Gelijktijdige meting van de pH in Endocytische en Cytosolic compartimenten in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Samenvatting

Er zijn verschillende methoden beschikbaar om intracellulaire pH te meten, maar zeer weinig van deze laten gelijktijdige meting van cytoplasmatisch en organellair pH toe. Hier beschrijven we in detail een snelle en nauwkeurige methodologie om gelijktijdig cytoplasmatisch en vesiculair pH te meten door middel van ratiometrische beeldvorming van levende cellen.

Samenvatting

Intracellulair pH wordt strikt geregeld en er zijn verschillen in pH tussen het cytoplasma en organellen gemeld¹. Regulering van cellulair pH is cruciaal voor homeostatische controle van fysiologische processen die omvatten: eiwit-, DNA- en RNA-synthese, vesiculair transport, celgroei en celdeling. Veranderingen in cellulaire pH-homeostase kunnen leiden tot schadelijke functionele veranderingen en de progressie van verschillende ziekten bevorderen². Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het meten van intracellulair pH, maar zeer weinig hiervan staan gelijktijdige meting van pH in het cytoplasma en in organellen toe. Hier beschrijven we in detail een snelle en nauwkeurige methode voor de gelijktijdige meting van cytoplasmatisch en organellair pH door gebruik te maken van confocale microscopie op levende cellen³. Dit doel wordt bereikt met behulp van twee pH-gevoelige ratiometrische kleurstoffen die selectieve celcompartiment-verdeling hebben. SNARF-1 bijvoorbeeld is gecompartimentaliseerd binnen het cytoplasma, terwijl HPTS gecompartimentaliseerd is binnen endosomale/lysosomale organellen. Hoewel HPTS gewoonlijk wordt gebruikt als een cytoplasmatische pH-indicator, kan deze kleurstof specifiek vesiculen langs de endosomale-lysosomale route markeren na opname door pinocitose^3,4. Met behulp van deze pH-gevoelige sondes is het mogelijk om tegelijkertijd pH binnen de endocytische en cytoplasmatische compartimenten te meten. De optimale excitatiegolflengte van HPTS varieert afhankelijk van de pH, terwijl voor SNARF-1 de optimale emissiegolflengte varieert. Na belasting met SNARF-1 en HPTS worden cellen gekweekt in verschillende pH-gekalibreerde oplossingen om een pH-standaardcurve voor elke sonde te construeren. Celbeeldvorming door confocale microscopie maakt het mogelijk om artefacten en achtergrondruis te elimineren. Vanwege de spectrale eigenschappen van HPTS is deze sonde beter geschikt voor meting van het licht zure endosomale compartiment of om alkalinisering van de endosomale/lysosomale organellen te demonstreren. Deze methode vereenvoudigt data-analyse, verbetert de nauwkeurigheid van pH-metingen en kan worden gebruikt om fundamentele vragen te beantwoorden met betrekking tot pH-modulatie tijdens celresponsen op externe uitdagingen.

Protocol

1. Bereiding van oplossingen voor Cellulaire pH kalibratie

1. De volgende verbindingen vijf afzonderlijke 50 ml conische buizen 5 oplossingen worden gebruikt voor kalibratie bereiden:
   • NaCl (1 ml 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml _H2 0)
   • KCl (6,75 ml van 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml _H2 0)
   • Glucose (1 ml 1 M D-glucose) (1 M D-glucose = 1,80 g in 10 ml _H2 0)
   • MgS0 ₄ (0,05 ml 1 M _MgSO4) (1 M _MgSO4 = 1,20 g in 10 ml _H2 0)
   • 20 mM HEPES (1 ml 1 M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml _H2 0)
   • _CaCl2 (0,05 ml 1 M _CaCl2) (1 M _CaCl2 = 1,47 g in 10 ml _H2 0)
     Bereid alle oplossingen met tweemaal gedestilleerd H ₂ O (DDH ₂ O).
2. Voltooi elke oplossing met 35 ml van DDH ₂ O en meng met een magneetroerder tot zolutie wordt bereikt.
3. Stel de pH van elke oplossing met 1 N KOH of 1 N HCl tot pH-waarden van 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 en 7,5 te verkrijgen. Pas vervolgens het volume met gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 ml.
4. Maatregel 5 mg nigericine toevoegen aan 670 ul van absolute EtOH een 10 mM bereiden nigericine stamoplossing.
   Let op: nigericine is zeer giftig en moet met grote zorg (handschoenen, een veiligheidsbril en masker) worden behandeld. Meng de oplossing door omkeren totdat de nigericine volledig is opgelost.
5. Voeg 0,05 ml 10 mM nigericine (eindconcentratie 10 uM) aan elk van de ijkoplossingen. Nigericine een ionofoor die celmembraan permeabiliteit verhoogt en veroorzaakt equilibratie van intracellulaire en extracellulaire pH in de aanwezigheid van een depolariserende concentratie extracellulair K ^+.
6. Kalibratieoplossingen kan worden opgeslagen tot 1 maand bij 4 ° C

2. Celpreparaat

1. Onder een biologische Safety kap zaad cellen in 35 mm x 10 mm kweekschalen in 2 ml kweekmedium gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum en antibiotica. Gebruik de hoeveelheid cellen die nodig is om ongeveer 50% confluentie waarborgen na 24 uur.
   OPMERKING: In onze experimenten gebruiken we de HT-1080-cellijn en plaat 1 x 10 ⁵ cellen per cultuur schotel.
2. Bepaal het aantal kweekschalen nodig voor het experiment en plaat 5 extra kweekplaten worden gebruikt voor kalibratie.
3. Plaats kweekschalen in een 37 ° C / 5% _CO2 incubator gedurende ten minste 24 uur.

3. Bereiding van pH-gevoelige probes

1. Bereid een 1M voorraad oplossing van het fluorescerende pH sonde 8-hydroxypyreen-1, 3,6 trisulfonzuur, trinatriumzout (HPTS / pyranine) in DDH ₂ 0. Deze oplossing moet worden bewaard bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht.
2. Bereid een voorraadoplossing van 1 mM 5 - (en-6)-carboxyl seminaphthorhodafluor acetoxymethylester acetaat (C-SNARF-01:00; genoemd thereafter SNARF-1) door het oplossen van 1 mg SNARF-1 in 1,76 ml DMSO. Meng grondig door herhaald pipetteren. SNARF-1 oplossing moet worden bewaard bij -20 ° C en beschermd tegen licht.

4. Cell Labeling

1. Zestien uur voor levende cellen beeldvorming, voeg 2 pl 1 M HPTS stamoplossing (eindconcentratie 1 mM) aan elke kweekschaal met 2 ml compleet medium.
2. De terugkeer van de cultuur schalen in de broedstoof. De HPTS sonde cel-impermeant, dus label organellen de sonde moet door pinocytose worden genomen. Deze voorwaarde vereist dat de mobiele incubaties met HPTS worden uitgevoerd in-serum aangevuld kweekmedium.
3. Na incubatie met HPTS Was de cellen tweemaal met steriele PBS en voeg 2 ml serumvrij medium gedurende minstens 2 uur. Incubatie met SNARF-1 heeft in serumvrij medium worden uitgevoerd omdat serum de opname van de probe kan voorkomen.
4. Voeg 10 ul van een 1 mM SNARF-1 stock oplossing af te verkrijgenspronkelijke concentratie van 5 uM en laat cellen geïncubeerd gedurende 20 min bij 37 ° C, bij schemering. C-SNARF-1 concentratie en incubatietijd kan variëren afhankelijk van celtype.
5. Aan het einde van de incubatie, wassen cellen tweemaal in steriel PBS en voeg 2 ml serumvrij medium.

Toevoeging van pH modulatoren 5.

1. Om te beoordelen of de methode pH veranderingen kan detecteren in cellen kunnen verschillende reagentia die intracellulaire pH moduleren worden gebruikt:
   • Bafilomycine A1, een specifieke remmer van V-ATPase ⁵
   • Na ⁺ / H ⁺ exchanger isovorm 1 (NHE-1) ⁶
   • _NH4Cl, een zwakke base die intracellulaire pH ⁷ verhoogt
   1. Bereid voorraadoplossingen van de bovengenoemde reagentia:
      • Bafilomycine A1: voeg 10 ug bafilomycine A1 tot 160 pl van DMSO om een ​​voorraad oplossing van 100 urn
      • EIPA: voeg 25 mg van het EIB naar 1,67 ml methanol aan obtaina eindconcentratie van 50 mM
      • _NH4Cl: Los 0,53 g ammoniumchloride in 10 ml DDH ₂ O tot een eindconcentratie van 1 mM te verkrijgen.
      
      Opmerking: Alle stockoplossingen moeten bij 4 ° C bewaard behalve bafilomycine A1 die moeten worden opgeslagen bij -20 ° C en beschermd tegen licht.
   2. In afzonderlijke kweekschalen, voeg een van de reagentia zoals hieronder beschreven:
      • 2 ui 100 uM bafilomycine A1 (eindconcentratie 100 nM)
      • 1 ui 50 mM EIB (eindconcentratie 25 uM)
      • 40 gl 1 M _NH4CI (eindconcentratie 20 mM)
   3. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
2. Ga verder met beeldopname.

6. Specificaties van de live-cell imaging microscoop en Acquisitie Instellingen

1. Live-cell imaging met behulp van een 40x objectief gemonteerd op een spectrale omgekeerde scanning confocale microscope uitgerust met een gemotoriseerde XY podium, een kamer die glazen bodem cultuur gerechten biedt in een gecontroleerde omgeving (temperatuur, luchtvochtigheid, CO ₂₎ stage incubator.
2. De confocale instrument (Olympus FV1000) die hier gebruikt is uitgerust met:
   • Een diodelaser 405 nm
   • Een 40 mW argon laser (458 nm, 488 nm, 515 nm)
   • Een helium neon laser (543 nm)
   • Fluoriet 10x objectief, NA0.4
   • Een LUCPLFLN 40X objectief, NA0.60
   • Een PLAPONSC PLAN APO 60x olie doelstelling, NA1.4
   • Een dichroïsche spiegel DM 405/458/488/543
   • Een SDM 560 en een SDM 640 koudlichtfilters
   • Een BA655-755 barrièrefilter
   • Een beam splitter BS20/80
   • Data analyse software voor het verwerven en analyseren,
3. Zodra het podium couveuse opgewarmd is tot 37 ° C en de microscoop is ingesteld, plaats een cultuur schotel eerder geïncubeerd met HPTS en SNARF-1 in de confocale fase beeldvorming kamer.
4. Eenfter lokaliseren van een gebied van belang, past u de aanschaf van software instellingen Figuur 1.
   • Instellen van twee virtueel kanaal sets.
   • Inleiding van de eerste fase die overeenkomt met HPTS excitatie bij 405 nm en emissie collectie bij 505-525 nm en SNARF-1 excitatie bij 543 nm en emissie collectie van 570-600 nm.
   • Inleiding van de tweede fase die overeenkomt met HPTS excitatie bij 458 nm en emissie collectie bij 505-525 nm en SNARF-1 excitatie bij 543 nm en emissie collectie van 640-650 nm.
   • De confocale diafragma wordt ingesteld op 175 urn standaard en optimale diafragma moet handmatig worden ingesteld op 300 pm.
   • Neem Afbeelding door het stapelen van seriële horizontale optische secties (800 x 800 pixels) van 0,4 micrometer dik.

OPMERKING: Een 40X doelstelling is handig om meerdere cellen tegelijk te observeren en werkt goed voor organel bekijken. Echter, ruimtelijke resolutie en de intensiteit van het signaal zijn better bereikt door een 60X objectief olie. Bovendien is er geen excitatie of emissie overspraak tussen de twee kleurstoffen.

7. Kalibratie van pH-sensing Probes

1. Alvorens te kalibreren, verwijder medium van de cultuur schotel eerder geïncubeerd met HPTS en SNARF-1, twee keer wassen met steriele PBS en voeg vervolgens 2 ml van een van de vijf ijkoplossingen.
2. Plaats de cultuur schotel in de confocale fasekamer.
3. Ga verder met time-lapse beeldacquisitie volgens de volgende instellingen:
   1. Stel het aantal beelden en intervalduur tijden voor het experiment.
      OPMERKING: We gebruiken meestal een 1 min interval tussen opnamen maximaal 30 minuten.
   2. Programmeer de sluiter te sluiten tussen de verwerving van elk beeld.
4. Noteer de fluorescentie-intensiteit per min in een spreadsheet software en bepaalt het tijdstip waarop fluorescentie-intensiteit is stabiel. Intracellulaire pH meestal stabiel na 15 - 20 minuten.
5. Repeat stappen 7,1-7,4 met behulp van een nieuwe cultuur schotel voor elke resterende kalibratie-oplossing.

8. Data Acquisition

1. Na kalibratie is uitgevoerd verkrijgen voorbeeldgegevens 4-5 willekeurige velden met 15-20 cellen per veld. Twee beelden worden verkregen voor elk veld: een voor HPTS etikettering (blaasjes) en de tweede voor SNARF-1 etikettering (cytosol).
2. Achtergrond fluorescentie (extracellulair gebied) wordt digitaal afgetrokken van fluorescerende beelden van beide sondes. Gelabelde blaasjes en cytosol van hun opgeslagen beelden worden geselecteerd met een binair masker. Voor elke pH-sonde, worden fluorescentie-intensiteiten gemeten op een numerieke schaal (0-4,095 grijswaarde schaal). Een gemiddelde intensiteit voor pixels in het organel of cytoplasma wordt berekend en de waarden worden gebruikt om fluorescentie ratio te berekenen.

9. Data Analysis

1. Verschillende software pakketten zijn commercieel beschikbaar voor data-analyse. DwzFluoView Software.
2. In een spreadsheet plaat waarden en berekent fluorescentie verhoudingen als volgt: Bij HPTS, R = (V _{458 nm} / _{405 nm} F) en, bij SNARF-1, R = (V _{644 nm} / _{584 nm} F ).
3. Plot de gegevens met behulp van wetenschappelijke grafische software zoals GraphPad Prism. De curve moet fluorescentie ratio's (Y-as) te beelden als functie van de pH (X-as). Curve fitting wordt bereikt met behulp van niet-lineaire regressie.
4. Verzamel fluorescentie-intensiteiten van de monsters zoals beschreven in stap 8.2 en bereken fluorescentie ratio. Gebruik kalibratiecurven verhoudingen transformeren tot pH-waarden.

Resultaten

Voor de gelijktijdige meting van pH in zowel intracellulaire en endosomale / lysosomale compartimenten cel, werden de ratiometrische fluorescentie pH-sensing probes Snarf-1 en HPTS gebruikt. SNARF-1 is beperkt tot de cytosolische compartiment terwijl HPTS laat ratiometric pH-meting van de endosomale / lysosomale compartiment. Cel laden met HPTS 16 uur laat zijn selectieve lokalisatie in endosomes / lysosomen ^4. Een typisch voorbeeld van fluorescentie opgenomen van HT-1080 cellen opgeladen met de pH-gevoelige ...

Discussie

Kwantitatieve meting van de pH in levende cellen beeldvorming van verschillende cellulaire compartimenten nodig pH variaties in celreacties op externe uitdagingen te meten. Een van de belangrijkste hindernissen die overblijft is gemakkelijk en specifiek richten cellulaire compartimenten. In dit verband hebben enkele studies gewezen op het gebruik van HPTS als intracellulaire pH indicator geïntroduceerd in cellen door elektroporatie of microinjectie ^8-10. Deze technieken lijden aan ernstige nadelen, namelijk e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Oplossingen voor kalibratie
Natriumchloride	Fischer	L-11621
Kaliumchloride	Fischer	M-12445
D-Glucose (dextrose)	Fischer	D16-1
Magnesiumsulfaat	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Calciumchloridedihydraat	Fischer	M-1612
Gedeïoniseerd water	N/A	N/A
Nigericine	Calbiochem	481990	Toxisch bij inademing of bij contact met de huid
Beschermd houden tegen licht bij 4 °C
Kweekschotels ∅ 35mm	BD Biosciences	354456
pH-sensor sondes
8-Hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS)	Life technologies	H-348	Uit de buurt van licht houden bij kamertemperatuur
5-(en-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetaat	Life technologies	C-1271	Uit de buurt van licht en vocht houden bij -20 °C
Dimethyl sufoxide (DMSO)	Fischer	BP231-1	Schadelijk
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 100X
Kaliumchloride	Fischer	M-12445	20 g
Natriumfosfaat monobasisch	Fischer	S369-1	115 g
Kaliumfosfaat monobasisch	J.T Baker	3246-01	20 g
Gedeïoniseerd water	N/A	N/A	Breng tot 1 L
Autoclaveer en pas pH aan tot 7.4
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Natriumchloride	Fischer	L-11621	40.5 g
Gedeïoniseerd water	N/A	N/A	Breng tot 5 L
pH modulatoren
Bafilomycine A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amilorid (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Ammoniumchloride	Fischer	A649-500