Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Samenvatting

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Samenvatting

Naast een fysieke steiger om weefsel morfologie behouden, wordt de extracellulaire matrix (ECM) actief betrokken bij het regelen van cellen en weefsels functie tijdens de ontwikkeling en homeostase orgel. Zij doet dit door te handelen via biochemische, biomechanische en biofysische signaalwegen, zoals door het vrijkomen van bioactieve ECM eiwitfragmenten, reguleren weefsel spanning, en het verstrekken van wegen voor cel migratie. De extracellulaire matrix van de tumor micro ondergaat aanzienlijke verbouwing, gekenmerkt door de afbraak, afzetting en organisatie van fibrillair en niet-fibrillaire matrixeiwitten. Stromale verstijving van de tumor micro kan tumorgroei en invasie te bevorderen en remodelleren van bloed-en lymfevaten veroorzaken. Levende beeldvorming van matrixeiwitten, echter dit punt beperkt tot collagenen die kunnen worden gedetecteerd door frequentieverdubbeling met meerdere foton microscopie, waardoor het merendeel van matrixcomponenten largely onzichtbaar. Hier beschrijven we de procedures voor tumor inoculatie in de dunne dorsale oorhuid, immunokleuring van extracellulaire matrixeiwitten en intravitale beeldvorming van het blootgestelde weefsel in levende muizen met epifluorescentie en twee-foton microscopie. Onze intravitale weergavemethode maakt de directe detectie van fibrillaire en niet-fibrillaire matrix eiwitten in het kader van een groeiende dermale tumor. We tonen voorbeelden van vaartuig verbouwing veroorzaakt door lokale matrix contractie. We vonden ook dat fibrillaire matrix van de gedetecteerde tweede harmonische generatie tumor ruimtelijk los van opnieuw gedeponeerde matrixcomponenten zoals tenascine C. We toonden ook lange termijn (12 uur) beeldvorming van T-cel-interactie met tumorcellen en tumorcellen migratie langs de collageen IV van basaal membraan. Samengevat, deze methode uniek maakt de gelijktijdige detectie van tumorcellen, de fysische micro en endogene weefsel immuunrespons in tijd en kunnen provide belangrijke inzichten in de mechanismen die ten grondslag liggen aan progressie van de tumor en het uiteindelijke succes of weerstand tegen therapie.

Inleiding

Intravitale beeldvorming van inflammatoire, metastatische en matrix remodeling processen is een belangrijk gebied van onderzoek geweest en heeft de oprichting van een groot aantal transgene reporter muismodellen die fluorescerende eiwitten ^1,2 uiten gemotiveerd. Als gevolg van out-of-focus fluorescerende signalen, die de beeldkwaliteit verminderen en limieten lichtinval door het weefsel, imaging dik weefsel is alleen mogelijk met confocale of multi-foton scanning microscopie ^3. Een kortere, minder dure en complexe epifluorescentie microscopie is alleen mogelijk met bijna tweedimensionale weefsels zoals kippen chorio-allantoïs membraan ⁴ of muizenoor dermis ^5. De meeste beeldvormende systemen profiteren van transgene muizen die verschillende fluorescerende eiwitten in een celtype-specifieke manier. Hoewel deze eiwitten bieden zwak fototoxiciteit, ze immuunrespons ⁶ induceren. Bovendien is het moeilijk om tussen specifieke cel subtypes of markerenir basale of geactiveerde toestanden als zodanig verandering vereist de voorbereiding van een nieuwe genetische model. Bovendien, als fluorescerende eiwitexpressie algemeen beperkt tot intracellulaire compartiment, is het meestal niet mogelijk om het extracellulaire structuren zoals basaalmembraan eiwitten of weefsel chemokine afzettingen ^7. In plaats daarvan, indirect merken met antilichamen tegen extracellulaire antigenen biedt flexibiliteit voor vrijwel elk celtype of matrix specifieke component ^8,9. Echter, het belangrijkste nadeel van deze benadering labeling verbonden immunotoxiciteit gemedieerd door antigeen-antilichaam immuuncomplexen die complementsysteem-afhankelijke toxiciteit en fagocytose van cellen en extracellulaire structuren ¹⁰ cel kan leiden.

De extracellulaire matrix van de tumor micro-omgeving, maar ook normaal weefsel tijdens ontsteking of wondheling, ondergaat aanzienlijke verbouwing. Stromale verstijving van de tumor micro-omgeving kan promote tumorgroei en invasie als gevolg van stress geïnduceerde signalering mechanismen en oorzaak verbouwing van bloed-en lymfevaten ^11. Echter levende beeldvorming van matrixeiwitten beperkt tot collagenen die kunnen worden gedetecteerd door de tweede harmonische generatie behulp van multi-foton microscopie. Onlangs hebben we een nieuwe intravitale weergavemethode dat het risico van foto-en immuun-toxische beschadiging afgebeeld cellen en weefselstructuren ⁵ minimaliseert gepubliceerd. In vergelijking met vastgestelde beeldvormende technieken, waarbij de enige ronde continu intravitaal visualisatie in een bereik van 30 minuten tot 2 uur ^12-17 Onze intravitaal immunofluorescentie (IF) techniek kon 12 uur (langdurige ⁸⁾ beeldvorming. Het is belangrijk op te merken dat de beeldvorming tijd is beperkt tot 12 uur als gevolg van beperkingen, die in onze dierlijke protocol, maar er zijn geen technische contra-indicaties dat het niet kan worden verlengd als kritische parameters gezondheid van het dier, zoals bloeddruk en hartsnelheid worden gecontroleerd ^8. Bovendien, met behulp van een geautomatiseerde fluorescentie stereomicroscoop we konden beelden van meerdere velden te verzamelen tijdens een experiment waargenomen en zeldzame immunologische en remodelleren processen die zich in de fysiologische omgeving van de huid ondersteund door functionele bloed-en lymfevaten. Omdat de stereomicroscopic lens heeft een relatief groot, 2 cm, werkafstand in tegenstelling tot twee-foton microscopische optische vereist niet verdampen water onderdompelen, werd langdurig beeldvorming alleen uitgevoerd onder fluorescentie stereomicroscoop. Intravitale IF toegestaan ​​het immuunsysteem etikettering en de opsporing van een extracellulaire matrix component van de normale huid. Het ontwerp van deze techniek is gebaseerd op het innovatieve concept van het gebruik immunokleuring van levende cellen en weefsels matrix elementen chirurgisch blootgestelde muis lederhuid zonder dat schadelijke effecten immunotoxische ^5. De chirurgische procedure zelf veilig is de dermisvaatstelsel aangezien het slechts op de scheiding van de twee huidlagen in het oor die onafhankelijk worden geïnnerveerd, autonoom gevoed door bloed en afgevoerd door aparte lymfatische circulatie. Onze experimentele opstelling laat beeldvorming van een aantal belangrijke pathofysiologische gebeurtenissen over ten minste 12 uur, met inbegrip van leukocyten tussen bloed-en lymfevaten en wondgenezingsprocessen. In de oorspronkelijke publicatie, vergeleken we onze techniek om state-of-the-art normen op diverse terreinen van intravitale beeldvorming. Daarom zagen we bloedvat extravasatie en lymfatische intravasation gebeurtenissen door verschillende soorten leukocyten, waaronder de unieke visualisatie van immuuncellen in opvangsystemen terechtkomt in plaats van de verwachte initiële lymfevaten ^15. Ook, als aanvulling op de waarnemingen gedaan door andere groepen ^9,18, vonden we dat in vivo CCL21 is in staat om sterke, discontinue afzettingen op het verzamelen, maar slechts zelden op de initiële lymfevaten vormen.

Hier beschrijven we een gemodificeerde intravitale IF techniek die kan worden gecombineerd met twee-foton microscopie om netwerk van collagenen door tweede harmonische generatie (SHG) op te sporen. We tonen aan dat deze werkwijze ook kan worden gebruikt voor beeldvorming kankercel invasie in context van de dynamische tumormicromilieu die matrix moleculen zoals tenascine C, die grotendeels onontdekt de huidige beeldvormingstechnieken ¹⁹ omvat. We vonden dat de fibrillaire matrix van de tumor, gedetecteerd met de tweede harmonische generatie, neemt verschillende locaties van de tumor micro dan opnieuw gedeponeerde matrix samengesteld tenascine C. Verder beschrijven we voorbeelden van verblijf remodeling door lokale matrix contractie, lange termijn (12 uur) beeldvorming van T-cel-interacties met tumorcellen en tumor celmigratie langs collageen IV van de basale membraan. Dergelijke gebeurtenissen kunnen worden afgebeeld, terwijl het gelijktijdig opnemen van lokale fysiologische parameters zoals bloedvat permeability en lymfedrainage.

Protocol

Alle procedures uitgevoerd op dieren waren in strikte overeenstemming met de Animal Protection Act Zwitserse, de verordening betreffende de bescherming van dieren en de verordening inzake dierproeven. Wij bevestigen dat onze Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), genaamd Commission de Surveillance de l'Etat de Vaud (Permit Number: 2687), deze studie speciaal is goedgekeurd.

1. Tumor Enten van het Oor

1. Cultuur B16-F10 melanoomcellen-GFP in een 10 cm Petrischaal met DMEM + 10% FBS media.
2. Wanneer de cellen 80-90% confluent, wassen met PBS en los ze door behandeling met trypsine. Spin down cellen bij 1500 g gedurende 5 min bij 4 ° C, resuspendeer de pellet in 1 ml Ringer's oplossing en overgebracht naar een 1,5 ml Eppendorf buis. Spin opnieuw en verwijder alle supernatant behalve een dun laagje medium dat blijft net boven de pellet. Resuspendeer de cellen om te eindigen met een dikke cel suspensie.
3. Verdoven de muis met een mengsel van ketamine / dorbene [medetomidine] (75mg/kg-1mg/kg) en bevestigen dat het dier voldoende door het uitvoeren van een zachte teen knijpen wordt verdoofd. Verhoog de ​​isofluraan concentratie in stappen van 0,1% in het geval bewegingen worden waargenomen (bijvoorbeeld intrekking van de poot). Houd muis op een rectale thermistor gecontroleerde verwarmingselement (37 ° C) gedurende de gehele procedure en de ogen te beschermen met een geschikte oogzalf.
4. Bereid een Hamilton spuit (33 G naald, 10 ml volume spuit). Verwijder het dopje met de naald en de belasting 20 ul van cel drijfmest op de top van de tip kamer. Trek de zuiger tot 5 ml suspensie in de injectiespuit wordt geladen. Verwijder het overtollige slib uit de tip kamer en sluit het dopje.
5. Met plakband, bevestig de proximale rand van het oor op het puntje van een wijsvinger. In een hoek van 45 °, en steek langzaam de Hamilton spuit naald tussen dorsale dermis en het kraakbeen. Eenmaal binnen, dringen het oor proximaal naar distaal voor ongeveer 2-3 mm.
   Opmerking: De procedure van de cel injectie moet worden gedaan door getrainde en gecertificeerde technicus. Daarnaast moet dit proces uit te voeren langzaam en in de juiste volgorde: eerst de naald moet horizontaal naar het oor huid worden geplaatst en langzaam ingevoegd in het oor dermis. Zodra en pas daarna het einde naald in de huid, moet de plunjer worden ingedrukt. Indrukken van de plunjer cellen inoculatie initiëren in de huid. In het onwaarschijnlijke geval van de naald langs de twee lagen van het oor dermis, de laag van het kraakbeen en komt in de huid van de persoon die het experiment moeten lijden van de experimentator vinger worden beschouwd als een alarmerend teken en veroorzaken onmiddellijke terugtrekking van de naald uit de experimentator huid. Dan zuiger niet worden ingedrukt huid worden gesteriliseerd met alcohol. Alternatief kan levenloos voorwerp in plaats van een vinger wordt gebruikt om het oor te stabiliseren.
6. Injecteer 3 ul cel drijfmest en langzaam trek de naald uit het oor.Laat tumorcellen vormen een vaste tumor gedurende 7-9 dagen en volg de tumorgroei met een fluorescentie stereomicroscoop.
7. Ook de eerste stappen van tumorcel interactie met weefselmatrix volgen, minstens 50 pi 100.000 tumorcellen gesuspendeerd in Ringer's oplossing op de blootgestelde en gekleurd oor dermis (na stap 3.3).

2. Oor Chirurgie

1. Drie dagen voor het experiment, scheren de muis hoofd, ontharen de haren rond het hoofd en oor (10-15 sec) en afspoelen met water.
2. Verdoven van de muis met een mengsel van bevochtigde zuurstof en isofluraan (3-4% inductie, 1-2% onderhoud) en bevestigen dat het dier voldoende door het uitvoeren van een zachte teen knijpen wordt verdoofd. Verhoog de ​​isofluraan concentratie in stappen van 0,1% in het geval bewegingen worden waargenomen (bijvoorbeeld intrekking van de poot). Houd de muis op een rectale thermistor geregelde verwarming pad (37 ° C) gedurende de gehele procedure en de ogen te beschermen met eengeschikte oogzalf.
3. Bouw een platform gemaakt van 8 gelijmd glas histologie dia's. Keer de muis op zijn rug en plaats voorzichtig het tumordragende oor op de stapel glasplaatjes. Gebruik kleine strepen van plakband om de voorste en achterste randen van het oor fixeren op de stapel.
4. Snijd de ventrale huid van het oor langs de antihelix van de muis oorschelp met behulp van een scalpel. Met behulp van gebogen pincet voorzichtig afpellen de ventrale dermis en het kraakbeen van de dorsale dermis waar de tumor werd geïnoculeerd. Trek het ventrale huid en kraakbeen met gebogen pincet, waardoor de dorsale dermis. Opmerking: Als de grote bloedvaten van het oor worden gesneden of de bloedsomloop niet binnen 15 minuten terug naar normaal verloop, kan het oor niet worden gebruikt voor de beeldvorming. Houd altijd het geopende oor huid nat met behulp van Ringer buffer en de vochtigheid te beschermen door middel van een dekglaasje.
5. In het geval van een blijvende bloeden vorm tumorvaten, het bloeden te stoppen door toevoeging van 100 ultrombine (5 U / ml) in Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM _CaCl2, 28 mM natriumlactaat) bovenop het oor voor 5 minuten.
6. Was het oor tweemaal met ongeveer 5 ml Ringer-buffer en verwijder extra vloeistof met steriele doekjes. Onmiddellijk overgaan tot de volgende stap (niet laten de open oor droog op elk punt!).

3. Immunofluorescentiekleuring

Gebruik Ringer buffer gesupplementeerd met humaan serum (1:10), polyklonale muis secundair antilichaam tegen menselijk IgG (01:50) en 125 IE / ml (2,5 mg / ml) aprotinine (blokkerende buffer) voor kleuring stappen. Aprotinine plasmine remt bevorderen coagulatie eerste bloeden die optreden na de operatie beperkt.

1. Vouw het deel van het oor met de open dermis in de eminentia conchae en droog de buitenste ongeopende oor dermis met steriele doekjes. Immobiliseer het oor op de stapel glaasje door toepassing van 0,5 pi chirurgische lijm aan het voorste en achterste dorsal randen. Dan, voorzichtig plat de dorsale oor dermis op het glas.
2. Breng primaire antilichamen gericht extracellulaire matrix moleculen aan een concentratie van 10 ug / ml in een totaal volume van 100 ul blokkeerbuffer blootgestelde oor. Bedek het oor met een dekglas om de kleuroplossing voorkomen drogen op de oorranden. Incubeer gedurende 15 minuten. Was het oor tweemaal met ongeveer 5 ml Ringer's buffer.
3. Pas geschikte secundaire antilichamen of streptavidine conjugaten (fluoroforen met een hoge excitatie golflengte, zoals 594 nm of 647 nm zijn gunstig voor intravitale imaging) bij een concentratie van 10 ug / ml in een totaal volume van 100 ul blokkeerbuffer blootgestelde oor. Bedek het oor met een dekglaasje en incubeer gedurende 15 minuten. Was het oor tweemaal met ongeveer 5 ml Ringer's buffer.

4. Interactie van bloed overgedragen Activated Splenocyten met tumorcellen in situ

1. 7 dagen na inoculation van GFP-B16-F10 melanoom op de rug huid van congenic muis, euthanaseren van het dier en het verzamelen van de milt. Isoleer splenocyten met mechanische verstoring van de milt door een 70 um cel zeef.
2. Label splenocyten gedurende 8 minuten bij 37 ° C met Rode CMTPX cytoplasma vlek (1 uM in PBS), 4 keer wassen in 15 ml bij 4 ° C en direct injecteren met 200 ul serumvrij medium in de staartader van de muis waarvan oren ingeënt met B16-F10-GFP 7 dagen eerder.

5. Intravitale Beeldvorming met behulp van een stereomicroscoop

1. Voor kort beeldvorming (tot 2 uur), voeg vers bereide steriele ascorbaat-Ringer buffer die 140 mM natrium ascorbaat, 10 mM HEPES, 4 mM KCl en 5 mM _CaCl2, bij pH 7,5 (ascorbaat-Ringer buffer definitieve osmolariteit 320 mOsM) bovenop de geïmmobiliseerde oor. Bedek het oor met een dekglaasje en start beeldvorming met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop met 2X lens.
2. Voor de lange termijn imaging(Meer dan 2 uur), plaatst de uitlaat van een naald (aangesloten op een reservoir dat ascorbaat-Ringer buffer) onder het dekglaasje, ongeveer 0,5 cm van het oor. Gebruik van een peristaltische pomp met een snelheid van 1 ul / min voortdurend leveren ascorbaat-Ringer buffer om de kamer onder het dekglaasje.
3. Wijzig de 1X lens (werkafstand 6 cm) om 2X lens (werkafstand 2 cm). Open de acquisitie software en de instellingen van de tl-stereomicroscoop configureren. In de camera instellingen kiezen 12 bit als de kleurdiepte afbeelding en stel de camera reeks grijswaarden van 0% (minimum) tot 5,1% (maximum) en stel gammacorrectie 2.
   1. Stel overname winst tot 1 (minimum), fluorescentie-intensiteit tot 1.000 (maximum), vergroting op 280X-320X en stel de belichtingstijd te vermijden over-of onderbelichting (belichtingstijd moet minder dan 1 sec). Afhankelijk van het aantal beeldvormende gebieden (meestal 10 tot 20), tijdsinterval voor de verkrijging cyclus moet worden vastgesteld wordensen 1 tot 2 minuten. Verkort tijden kan het bleken en fototoxiciteit veroorzaken.
4. Kies verschillende velden die tumorcellen en gekleurde ECM eiwitten (zoals in Figuur 3) bevatten. Met behulp van de gemotoriseerde podium verwerven beelden van de geschikte fluorescerende kanalen (zoals GFP en fluorophore 647 in figuur 3) na verloop van tijd (bijvoorbeeld om de 2 min).
5. Na het experiment, euthanaseren de muis volgens de institutionele richtlijnen dier. In dit geval, aan het einde van het experiment, euthanize de verdoofde muis door cervicale dislocatie gevolgd door verbloeding (intracardiale perfusie).

6. Intravitale Beeldvorming met behulp van een microscoop Multiphoton

1. Met siliconenvet, bouwen een cirkelvormige wand van ongeveer 2 cm diameter en 2-3 mm hoogte in het oor, vanaf de basis van het oor. Zorg ervoor dat er geen lekken punten. Vul de cirkel met ascorbaat-Ringer's buffer.
2. Plaats muisop het podium en sluit de verwarming pad (37 ° C).
3. Open acquisitie software en de instellingen van de multiphoton microscoop configureren.
4. Kies maximaal vier verschillende velden die tumorcellen en gekleurd ECM eiwitten (zoals in Figuur 3) bevatten. In dit voorbeeld, tunen van de Ti-Saphire laser tot 850 nm voor GFP signaal een volgende single photon 647 voor fluorofoor 647 kleuring en visualiseren collagenen met SHG. Acquire beelden van de geschikte fluorescerende kanalen (zoals GFP en fluorophore 647 in figuur 3) en tweede harmonische generatie na verloop van tijd, bijvoorbeeld elke 2 minuten, met water immersie HCX APO 20X met 1,00 NA lens en 2 mm werkafstand.
5. Na het experiment, euthanaseren verdoofde muis met cervicale dislocatie gevolgd door verbloeding (intracardiale perfusie).

Resultaten

Tot op heden is immunobeeld in levend weefsel niet typisch gebruikt door de vorming van immuuncomplexen leidt tot hoge vlekken achtergrond en immunotoxiciteit ^20. Dit werd opgelost door pre-blokkerende Fcy receptoren op weefsel macrofagen, waardoor "blinderen" deze cellen vervolgens indirecte sterke immunokleuring. Aangezien de etikettering was extracellulaire kunnen fototoxiciteit en bleken fluorofoor worden geregeld door onderdompeling van het weefsel in natuurlijke antioxidant gebufferde isosmotisch ascorbinezuur (Fig. 1A). Sinds onze eerste beschrijving daarvan ⁵ verbeterden we onze anti-bleken en anti-fototoxisch techniek zodat fotobleken nu niet alleen geremd maar volledig voorkomen (Fig. 1B). Dit wordt gedaan door het inbedden oor in een groot volume antioxidant (100 pi) binnen de ruimte waarin de oor geïmmobiliseerd. Merk op dat 300 seconden constant beeldvorming tijd komt overeen met 10 uur van beeldvorming wanneer foto's zijnverzameld voor 500 msec iedere minuut (het gemiddelde imaging-instellingen).

Figuur 1. Fotobleken en fototoxiciteit werd gestopt door chloride te vervangen door ascorbaat in Ringer's buffer en verankeren van de blootgestelde oor in volume van 100 ul van deze oplossing. (A) Weefsel werd eerst gekleurd met een gebiotinyleerd antilichaam tegen collageen IV, de component van het basale membraan. De kleuring werd later gedetecteerd met streptavidine-647 (rood), en vervolgens constant afgebeeld gedurende 300 seconden in beide normale Ringer's buffer (bovenste paneel) of ascorbaat-Ringer's (onderste paneel). Merk op dat 300 seconden constant beeldvorming tijd komt overeen met 10 uur van imaging wanneer foto's worden verzameld voor 500 msec iedere minuut (de gebruikelijke beeldvorming instellingen). De helderste 25% van pixel intensiteit waarden zijn groen gekleurd. (B) Kwantificering van immunofluorescentie verval (50% in Ringer's versus 0% in ascorbaat-Ringer's). Waarden werden genormaliseerd tot de aanvankelijke fluorescentie. Beelden verzameld met immunofluorescentie stereomicroscoop. Schaal bar in A, 100 pm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De interactie tussen tumorcellen metastatische cellen en tumor-stroma is cruciaal voor het proces van migratie van tumorcellen en tumor immuniteit begrijpen. Dit komt omdat de tumor geassocieerde stroma samenstelt tot 90% van de tumormassa en actief regelt tumorgroei en metastasering ^21. Echter, mechanistisch inzicht in hoe de matrix drives tumorcel migratie naar ofwel lymfatische of bloedvaten ontbreekt ^22. Dit is deels te wijten aan het feit dat im intravitaalveroudering van matrixeiwitten beperkt tot visualisatie van gerijpte vezels van collagenen door tweede harmonische generatie twee-foton microscopie ^23. Daarom passen wij onze methode voor de visualisatie van het weefsel micro inbegrip van bloed-en lymfevaten, pericyten, zenuwen, spieren en adipocyten de directe visualisatie van extracellulaire matrix componenten. Vele structuren kunnen worden onderscheiden op basis van hun morfologie na immunokleuring voor basaalmembraan componenten zoals collageen IV of perlecan (Fig. 2A), maar directe kleuring specifieke celoppervlak markers, bijv. Lyve1 (Fig. 2B en C) en podoplanin (Fig . 2C), maakt verder onderscheiden initiële, capillaire lymfevaten (Lyve1 ⁺⁾ uit lymfatische verzamelaars (Lyve1 ^-). Kleuring voor-matrix gebonden CCL21 in de huid bleek afzettingen van deze chemokine op de basale membraan van lymfatische verzamelaars identified de kleuring voor perlecan, de heparan sulfaat proteoglycanen (Fig. 2D).

Figuur 2. Voorbeelden van levende kleuring in een normale muis oren. (A) Kleuring voor perlecan, een basaal membraan component, toont alle bloed-en lymfevaten, zenuwen, spiervezels en adipocyten. (B) Lyve1 kleuring markeert de initiële lymfatische capillaire netwerk. (C) Co-kleuring voor Lyve1 en podoplanin, een pan-lymfatische marker, toont netwerken van de eerste en het verzamelen van lymfevaten. De dorsale oor dermis kunnen worden afgebeeld met behulp van klassieke epifluorescentiemicroscopie (zonder optische sectie) als het oor dermis heeft een lage aantal adipocyten die anders zouden betrekking hebben op de beeldveld. (D) CCL21 stai ning (groen) op lymfatische basale membraan gekleurd voor perlecan (rood). Beelden verzameld met immunofluorescentie stereomicroscoop. Schaalbalken in A en B, 1 mm; in C, 100 micrometer en 50 micrometer in D. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Het belangrijkste structurele eiwitten die normaal niet kan worden gedetecteerd door SHG, de klassieke detectiemethode matrix ²³ kan worden gevisualiseerd. Zo vonden we dat tenascine C (Fig. 3A), een matrix eiwit dat tot expressie gebracht tijdens tumorigenese, wordt wondgenezing en ontsteking ¹⁹ afgezet op verschillende locaties van tumorstroma dan collagenen (Fig. 3B). Deze matrix heterogeniteit van invloed kunnen tumorcel distributie en metastase (fig. 3C).

t "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 3. De dorsale oor dermis live worden afgebeeld met behulp van multi-foton microscopie. Een gebied van de tumor B16-F10. Stroma werd gelabeld met tenascine-C-antilichaam en kleuring werd gedetecteerd met anti-geit-antilichaam 594 ezel. Immunofluorescentie van tenascin C (rood) netwerk wordt getoond in A en collagenen gedetecteerd met tweede harmonische generatie (SGH) in B. Deze twee netwerken zijn bovenop met tumorcellen (cyaan) in C (samengevoegd). Nieuwe tumor matrix gekenmerkt door tenascin C wordt niet overlappen met collagenen gedetecteerd met SHG (groen). De afbeelding met 44, vier keer het gemiddelde z-profielen met z-stap 1.0 micrometer werd overgenomen in 16-bits kleurdiepte mode. Beelden verzameld met twee-foton microscoop. Schaal bar, 100 micrometer.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Na de immunolabeling van verschillende tumor matrix componenten (bijv. tenascin C en collageen IV) van de tumor matrix we konden geïdentificeerd beperkt en plotselinge gebeurtenissen van de tumor matrix directionele remodeling (Video 1). Krachten ontwikkelen binnen tumormicromilieu kan leiden tot uitzetting of krimp van de tumor matrix en derhalve remodelleren en verlenging van de tumorvasculatuur vergelijkbare mate als we eerder vertoonde bij genezende wonden ^11,24.

Video 1. Uitbreiding van de tumor matrix gelabeld met collageen IV (rood) en tenascine C (cyaan) langwerpig bloedvaten (pijl) en passief translocate drie tumorcellen (groen). Gelokaliseerde samentrekking van teascin C-rijke tumor matrix translokeren bloedvat (rood horizontaal georiënteerd structure) ongeveer 100 urn gedurende 12 uur beeldvorming. Beelden verzameld met immunofluorescentie stereomicroscoop. Klik hier om de video te bekijken.

Met multi-foton microscopie met fluorofoor etikettering is problematisch omdat foton flux gebruikt in deze experimenten snel bleken fluorescente kleurstoffen die niet beschermd tegen oxidatie ^25. Hier laten we zien dat we twee-foton time-lapse microscopie kunt uitvoeren terwijl tegelijkertijd beeldvorming immunolabeled tenascin C matrix met minimale fotobleking van fluoroforen zelfs bij hoge foton dichtheid twee-foton microscopie (Video 2).

Video 2. Laag niveau fotobleking van tenascin C immunofluorescentie (rood) tijdens de twee-foton microscopie. B16-F10-GFP tumorcellen (cyaan) werden afgebeeld in de open dorsale oor 9 dagen na de inenting. De fluorescerende signaal werd beschermd door toepassing van ascorbaat-Ringer-buffer op de afgebeelde weefsel. Tweede harmonische generatie (groen) niet overlappen met nieuwe matrix vertegenwoordigd door image C. 16 bit kleurdiepte tenascin met 11, vier keer het gemiddelde z-profielen met z-stap 1,9 micrometer werd verworven gedurende 15 minuten. Beelden werden elke 1 minuut 5 seconden in 6 z-vliegtuigen verzameld verzameld. Klik hier om de video te bekijken.

We hebben ook afgebeeld immuun-cel interacties met uitgezaaide tumorcellen. CMTPX-gelabelde splenocyten van een tumor-dragende muizen geëxtravaseerd van tumor-geassocieerde bloedvaten 8 uur na intraveneuze transfusie, vielen de tumor matrix en actieve interactie met tumorcellen door het vormen van langdurige celcontacten (Video 2). 647 fluorofoor-gelabelde collageen IV structuren waren resistent tegen fotobleken tijdens de 12 uur van beeldvorming.

Video 3. Interactie van CMTPX-gelabelde splenocyten van tumor (B16-F10)-bearing muis met individuele tumorcellen (GFP-B16-F10). Splenocyten waren iv transfusie na weefselkleuring voor collageen IV. Collageen IV-groen (647), splenocyten-rood (CMTPX), B16-F10 cyaan (GFP). Beelden verzameld met immunofluorescentie stereomicroscoop. Video duration 12 uur. Klik hier om video te bekijken.

Vers geïsoleerde tumorcellen werden bedekt op de blootgestelde oor dermis vooraf gekleurd voor collageen IV. We konden waargenomen dat na het naleven van het weefsel sommige groepen van cellen begon collectieve migratie langs de basale membraan van de bloedvaten en adipocyten.

Video 4. Tumorcellen migreren langs basale membranen. Normaal oorhuid gekleurd voor collageen IV (647, red) werd bedekt met vers passage B16-F10-GFP cellen en afgebeeld gedurende 5 uur. Sommige tumorcellen die nageleefd weefsel begon collectieve migratie langsbasale membraan van de bloedvaten en adipocyten. Beelden verzameld met immunofluorescentie stereomicroscoop. Video duration:. 5 uur Klik hier om de video te bekijken.

Ook, omdat het oor dermis nagenoeg tweedimensionaal, konden gemakkelijk verzamelen van grote hoeveelheden gegevens met behulp van snelle fluorescentie stereomicroscopie plaats van langzamer en duurder confocale microscopie of multiphoton. Het is echter ook mogelijk een van de genoemde scanning microscopie methoden ons intravitaal IF preparaten (Fig. 3, Video 1).

Discussie

Betekenis

Hier presenteren we een nieuwe intravitale microscopie benadering hoge resolutie en dynamisch visualiseren van verschillende weefsels micro componenten, waaronder fibrillaire en zeefvormige matrixeiwitten maakt. Deze werkwijze heeft verschillende voordelen boven huidige intravitale beeldvormingstechnieken: (i) Intravitale fluorescentie beeldvorming werd gebruikt bij microcirculatie onderzoek, bijvoorbeeld om opgeloste lekkage uit bloed of lymfevaten naar spoor, maar niet gecombineerd met immunokleuring. (Ii) Het gebruik van genetisch gemodificeerde reportermuizen maakt specifieke celtypen te beelden, maar vereist de beschikbaarheid (ofwel een aanzienlijke inspanning nieuwe te creëren) en beperkt het aantal interagerende celtypen die kunnen worden bestudeerd. (Iii) Extracellulaire matrix kan worden afgebeeld in vivo door tweede harmonische generatie, maar deze techniek herkent alleen vezelachtige collagenen, waardoor een groot aantal belangrijke extracellulaire componentenzoals basale membranen, fibronectinen, tenascins, groeifactoren, chemokines en weefsel glycosaminoglycans buiten het bereik van lopend onderzoek. Onze methode overwint deze beperkingen, en staat standaard beeldvormende technieken worden opgenomen en verder gecombineerd met immunokleuringen voor andere celtypes, weefselstructuren, deposito's van heparinesulfaat bindende groeifactoren (VEGF bv. ²⁶⁾ en chemokines (CCL21 ^5,18 en Fig. 2D ) of extracellulaire matrixeiwitten tegelijkertijd volgen bloed en / of lymfe stromen.

Beperkingen

De epifluorescentie beeldvorming van intravitale IF beperkt tot de dunne huid flappen, ontnomen dikke onderhuid (vetweefsel). Hoewel we vonden dat de dorsale oor dermis optimaal relatief onschadelijke chirurgische blootstelling van de oorhuid, epifluorescentie met intravitale IF techniek niet beperkt tot oor dermis en kan mogelijk worden toegepast bijvoorbeeldde blootgestelde huid van de tenen of de achterkant huid van pasgeboren muis. Rapid antilichaam kleuring (15 minuten) in immunofluorescentie IF is niet afhankelijk van passieve diffusie maar vereist functioneel lymfatische drainage en interstitiële fluïdumstroming, dus geen kleuring worden waargenomen als lymfevaten zijn afgesloten ^27. In overeenstemming met die, lymfevaten vlekken sterker dan lekkende bloed vaatstelsel (gewond schepen, arteriolen) ^5. De scheiding van de dorsale en ventrale oor huidlappen een mild chirurgische ingreep maar het veroorzaakt schade sommige haarvaten en celdood verschillende weefselcellen. Dit kan een probleem zijn als men nodig heeft om volledig intact weefsel te onderzoeken, bijvoorbeeld kijken naar het milde effect van drugs op de overleving van de cel. Ook de toepassing van anti-oxidant die dient om de huid te beschermen tegen fototoxiciteit en fotobleking sluit het gebruik van intravitale immunofluorescentie techniek om te studeren bv het weefsel oxidatieve stress of stikstofmonoxide biology.

Tenslotte verblindende weefsel inwoner macrofagen met immuuncomplexen kunnen deze cellen en de invloed bijvoorbeeld de studie van weefsel immuunrespons en dendritische cel activatie activeren.

Wijzigingen en probleemoplossing

Om weefsel oxidatieve stress of stikstofmonoxide studie biologie, ascorbaat moet worden vervangen door andere weefsel compatibele media die niet interfereert met de experimentele productie. Ook moet blokkeren Fc receptoren op dermale immuuncellen worden vermeden als het doel van de studie is de functie en activering van het weefsel immuunrespons en dendritische cel activering en migratie. Dit kan worden gedaan met het gebruik van secundaire antilichaam met Fc-fragment gesplitst (F (ab) 2 antilichaamfragmenten) of het gebruik van gebiotinyleerde antilichamen en fluorescerende streptavidine als detectiereagentia.

Toekomstige toepassingen

We presenteren een nieuwe en unieke intravan vitaal belang als techniek om het niet-vezelachtige bestanddelen van de extracellulaire matrix in transplanteerbare huidtumoren in combinatie met SHG-gedetecteerde fibrillar en gerijpt collageen met behulp van twee-foton microscopie. Een van de voordelen van het gebruik van multi-foton (of confocale) microscopie op epifluorescentie beeldvorming z-stapelen mogelijk en derhalve ruimtelijk co-localisatie van gebeurtenissen binnen extracellulaire matrix, bijv. tumor intravasation in lymfatische of bloedvat die bij standaard epifluorescentie microscopie kunnen alleen worden afgeleid uit morfologische veranderingen van de binnendringende cel. Deze techniek heeft veel bredere mogelijkheden. Zo hebben wij intravitaal gebruikt wanneer het mechanisme van lymfatische afsluiting door lymfatische specifieke fotodynamische therapie ²⁷ onderzoeken. Verdere mogelijke toepassingen van deze werkwijze omvatten, maar zijn niet beperkt tot onderzoek immuniteit huid tijdens ontsteking, regeling van transplantaatafstoting of methoden van bloed en lymfe atic vaartuig groei tijdens het ontstaan ​​van tumoren.

Kritische stappen in de procedure

De belangrijkste stap die essentieel implicaties voor het ondersteunen van een fysiologisch weefselmilieu heeft een chirurgische scheiding van de ventrale huid en kraakbeen dorsale dermis. Snijden of occlusie van de belangrijkste slagader of ader zal leiden tot overmatig bloeden en lokale weefsel hypoxie, die cellulaire respons op behandelingen en celbeweging ⁸ zal beïnvloeden. Immobiliseren van het oor met chirurgische lijm moet worden gedaan met zorg als morsen de lijm op bloot weefsel zal een blijvend letsel toebrengen aan het weefsel door occlusie van de bloedvaten. De temperatuur van de muis moeten worden gecontroleerd en bewaard bij 37 ° C. Bovendien bevochtigde zuurstof moet worden gebruikt voor de isofluraan anesthesie, waardoor de ogen en de longen blijven goed bevochtigd tijdens het experiment. Ook moet natriumascorbaat vers worden bereid en de pH voor gebruik gecontroleerd.

ntent "> Kortom, dit intravitaal immunofluorescentie overbrugt realtime lokale metingen van fysiologische functie met moleculaire beeldvorming van complexe cellulaire gebeurtenissen in de huid van muizen. Bovendien is deze methode een groot potentieel als het gemakkelijk kan worden toegepast op bv. de postontwikkelingsonderzoek mechanismen van bloed en lymfe-angiogenese of de vroege fasen van huidinfectie visualiseren door verschillende ziekteverwekkers. Met zijn flexibiliteit en high-throughput potentieel, kan dit intravitale techniek aanzienlijk bijdragen aan meerdere velden van de biologie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mice Strain
BALB/C muizen (8-12 weken )	Charles River		Orleans, Frankrijk
C57/Bl6 Muizen (8-12 weken )	Harlan		Carshalton UK
Cellijn
B16 F10 Melanoom dat OVA-GFP tot expressie brengt
Anesthesiegebruik
Isofluoraan	Minrad Inc.	2222	Minrad Inc., Buffalo, NY
Bevochtigd afleveringssysteem	Rothhacher GmBH		Berne, Zwitserland
DC Temperatuurregelsysteem	FHC Inc		Bowdoin, MA
Stereomicroscoop
Fluorescentie stereomicroscoop met een gemotoriseerde stage.	M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Duitsland
1X lens (lineaire systeemvergroting van 7.5X tot 160X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Duitsland
2X lens (lineaire systeemvergroting van 15.6X tot 320X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Duitsland
DFC 350 FX camera bestuurd door LAS AF software	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Duitsland
Multifotonmicroscopie
LEICA SP5, tweede-foton vermenigvuldiger, gemotoriseerde stage	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Duitsland
HCX APO 20X/1.2 olie-immersie
Chameleon Ultra Laser
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM natriumlactaat)	B. Braun Medical AG	445968	Sempach, Duitsland
Aprotinine	Elastine	AP92	Owensville, MO
Trombine	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	Taufkirchen, Duitsland
Natriumascorbinezuur	Sigma-Aldrich	11140-50G	Taufkirchen, Duitsland
Muis Serum tegen menselijk IgG	Abcam	ab34834	Cambridge, UK
Collageen IV	Abcam	AB6581	Cambridge, UK
Perlacan	RnD	ab79465	Minneapolis, MN
Tenascine C	RnD	AF3358	Minneapolis, MN
Podoplanine	RnD	AF3244	Minneapolis, MN
LYVE-1	Reliatech	103-PA50	Wolfenbüttel, Duitsland
CCL21	RnD	AF457	Minneapolis, MN
Streptavidine Pacific Blue	Invitrogen	S11222	Grand Island, NY
Streptavidine Alexa 647	Invitrogen	S21374	Grand Island, NY
Streptavidine Alexa 488	Invitrogen	S11223	Grand Island, NY
Donkey Anti Goat 594	Invitrogen	A21113	Grand Island, NY
Donkey Anti Rabbit 594	Invitrogen	A21207	Grand Island, NY
CMTPX CellTracker	Lifetechnologies	C34552	Carlsbad, Californië
Histocryl (chirurgisch lijm)	Braun Aesculap	1050060	Tuttlingen, Duitsland
Cell Cultuur Reagentia
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium (DMEM	Gibco Invitrogen	E15-843	Grand Island, NY
Foetaal bovien serum (FBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY
Trypsine	Gibco Invitrogen	25300062	Grand Island, NY
PBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY