalen tot 1 mm of kleinere deeltjesgrootte) toe aan 500 ml van een oplossing van 0,25 M NaOH en 30% ethanol. Plaats de suspensie in een incubator bij 75 °C met schudden bij 250 rpm gedurende 2 uur.
  22. Koel de oplossing af tot kamertemperatuur.
  23. Plaats een blad filterpapier in een Büchner trechter bovenop een zijarmkolf. Bevestig aan een vacuüm en giet de oplossing langzaam in de trechter.
  24. Gooi het vaste materiaal weg.
  25. Voeg een roerlat toe aan de kolf met het filtraat en plaats de kolf bovenop een roerplaat ingesteld op medium snelheid. Voeg druppelsgewijs geconcentreerd zoutzuur toe aan de oplossing totdat een pH van 2,0 wordt verk

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De verzameling en modificatie van zwarte liquor die wordt gegenereerd in het kraft-pulpingproces (Figuur 1) zal het mogelijk maken om dit pulpafval te gebruiken om de biodegradatiecapaciteit van een enkele bacterieële isolaat of gemengde cultuur te bepalen. Figuur 2 toont aerobe groei gemeten door optische dichtheid van de microbiële omgevingsisolaat gekweekt in LB-media alleen en LB-media aangevuld met 10% geneutraliseerde zwarte liquor. Deze resultaten geven aan dat deze bacterie groei...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een combinatie van technieken die beogen micro-organismen te identificeren die pulpafval kunnen afbreken, de koolstofbronnen die worden gebruikt tijdens groei op pulpafval, en de microbiële metabolische producten die worden geproduceerd wanneer ze worden gekweekt op pulpafval. We hebben het succes van dit protocol aangetoond met de microbiële omgevingsisolaat: een facultatief anaëroob dat kan groeien op 10% zwarte liquor en de componenten van de lignocellulose-extractie als enige koolstofbronnen v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Jim McMurray bedanken voor het leveren van de zwarte liquor en Dr. David Tilotta en August Meng voor hun hulp met GC-MS. Ondersteuning voor Stephanie L. Mathews werd verstrekt door een USDA National Needs Fellowship (toekenningsnummer 2010-38420-20399).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,4-Dioxaan (gecertificeerd ACS)FisherD111Ontvlambaar, vooroxidatie chemisch product
Black LiquorDepartment of Forest Biomaterials at North Carolina State UniversityN/ApH 12.72, 13,67% vaste stof
Ethanol (microbiologiekwaliteit)FisherBP2818
Ethylacetaat (ACS reagenskwaliteit)EMDEX0240-9Ontvlambaar
Glazuur acetic acid (gecertificeerd ACS)EMDAX0073Corrosief
GuaiacolSigma AldrichPHR1136Schadelijk bij inname, corrosief
HP-5 capillaire kolomAgilent19091J-57760 m x 0,18 mm binnendiameter, 0,18 μm dikte
Zoutzuur (gecertificeerd ACS)EMDHX0603P
N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoraceetamide met trimethylchloorsilane 99:1% (BSTFA)Fluka15238Ontvlambaar, veroorzaakt huidbrandwonden en oogbeschadiging bij contact
Na2SO4 (FCC kwaliteit)VWRBDH8026
NaClO2 (80%)Sigma Aldrich244155Ontvlambaar, toxisch  
NaOH (gecertificeerd ACS)EMD1.06498.1000Corrosief
Alkacid pH test lintenFisherA979
Fosforzuur (gecertificeerd ACS)FisherA242
Polaris Q massaspectrometer Thermo Electron Corporation
Pyridien (99%)Alfa AesarA12005Ontvlambaar, toxisch bij contact met de huid
SwitchgrassCherry Research Farm Goldsboro, NCN/AGeoogst augustus 2011
Thermo Finnigan trace gas chromatograafThermo Electron Corporation
Whatman nr. 1 filterpapierWhatman1001-150

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tejado, A., Pena, C., Labidi, J., Echeverria, J. M., Mondragon, I. Physico-chemical characterization of lignin from different sources for use in phenol-formaldehyde resin synthesis. Bioresource Technol. 98, 1655-1663 (2007).
  2. Brannvall, E. Overview of pulp and paper processes. Pulp and paper chemistry and technology. Elk, M., Gellerstedt, G., Henriksson, G. 2, De Gruyter. 1-12 (2009).
  3. Biermann, C. J. Pulping fundamentals. Handbook of pulping and papermaking. , 2nd edition, Academic Press INC. 55-100 (1996).
  4. Sjöström, E. Wood chemistry: fundamentals and applications. , 2nd, San Deigo Academic Press. (1924).
  5. Philbrook, A., Alissandratos, A., Easton, C. J. Biochemical processes for generating fuels and commodity chemicals from lignocellulosic biomass. Environ. Biotechnol. , 39-63 (2013).
  6. Sanchez, R., Ferrer, A., Serrano, L., Toledano, A., Labidi, J., Rodriguez, A. Hesperaloafunifera as a raw material for integral utilization of its components. BioResources. 6 (1), 3-21 (2011).
  7. Font, X., Caminal, G., Gabarrel, X., Romero, S., Vicent, M. T. Black liquor detoxification by laccase of Trametesversicolorpellets. J. Chemical Tech. Biotech. 78, 548-554 (2003).
  8. Zimmerman, W. Degradation of lignin by bacteria. J. Biotechnol. 13, 119-130 (1990).
  9. Ahamad, M., Taylor, C. R., Pink, D., Burton, K., Eastwood, D., Bending, G. R., Bugg, T. D. H. Development of novel assay for lignin degradation: comparative analysis of bacterial and fungal lignin degraders. Mol. Biosystems. 6, 815-821 (2010).
  10. Ramchandra, M., Crawford, D. L., Hertel, G. Characterization of an extracellular lignin peroxidase of the lignocellulolyticactinomycete Streptomyces viridosporus. Appl. Environ. Micro. 54, 3057-3063 (1988).
  11. Mishra, M., Thakur, I. S. Microorganisms in environmental management: microbes and the environment. Satyanarayana, T., Johri, B. N., Prakash, A. , Springer. (2012).
  12. Karaaslan, A. M., Tshabalala, M. A., Wood Bushcle-Diller, G. hemicellulose chitosan-based semi-interpenetrating network hydrogels: mechanical, swelling and controlled drug release properties. BioResources. 5 (2), 1036-1054 (2010).
  13. Lech, K., Brent, R. Short protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Kevin, S. , 2nd, John Wiley & Sons. (1992).
  14. Raj, A., Krishna Reddy, M. M., Chandra, R. Identification of low molecular weight aromatic compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) from kraft lignin degradation by three Bacillus sp. Int. Biodeterior. Biodegradation. 59, 292-296 (2007).
  15. Chandra, R., Raj, A., Purohit, H. J., Kapley, A. Biodegradation of kraft lignin by three pure and mixed aerobic bacterial cultures isolated from pulp and paper sludge. Proceeding of the 25th international symposium on toxicology environmental and occupational health, , (2005).
  16. Chen, Y., Chai, L., Tang, C., Yang, Z., Zheng, Y., Shi, Y., Zhang, H. Kraft lignin biodegradation by Novosphingobium sp. B-7 and analysis of the degradation process. Bioresource Technol. 123, 682-685 (2012).
  17. Bandounas, L., Wierckx, N. J., de Winde, J. H., Ruijssenaars, H. J. Isolation and characterization of novel bacterial strains exhibiting ligninolytic potential. BMC Biotechnol. 11 (94), (2011).
  18. Chandra, R., Abhishek, A., Sankhwar, M. Bacterial decolorization and detoxification of black liquor from rayon grade pulp manufacturing industry and detection of their metabolic products. Bioresource Technol. 102, 6429-6436 (2011).
  19. Gellerdtedt, G. Chemistry of Bleaching of Chemical Pulp. Pulp and Paper Chemistry and Technology. Ek, M., Gellerstedt, G., Henriksson, G. 2, De Gruyter. 201-237 (2009).
  20. Kringstad, K. P., Lindstrom, K. Spent liquors from pulp bleaching. Environ. Sci. Tech. 18, 236-247 (1984).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zwarte loogextractie van lignocellulosegaschromatografie massaspectrometriebenutting van koolstofbronnenanalyse van fermentatieproductenanaerobe cultivatieminimale mediumagarvriesdroogprotocol

Gerelateerde artikelen