Methodenartikel

Een In vivo Crosslinking Aanpak eiwitcomplexen te isoleren van Drosophila Embryo's

16.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51387

⸱

23 april 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

In dit artikel

Samenvatting

Multi-component eiwitcomplexen spelen een cruciale rol tijdens de cellulaire functie en ontwikkeling. Hier beschrijven we een methode die wordt gebruikt voor de inheemse eiwitcomplexen isoleren van Drosophila embryo's na in vivo verknoping gevolgd door zuivering van het verknoopte complexen voor de volgende structuur-functie analyse.

Samenvatting

Vele cellulaire processen gestuurd door multisubunit eiwitcomplexen. Veel van deze complexen tijdelijk en vereisen natuurlijke omgeving te monteren. Daarom, om deze functionele eiwitcomplexen identificeren, is het belangrijk om stabilisatie in vivo voor cellysis en daaropvolgende zuivering. Hier beschrijven we een methode om grote bonafide eiwitcomplexen van Drosophila embryo's te isoleren. Deze methode is gebaseerd op embryo permeabilisatie en stabilisatie van de complexen in de embryo's door in vivo verknoping met een lage concentratie van formaldehyde, die gemakkelijk de celmembraan kan oversteken. Vervolgens wordt het eiwitcomplex plaats immuungezuiverd gevolgd door gel zuivering en geanalyseerd door massaspectrometrie. We illustreren deze methode gebruik zuivering van een Tudor eiwitcomplex, dat essentieel is voor kiemlijn ontwikkeling. Tudor is een groot eiwit, die meerdere Tudor domeinen bevat - kleinmodules die samenwerken met gemethyleerd arginines of lysinen van target eiwitten. Deze methode kan worden aangepast voor isolatie van natieve eiwitcomplexen van verschillende organismen en weefsels.

Inleiding

Isolatie van multisubunit verzamelingen van eiwitten en DNA-of RNA-eiwitcomplexen wordt uitgevoerd om eiwitcomplexen, genomische loci die door DNA-bindende regulatorische eiwitten of RNA doelwitten RNA-bindende eiwitten te identificeren. Verschillende methoden is het mogelijk genoom-brede identificatie van DNA-sites herkend door transcriptiefactoren of chromatine-eiwitten (ChIP-seq) 1 en RNA targets gekoppeld aan een bepaalde RNA-bindend eiwit (CLIP-volgende) 2. De bibliotheken van RNA afkomstig cDNA of DNA doelen worden vervolgens diep sequentie. Deze methoden gebruiken chemische of UV geïnduceerde verknoping de complexen gevolgd door immunoprecipitatie (IP) stabiliseren met een antilichaam tegen een eiwit component van het onderzochte complex.

Tijdens de ontwikkeling van een organisme, veel eiwitcomplexen vormen transiënt. Daarom is het cruciaal om de samenstelling en functie van deze complexen in vivo analyse om de moleculaire mechanismen die dev beheersen begrijpeneling. Een dergelijke in vivo analyse superieur in vitro benadering is want het is vrijwel onmogelijk om natieve concentraties van de interagerende componenten en cellulaire biochemische omgeving vitro reproduceren. Hier laten we een in vivo benadering die we met succes gebruikt om grote eiwitcomplexen isoleren van Drosophila embryo's. In deze werkwijze worden eiwitcomplexen in levende embryo verknoopt met een lage concentratie van formaldehyde en vervolgens eiwitcomplexen plaats worden geïsoleerd door IP met een antilichaam tegen een bekende component van de complexen gevolgd door gel zuivering van de complexen en massaspectrometrie analyse identificeren onbekende complexe componenten. Aangezien formaldehyde kan de celmembraan doordringen en heeft een verknopende bereik van 2,3-2,7 A 3 kunnen eiwit complexen worden verknoopt in vivo en complexe componenten waarschijnlijk dicht bij elkaar bevinden. In dit artikel gaan webeschrijven deze werkwijze met de isolatie van Tudor (Tud) eiwitcomplex als voorbeeld. Tud een kiemlijn eiwit dat essentieel is voor kiembaan ontwikkeling 4-7. Dit eiwit bevat 11 Tud domeinen bekend om te interageren met brandspiritus arginines of lysinen van andere polypeptiden 8-10.

Eerder hebben we een transgene Drosophila lijn die uitdrukt HA-tag functionele Tud 5 en daarom wordt specifieke anti-HA-antistoffen gebruikt om pull-down Tud complex na verknoping gegenereerd.

Naast de eiwit-eiwit verknopingen kunnen formaldehyde nucleïnezuur-eiwit crosslinks genereren en wordt gebruikt ChIP-seq experimenten. Verder in Drosophila, in vivo verknoping met formaldehyde kon de identificatie van een RNA-doel van Vasa RNA helicase-eiwit 11.

Terwijl in dit artikel beschrijven we een methode voor in vivo verknoping en purcatie van eiwitcomplexen van Drosophila embryo, kan deze methode worden aangepast voor andere organismen en weefsels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Het bereiden van grote Appelsap-agar platen

  1. Om 4 borden, voeg 375 ml H 2 O, 11,25 g fly agar en een roerstaaf een 1000 ml fles. Dit is Mix A. Autoclaaf Mix A met de kolf deksel losjes afgedekt op een 30 min-sterilisatie cyclus voor vloeibare producten.
  2. Voeg 125 ml appelsap, 12,5 g tafelsuiker en een roerstaafje in een bekerglas van 500 ml. Dit is Mix B. Heat Mix B op een verwarmde platform roeren en de temperatuur te handhaven op ongeveer 70 ° C tot de autoclaaf van Mix A is voltooid.
  3. Na de voltooiing van Mix A autoclaaf, transfer Mix B naar Mix A. Blijf roeren het gecombineerde mengsel zachtjes en laat het afkoelen gedurende 15 minuten. Vermijd over-koeling en het resulteerde agar stollen vóór de toevoeging van conserveermiddel.
  4. Voeg 10% (gewicht / volume) methyl 4-hydroxybenzoaat opgelost in ethanol. Deze zal fungeren als conserveermiddel. Voeg 3,75 ml van de oplossing voor de hierboven appelsap agar-mengsel. Blijf roeren another 5 min.
  5. Giet 125 ml appelsap-agar mengsel met conserveringsmiddel in elk 300 cm 2 plastic of piepschuim plaat. Laat het afkoelen tot kamertemperatuur en stollen. Vermijd de vorming van luchtbellen tijdens het gieten.
    Opmerking: Het appelsap-agar platen zijn klaar om direct te gebruiken. Bedek ongebruikte platen met heldere wraps en bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal een week.

2. Drosophila Embryo Collection en Pre-verknopingsbehandeling

  1. Laad een bevolking kooi met ongeveer 40.000 tot 50.000 vliegen van waaruit embryo's worden verzameld.
  2. Maak twee platen die elk 125 ml standaard maïsmeel-melasse medium 12 en strooi ongeveer 4 g gist gedroogde bakkersgist op elk bord. Plaats deze platen in de kooi bevolking in een 25 ° C incubator gedurende 48 uur om de vliegen vet te mesten.
  3. 2 warme appelsap-agar platen tot 25 ° C. Strooi ongeveer 1 g gist gedroogde bakkersgist op elkeplaat. Plaats de 2 platen in de kooi bevolking te beginnen met het verzamelen 0-1 hr-oude embryo's.
  4. Haal de platen aan het einde van de 1 hr collectie. Vervangen door 2 nieuwe platen als een nieuwe ronde van de collectie nodig.
  5. Voeg genoeg water om de platen te bedekken en resuspendeer de embryo's voorzichtig met een fijn penseel. Giet de geresuspendeerd embryo's door middel van een twee lagen zeef gemaakt van roestvrij staal gaas.
    Opmerking: De bovenste laag is gemaakt van middelgrote poriegrootte (850 micrometer) gaas waarin grote fly-onderdelen verzamelt terwijl het laten door embryo's. De onderste laag is gemaakt van fijn gaas (75 micrometer), die embryo's verzamelt terwijl het laten van door gist en water.
  6. Gebruik de fijne kwast om de verzamelde embryo's te zetten in een verzameling mand gemaakt met een 50 ml buis en fijne nylon mesh. Spoel de embryo kort met water en vervolgens dep de maas op keukenpapier te drogen.
  7. Dompel de embryo's in 50% bleekwater met zachte wervelende gedurende 3 minuten. Spoel grondigly met water om alle resterende bleekmiddel te verwijderen. Dep het gaas op keukenpapier te drogen.
  8. Dompel de dechorionated embryo in isopropanol onder zacht schudden gedurende 15 seconden of totdat de afbraak van multi-embryo klonten (dit moet langer dan 30 seconden niet nemen). Dep het gaas op keukenpapier drogen.
  9. Dompel de embryo's in heptaan voor 5 min tijdens het gebruik van een pipet om heptaan streamen over de embryo's om ze geresuspendeerde houden. Dep het gaas op keukenpapier te drogen.
  10. Spoel de embryo's met stromen van fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (PBS) die 0,1% Triton X-100 (PBST) gedurende 3 minuten.
  11. Demonteer de opvangbak en de overdracht van de embryo's, samen met de mesh om een ​​15 ml buis met 10 ml PBST. Keren de buis voorzichtig om de embryo's wassen de mesh.
  12. Verwijder het gaas van de buis. Zet de buis in een verticale positie en laat de embryo zinken naar de bodem van de buis door de zwaartekracht.
    Opmerking: Ongeveer 100-300ul van embryo's wordt verwacht voor een 1 uur collectie van de ene kooi.
  13. Verwijder de PBST en blijven presteren onmiddellijk verknopen.

3. In vivo verknoping van verzamelde embryo

  1. Bereid 0,2% formaldehyde in PBST onmiddellijk voor gebruik. Voeg 10 ml formaldehyde fixatief om de embryo's en incubeer bij 25 ° C onder zacht schudden op een rondschudapparaat gedurende 10 minuten. Gooi ongebruikte fixatief aan het eind van de dag.
  2. Doof de crosslinkingsreactie
    1. Aan het einde van de verknoping, laat de embryo zinken naar de bodem van de buis.
    2. Verwijder de formaldehyde oplossing. Voeg onmiddellijk 10 ml 0,25 M glycine in PBST de crosslinking reactie te blussen. Incubeer bij 25 ° C onder zacht schudden op een rondschudapparaat gedurende 5 minuten.
    3. Laat het embryo naar de bodem van de buis. Verwijder de demping oplossing. Was de embryo's met 10 ml PBST driemaal.
    4. Volledig verwijderen van de PBST was-oplossing met een pipet. WINKEL embryo bij -80 ° C tot gebruik.

4. Eiwitmonster Voorbereiding en Immunoprecipitatie

  1. Meng 500 ul verknoopte embryo met een Dounce homogenisator in 2 ml lysisbuffer (0,5 M ureum, 0,01% SDS, 2% Triton X-100, 2 mM fenylmethaansulfonylfluoride [PMSF] en protease inhibitor cocktail in PBS).
    Opmerking: Voer deze en de volgende stappen bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven.
  2. Breng de lysaat tot 1,5 ml centrifuge buizen en schud op een roterend platform voor 15 min om een ​​grondige afbraak zorgen. Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg gedurende 5 minuten om celresten neer te slaan. Sla de bovenstaande vloeistof in een schone 15 ml buis.
  3. Voeg 40 ul anti-HA agarose korrels suspensie de supernatant en incubeer op een roterend platform gedurende 2,5 uur.
  4. Pellet de kralen door centrifugering bij 2500 g gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof, maar laat passendebatterijvak ongeveer 250 pi in de buis. Resuspendeer de kralen in de resterende supernatant en overbrengen in een 1,5 ml spinkolom met 10 urn poriën filter.
  5. Centrifugeer de spin kolom bij 12.000 xg gedurende 10 seconden en de stroom gooi door.
  6. Was de kralen door het toevoegen 200 ul wasbuffer (0,1 M glycine, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20 in PBS). Centrifugeer de kolom bij 12.000 xg gedurende 10 sec en de was gooi. Herhaal de wasbeurt twee keer.
  7. Voeg 40 ul elutiebuffer (2 mg / ml HA-peptide in PBS) aan de kralen en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten onder zacht schudden om de 5 minuten. Centrifugeer de kolom bij 12.000 xg gedurende 10 seconden en vang het eluaat.
  8. Bevestig elutie van het complex door Western-blotanalyse met anti-HA antilichaam 13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De effectiviteit van de verknoping en de succesvolle zuivering van het verknoopte Tud eiwit complex werden geanalyseerd door SDS-PAGE op een 3% - 7% stap gel (in figuur 1), gevolgd door Western blot (figuur 2).

Het doel van het gebruik van de 3% - 7% stap gel is gebaseerd op de effectieve scheiding van verknoopte Tud eiwitcomplex van de resterende niet-verknoopte Tud eiwit en concentratie van het complex. Onder onze in vivo verknoping bovengenoemde ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Formaldehyde is vaak gebruikt als een verknopende reagens voor het identificeren van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur interacties. De goede oplosbaarheid en celmembraan permeabiliteit, alsmede de verenigbaarheid met stroomafwaartse massaspectrometrie procedures maken formaldehyde een ideale kandidaat middel voor verknoping intracellulaire toepassingen 3,15-17. In het bijzonder werd met succes gebruikt om mRNA's geassocieerd met Vasa, een kritische kiemcel RNA helicase in Drosophila 11...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler en Jimiao Zheng voor hun technische hulp bij deze studie. Dit werk werd ondersteund door NSF CARRIERE verlenen MCB-1054962 om ALA

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Drosophila agarLab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1Bewaar het water en agar mengsel niet te lang in de autoclaaf omdat dit ervoor zorgt dat de appelsap platen broos worden
Methyl 4-hydroxybenzoaatSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501Andere naam: TEGOSEPT
PopulatiekastFlystuff (http://www.flystuff.com/)59-104
Fijn nylon gaasFlystuff (http://www.flystuff.com/)57-102Snij het gaas iets groter dan de opening van de falcon tube kap bij het maken van de opvangbak om een strakke afdichting te garanderen
Dounce homogenisatorSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETKoel de homogenisator op ijs en spoel voor gebruik voor met koude lysis buffer om eiwitdegradatie te voorkomen
Protease remmer cocktail Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS kan worden gebruikt om een geconcentreerde protease remmer stock oplossing te bereiden
Anti-HA agarose kralenMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8De kit bevat ook HA-peptide en spin kolommen
HA-peptideMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Bereid tot 2 mg/ml met PBS 
Spin KolomMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Spin kolommen zijn opgenomen als onderdeel van de kit
IsopropanolFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP26324
Triton X-100Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP151-500
HeptaanFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625Verdun van 10X naar 1X met nanopure water voor gebruik
FormaldehydeFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
GlycineBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
UreaBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0730
FenylmethylsulfonylfluorideSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1GBereid een 200 mM stock oplossing in isopropanol en verdun vervolgens tot werkconcentratie van 2 mM in lysis buffer
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
15-ml buizenUSA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
BleekmiddelClorox merkVerdun met gelijk volume nanopure water om 50% bleekmiddel te maken
50-ml buizenBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
Bovenste laag zeefFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
Onderste laag zeefFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA

Referenties

  1. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
  2. Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
  3. Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
  4. Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
  5. Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
  6. Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
  7. Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
  8. Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
  9. Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
  10. Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
  11. Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
  12. Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  14. Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
  15. Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
  16. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
  17. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
  18. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694(2006).
  19. Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van prote necomplexencrosslinking met formaldehydeimmunoprecipitatieWestern blot analysemassaspectrometriepermeabilisatie van embryo sgelzuiveringTudor prote necomplex

Gerelateerde artikelen