Nucleosidetrifosfaten - Van Synthese tot biochemische karakterisering

Samenvatting

De hierin beschreven protocol heeft tot doel uit te leggen en verkorten de vele obstakels in de weg van de ingewikkelde route die leidt tot gewijzigde nucleosidetrifosfaten. Bijgevolg Dit protocol maakt zowel de synthese van deze geactiveerde bouwstenen en hun beschikbaarheid voor praktische toepassingen.

Samenvatting

De traditionele strategie voor de introductie van chemische functionaliteiten is het gebruik van vaste-fase synthese door het toevoegen van geschikte gemodificeerde fosforamidiet precursors naar het ontluikende keten. Echter, de gebruikte tijdens de synthese en de beperking tot vrij korte sequenties omstandigheden belemmeren de toepasbaarheid van deze methodiek. Anderzijds worden gemodificeerd nucleoside trifosfaten geactiveerd bouwstenen die zijn gebruikt voor de licht invoering van talrijke functionele groepen in nucleïnezuren, een strategie die de weg vrijmaakt voor het gebruik van gemodificeerde nucleïnezuren in een breed palet van praktische toepassingen zoals functionele tagging en genereren van ribozymen en DNAzymen. Een van de grote uitdagingen bevindt in de complexiteit van de methode leidt tot de isolatie en karakterisering van deze nucleoside analogen.

In deze video artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor de synthese van These gemodificeerde analogen met fosfor (III)-gebaseerde reagentia. Bovendien is de procedure voor de biochemische karakterisatie openbaar gemaakt, met bijzondere aandacht voor primerverlengingsreacties en TdT tailing polymerisatie. Deze gedetailleerde protocol zal van nut zijn voor het vervaardigen van gemodificeerde dNTPs en het gebruik daarvan in de chemische biologie.

Inleiding

5'-nucleoside trifosfaten ((d) NTP's) vormen een klasse van belangrijke biomoleculen die betrokken zijn bij talloze processen en functies vinden dat de universele valuta van energie regelaars van celmetabolisme. Naast hun rol in deze fundamentele biologische veranderingen, hun gemodificeerde tegenhangers geavanceerd als veelzijdig en milde platform voor de introductie van functionele groepen in oligonucleotiden, een methodologie die goed vult de geautomatiseerde vaste-fase synthese die meestal wordt toegepast ^1,2. Inderdaad, mits de (d) NTP's kunnen als substraten voor RNA en DNA polymerasen ^3, een schat aan functionele groepen....

Protocol

1. Synthese van de Modified nucleosidetrifosfaten

De synthetische aanpak gekozen volgt de procedure ontwikkeld door Ludwig en Eckstein, aangezien deze methode over het algemeen betrouwbaar en leidt tot zeer weinig bijwerkingen-producten (Figuur 1A) ^39.

1. Coevaporate de geschikte 3'-OAc-beschermde nucleoside (typisch 0,1 mmol) tweemaal met watervrij pyridine (2 ml) en vervolgens drogen onder vacuüm gedurende de nacht. Tegelijkertijd, droge tributylammonium pyrofosfaat (0,13 mmol) onder vacuüm gedurende de nacht.
2. Los het nucleoside in een minimale droge pyridine (0,2 ml) en voeg droge dioxa....

Resultaten

Gemodificeerde nucleosidetrifosfaten zijn verleidelijke synthetische doelen, omdat zij zorgen voor de gemakkelijke invoering van een breed scala van functionele groepen in nucleïnezuren ^41. Echter, de isolatie en karakterisering van deze geactiveerde bouwstenen vaak lastig blijkt te zijn. Bijgevolg is de hierin getoonde resultaten worden verondersteld om een helpende hand te bieden aan de verschillende stappen binnen de genoemde synthetische en biochemische procedures (Figuur 1B) te volgen. <.......

Discussie

De opname van veranderingen in nucleïnezuren van belang voor tal van praktische toepassingen waaronder de ontwikkeling van antisense en antigeen middelen ^42,43, etikettering en functionele tagging oligonucleotiden ^41, en ​​pogingen om de genetische alfabet ^44-46 breiden. Chemische veranderingen en functionele groepen zijn meestal ingebracht in nucleïnezuren door toepassing van standaard en geautomatiseerde vaste-fase synthese protocollen. Echter, de fosforamidiet bouwblokken bestand tege.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tributylammonium pyrofosfaat	Sigma Aldrich	P8533	Hygroscopisch vast, bewaar onder Ar
2-Chloor-1,3,2-benzodioxafosforin-4-on	Sigma Aldrich	324124	Gevoelig voor vocht
Pyridine	Sigma Aldrich	82704	Onder moleculaire zeven
Dioxaan	Sigma Aldrich	296309	Onder moleculaire zeven
Dimethylformamide (DMF)	Sigma Aldrich	40248	Onder moleculaire zeven
Acetonitril	Fisher Scientific		HPLC-kwaliteit
Triethylamine	Sigma Aldrich	90342
Tributylamine	Sigma Aldrich	90781
ddH2O	Milli-Q		de-ioniseerde en gezuiverde water, geautoclaveerd in aanwezigheid van Diethylpyrocarbonaat (DEPC)
Diethylpyrocarbonaat (DEPC)	Sigma Aldrich	159220
D2O	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-25
γ-[32P]-ATP	Hartmann Analytics	FP-301
Natuurlijke dNTP's	Promega	U1420
Vent (exo-) DNA polymerase	NEB	M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment	NEB	MO210S
9°Nm DNA polymerase	NEB	MO260S
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)	Promega	M828A
Pwo DNA polymerase	Peqlab	01 01 5010
T4 PNK	Thermo Scientific	EK0032
Acrylamid/bisacrylamide (19:1, 40%)	Serva	10679.01
Agarose	Apollo Scientific	BIA1177
G10 Sephadex	Sigma	G10120
Urea	Apollo Scientific	BIU4110
Jupiter semipreparatieve RP-HPLC kolom (5μ C18 300 Å)	Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler	Bioconcept	BYQ6042E
PCR-buisjes	Bioconcept	3220-00
HPLC-systeem	Amersham Pharmacia Biotech		Äkta basic 10/100
Alle oligonucleotiden zijn aangeschaft van Microsynth en gezuiverd door PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
Meer informatie over experimentele procedures en apparatuur is te vinden in de volgende artikelen: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F