Methodenartikel

Nucleosidetrifosfaten - Van Synthese tot biochemische karakterisering

DOI:

10.3791/51385

⸱

3 april 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hierin beschreven protocol heeft tot doel uit te leggen en verkorten de vele obstakels in de weg van de ingewikkelde route die leidt tot gewijzigde nucleosidetrifosfaten. Bijgevolg Dit protocol maakt zowel de synthese van deze geactiveerde bouwstenen en hun beschikbaarheid voor praktische toepassingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De traditionele strategie voor de introductie van chemische functionaliteiten is het gebruik van vaste-fase synthese door het toevoegen van geschikte gemodificeerde fosforamidiet precursors naar het ontluikende keten. Echter, de gebruikte tijdens de synthese en de beperking tot vrij korte sequenties omstandigheden belemmeren de toepasbaarheid van deze methodiek. Anderzijds worden gemodificeerd nucleoside trifosfaten geactiveerd bouwstenen die zijn gebruikt voor de licht invoering van talrijke functionele groepen in nucleïnezuren, een strategie die de weg vrijmaakt voor het gebruik van gemodificeerde nucleïnezuren in een breed palet van praktische toepassingen zoals functionele tagging en genereren van ribozymen en DNAzymen. Een van de grote uitdagingen bevindt in de complexiteit van de methode leidt tot de isolatie en karakterisering van deze nucleoside analogen.

In deze video artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor de synthese van These gemodificeerde analogen met fosfor (III)-gebaseerde reagentia. Bovendien is de procedure voor de biochemische karakterisatie openbaar gemaakt, met bijzondere aandacht voor primerverlengingsreacties en TdT tailing polymerisatie. Deze gedetailleerde protocol zal van nut zijn voor het vervaardigen van gemodificeerde dNTPs en het gebruik daarvan in de chemische biologie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5'-nucleoside trifosfaten ((d) NTP's) vormen een klasse van belangrijke biomoleculen die betrokken zijn bij talloze processen en functies vinden dat de universele valuta van energie regelaars van celmetabolisme. Naast hun rol in deze fundamentele biologische veranderingen, hun gemodificeerde tegenhangers geavanceerd als veelzijdig en milde platform voor de introductie van functionele groepen in oligonucleotiden, een methodologie die goed vult de geautomatiseerde vaste-fase synthese die meestal wordt toegepast 1,2. Inderdaad, mits de (d) NTP's kunnen als substraten voor RNA en DNA polymerasen 3, een schat aan functionele groepen zoals aminozuren 4-13, boorzuren 14,15 nornbornene 16, diamondoid-achtige residuen 17, zijketens voor Organokatalyse 18, galzuren 19 en zelfs 20 oligonucleotiden kunnen worden geïntroduceerd in oligonucleotiden.

_content "> Voorbij die een geschikte vector voor de functionalisering van nucleïnezuren kunnen gemodificeerd dNTP worden betrokken bij SELEX en andere verwante combinatorische werkwijzen voor in vitro selectie voor het genereren van gemodificeerde katalytische nucleïnezuren 21-30 en aptameren voor verschillende praktische toepassingen 10, 31-36. De extra zij ketens die worden geïntroduceerd door de polymerisatie van de gemodificeerde dNTP's worden beschouwd als de chemische ruimte die kunnen worden onderzocht in een selectie-experiment en vult de vrij slechte functionele arsenaal van nucleïnezuren 37 verhogen. Ondanks deze aantrekkelijke eigenschappen en de recente vooruitgang in de ontwikkeling van zowel synthetische en analytische methoden, geen universeel toepasbaar en hoogrentende procedure bestaat voor het vervaardigen van gemodificeerde nucleosidetrifosfaten 2,38.

Het doel van deze huidige protocol is licht te werpen op de (soms) ingewikkelde procedures die to de synthese en biochemische karakterisatie van deze geactiveerde bouwstenen (Figuur 1B). Speciale aandacht zal worden gegeven op alle synthetische details die vaak moeilijk te vinden zijn of afwezig zijn in de experimentele afdelingen maar nog cruciaal voor de succesvolle afronding van de synthetische weg die leidt tot de isolatie van zuiver (d) NTP's (figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synthese van de Modified nucleosidetrifosfaten

De synthetische aanpak gekozen volgt de procedure ontwikkeld door Ludwig en Eckstein, aangezien deze methode over het algemeen betrouwbaar en leidt tot zeer weinig bijwerkingen-producten (Figuur 1A) 39.

  1. Coevaporate de geschikte 3'-OAc-beschermde nucleoside (typisch 0,1 mmol) tweemaal met watervrij pyridine (2 ml) en vervolgens drogen onder vacuüm gedurende de nacht. Tegelijkertijd, droge tributylammonium pyrofosfaat (0,13 mmol) onder vacuüm gedurende de nacht.
  2. Los het nucleoside in een minimale droge pyridine (0,2 ml) en voeg droge dioxaan (0,4 ml) als hulpoplosmiddel. Voeg als 2-chloor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (0,11 mmol) en laten reageren bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
    Opmerking: Het is opmerkelijk dat bijzondere aandacht moet worden genomen met de 2-chloor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-een reagens. Sterker nog, zelfs de opslag van dit reagens onder een inert gas atmosphier niet voldoende is om de ontleding te voorkomen. Aldus, de witte vaste stof die wordt gevormd in deze ontwikkeling kan en moet worden afgeschraapt voor gebruik.
  3. Bereid een oplossing van tributylammonium pyrofosfaat in droge DMF (0,17 ml) en vers gedestilleerd tributylamine (58 pl; nooit toe moleculaire zeven). Voeg de resulterende oplossing aan het reactiemengsel (een wit neerslag verschijnt maar snel verdwijnt) en laten reageren bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
  4. Bereid een oplossing van jood (0,16 mmol) in pyridine (0,98 ml) en H2O (20 pl) en voeg toe aan het reactiemengsel teneinde oxideren Pα (III) centrum. Laat de verkregen donkerrode oplossing geroerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  5. Gebruik een 10% oplossing van NaS 2 O 3 om de overmaat I 2 blussen. Verwijder het oplosmiddel onder vacuüm (de temperatuur van het waterbad van de roterende verdamper wordt onder 30 ° C gehouden). H 2 O (5 ml) toe te voegen en laat de mixture bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten staan ​​om de cyclische trifosfaat groep hydrolyseren.
  6. In dit stadium worden de beschermende groepen meestal verwijderd (de 3'-OAc en groepen op de zijketens van de nucleobase). Bijgevolg voeg NH4OH (30% in H2O, 10 ml) om het ruwe en roer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd, en verwijder het oplosmiddel onder vacuüm.
  7. Voeg 2 ml H 2 O en opgesplitst in 2 buizen. Voeg 12 ml van een 2% oplossing van NaClO 4 in aceton en gecentrifugeerd (1000 x g) gedurende 30 minuten. Deze procedure herhaalt zich nog een keer. Dit neerslag kan voor de scheiding van de oplosmiddelen en reagentia die bij de synthese van de trifosfaat (die precipiteren), waardoor vereenvoudiging van de daaropvolgende RP-HPLC zuivering aanzienlijk.
  8. Na droging aan de lucht van de olieachtige residu, het opnemen van een 31P-NMR-spectrum van het ruwe (volgens standaardprocedures, zie ook Lijst van Materialen en figuur 3) enoplossen in 4 ml H2O
    Opmerking: Deze synthetische procedure richt zich voornamelijk op de productie van gemodificeerde desoxynucleosidetrifosfaten, maar een zeer gelijkaardige procedure kan worden toegepast voor hun RNA tegenhangers (door simpelweg met 2 ', 3'-bis-O-geacetyleerd voorlopers).

2. HPLC Zuivering van de Modified nucleosidetrifosfaten

  1. Bereiding van een 1 M voorraadoplossing van triethylammoniumbicarbonaat (TEAB): 40
    1. Bereid een oplossing van 1 mol triethylamine (139 ml) bij ≈ 600 ml gedestilleerd en gefiltreerd H2O
    2. Bubble CO 2 (via droogijs en een gas bubbler) in de oplossing onder krachtig roeren tot een pH van 7,6 is bereikt (dit ten minste 10 uur duren). Deze voorraadoplossing kan in de koelkast worden bewaard tot een maand.
  2. Zuivering:
    1. Bereid twee bufferoplossingen van de 1 M voorraad: 2 L van 50 mM TEAB in ultrapuur water (eluens A) eennd 1 liter 50 mM TEAB in 50% MeCN (eluens B). Ontgas beide eluaten onder vacuüm en roeren gedurende 20 min (aandacht vereist teneinde de pH niet te wijzigen door CO2 te verwijderen tijdens ontgassing).
    2. Bereid een analytisch monster door het oplossen van 10 ul van de ruwe trifosfaat in 300 pl gedestilleerd H2O en injecteren in een HPLC systeem uitgerust met een semi-preparatieve RP-kolom (C18) en met een gradiënt variërend van 0-100% B in 40 min (Figuur 4). Stel de HPLC programma overeenkomstig de Rt van de trifosfaat (die meestal de hoofdpiek op het chromatogram) en difosfaat (die een iets lagere Rt is). Zuiver het ruwe mengsel met behulp van deze voorwaarden en door het verwijderen van de vroege fracties dat sommige difosfaat kunnen bevatten.
    3. Combineer alle fracties die het product bevatten en vriesdrogen (die de voorkeur verdamping op de roterende verdamper om hydrolyse te minimaliseren ongewenste diphosphaten). Coevaporate meerdere malen met ultrapuur water (om overblijfsel triethylamine verwijderen uit de eluenten). Beoordeel de zuiverheid van het trifosfaat door NMR (zowel 1H en 31P NMR) en MALDI-TOF door toepassing van standaard protocollen (zie figuur 5). Typische opbrengsten verkregen door toepassing van dit protocol kenmerkend liggen in het traject van 30-70%, afhankelijk van de ondergrond.

3. Primerverlengingsreacties en TdT Polymerisatie

  1. 5'-uiteinde van de primer labeling
    1. Meng 30 pmol van de juiste primer (bijv. P1, lijst van materialen) met 4 pi 10x polynucleotidekinase (PNK) buffer, 3 pl γ-[32P]-ATP, 1 ui PNK en DDH 2 O (voor een totaal reactievolume van 40 pi). Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 30 min en vervolgens warmte deactiveren kinase (10 min bij 70 ° C).
    2. Tijdens de labelingsreactie voorbereidingeen column G10 Sephadex door de stekker een 1 ml pipet tip met gesilaneerde glaswol en het vullen van de tip met G10-oplossing (10% in DDH 2 O, geautoclaveerd). Spin down en was driemaal met 500 ul DDH 2 O en een laatste wasbeurt met 50 ul DDH 2 O. Voer het reactiemengsel door de G10 (de vrije radioactieve label te verwijderen).
    3. Gel zuiveren (PAGE 20%) het radioactief gemerkte primer en herstellen door toepassing van de crush en geniet werkwijze (bijvoorbeeld elutie met 500 ul van een waterige oplossing die 1% LiClO 4 en 1 mM NEt3 (pH 8) bij 72 ° C gedurende 15 min). Ethanol neerslag en G10 ontzouten de geëlueerd oligonucleotide.
  2. Primerverlengingsreactie
    1. Anneal 1 pmol van radioactief gelabelde primer P1, 10 pmol primer P1, en ​​10 pmol template T1 (Lijst van Materialen) in 10x reactie buffer (geleverd door de leverancier van de polymerase te gebruiken) door het plaatsen van de tube in heet (90-95 ° C) water en doordat geleidelijk afkoelen tot kamertemperatuur (meer dan 45 min).
    2. Zet de tube op ijs en voeg (op zijn beurt) de dNTP cocktail (die zowel de gewijzigde en de natuurlijke trifosfaten, 100 uM uiteindelijke concentratie) en 1 U van het DNA-polymerase (Vent (exo -), Klenow, Pwo of 9 ° N m) en compleet met water (voor een totaal reactievolume van 20 pi). Incubeer bij de optimale werktemperatuur van het enzym (bv. 60 ° C gedurende 30 min bij Vent (exo -) wordt gebruikt).
    3. Voeg 20 gl stopoplossing (formamide (70%), ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA, 50 mM), broomfenol blauw (0,1%), xyleencyanol (0,1%)), verhit de monsters (95 ° C, 5 min), koel omlaag (0 ° C) en lossen denaturerende polyacrylamidegelelektroforese. Visualiseren door fosforimager.
  3. TdT polymerisatie
    1. Verdunnen 7 pmol van enkelstrengs, Ongelabelde primer P2 (Lijst van Materialen), 1 pmol van radioactief gelabelde primer in 1 pl TdT buffer 10x.
    2. Zet de tube op ijs en voeg (op zijn beurt) de dNTP cocktail (op een voldoende concentratie tussen 10 en 200 uM) en de TdT polymerase (4 U). Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Voeg 10 ul van de stopoplossing, verwarm de monsters (95 ° C, 5 min), afgekoeld (0 ° C) en lossen door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE 15%). Visualiseren door fosforimager.

4. PCR met Gewijzigde nucleosidetrifosfaten

  1. Mix 8 pmol van zowel de voorwaartse en achterwaartse primers met 0,5 pmol van de template te amplificeren. Voeg 10x reaction buffer en de dNTP cocktail (voor een 200 uM uiteindelijke concentratie) en plaats de buis op ijs. Voeg 1 U van het DNA polymerase en compleet met H2O tot een eindvolume van 20 pl te bereiken. Breng het mengsel in een PCR flesje en uitvoeren 30 PCR cycli.
  2. Verdun 6 pl met 6 pi 2x sucrose laadbuffer en lossen 2% agarose (gekleurd met ethidiumbromide) elektroforese. Visualiseren door fosforimager.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gemodificeerde nucleosidetrifosfaten zijn verleidelijke synthetische doelen, omdat zij zorgen voor de gemakkelijke invoering van een breed scala van functionele groepen in nucleïnezuren 41. Echter, de isolatie en karakterisering van deze geactiveerde bouwstenen vaak lastig blijkt te zijn. Bijgevolg is de hierin getoonde resultaten worden verondersteld om een helpende hand te bieden aan de verschillende stappen binnen de genoemde synthetische en biochemische procedures (Figuur 1B) te volgen. <...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De opname van veranderingen in nucleïnezuren van belang voor tal van praktische toepassingen waaronder de ontwikkeling van antisense en antigeen middelen 42,43, etikettering en functionele tagging oligonucleotiden 41, en ​​pogingen om de genetische alfabet 44-46 breiden. Chemische veranderingen en functionele groepen zijn meestal ingebracht in nucleïnezuren door toepassing van standaard en geautomatiseerde vaste-fase synthese protocollen. Echter, de fosforamidiet bouwblokken bestand tege...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (Subsidies n ° PZ00P2_126430 / 1 en PZ00P2_144595). Prof C. Leumann wordt hartelijk bedankt voor het verstrekken van het lab ruimte en apparatuur, evenals voor zijn voortdurende steun. Ms Sue Knecht is erkend voor vruchtbare discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tributylammonium pyrofosfaat Sigma AldrichP8533Hygroscopisch vast, bewaar onder Ar
2-Chloor-1,3,2-benzodioxafosforin-4-on Sigma Aldrich324124Gevoelig voor vocht
PyridineSigma Aldrich82704Onder moleculaire zeven
DioxaanSigma Aldrich296309Onder moleculaire zeven
Dimethylformamide (DMF)Sigma Aldrich40248Onder moleculaire zeven
Acetonitril Fisher ScientificHPLC-kwaliteit
TriethylamineSigma Aldrich90342
TributylamineSigma Aldrich90781
ddH2OMilli-Qde-ioniseerde en gezuiverde water, geautoclaveerd in aanwezigheid van Diethylpyrocarbonaat (DEPC)
Diethylpyrocarbonaat (DEPC)Sigma Aldrich159220
D2OCambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-25
γ-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natuurlijke dNTP'sPromegaU1420
Vent (exo-) DNA polymeraseNEBM0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBMO210S
9°Nm DNA polymeraseNEBMO260S
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)PromegaM828A
Pwo DNA polymerasePeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
Acrylamid/bisacrylamide (19:1, 40%)Serva10679.01
AgaroseApollo ScientificBIA1177
G10 SephadexSigmaG10120
UreaApollo ScientificBIU4110
Jupiter semipreparatieve RP-HPLC kolom (5μ C18 300 Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
PCR-buisjesBioconcept3220-00
HPLC-systeemAmersham Pharmacia BiotechÄkta basic 10/100
Alle oligonucleotiden zijn aangeschaft van Microsynth en gezuiverd door PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
Meer informatie over experimentele procedures en apparatuur is te vinden in de volgende artikelen:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gemodificeerde nucleotidenfosforreagentiareverse phase HPLCprimerextensiereactiesTdT polymerisatieNMR karakteriseringMALDI analysegelelektroforesechemische biologie

Gerelateerde artikelen