Methodenartikel

Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

DOI:

10.3791/51408

⸱

29 mei 2014

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enkele cel genexpressie test is noodzakelijk om inzicht stamcel heterogeniteiten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heterogeniteit van stamcellen bevolking belemmert gedetailleerd inzicht in stamcel biologie, zoals hun differentiatie neiging tot verschillende geslachten. Een enkele cel transcriptome test kan een nieuwe benadering voor het ontleden van individuele variatie zijn. We hebben de enkele cel qRT-PCR-methode ontwikkeld, en bevestigde dat deze methode werkt goed in verschillende genexpressie profielen. In enkele cel niveau, elke menselijke embryonale stamcellen, gesorteerd per OCT4 :: EGFP positieve cellen, heeft een hoge expressie in OCT4, maar een ander niveau van NANOG expressie. Onze enkele cel genexpressie test moet nuttig zijn om de bevolking heterogeniteit ondervragen zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meeste hogere eukaryote populaties heterogeen derhalve de analyse van gepoolde populatie, is het vaak moeilijk te interpreteren cellulaire functies. Individuele cellen binnen een populatie kan subtiel verschillend zijn, en deze verschillen kunnen belangrijke gevolgen hebben voor het pand en de functie van de gehele bevolking 1, 2. Vooral menselijke embryonale stamcellen (hESCs) bekend heterogene, die verschillende niveaus van pluripotentie en diverse mogelijkheden veroorzaakt geslacht specificatie fijn specifieke wijze 3, 4 zijn. Zo kunnen verschillende celoppervlak antigenen worden gebruikt om gedifferentieerde pluripotente stamcellen categoriseren, 5 en Austin Smith groep voorgesteld verschillende pluripotentie in muis embryonale stamcellen, op basis van hun morfologie, differentiatie neiging en afhankelijkheid van signaalweg 6. Dit fenomeen werd de hypothese in menselijk embryonic stamcellen 7. Overwegende dat de studies werden uitgevoerd tussen de verschillende stamcellijnen, niet individuele enkele stamcellen, kan het zeer intrigerend zijn om verschillende niveaus van pluripotency analyseren op de enkele cel niveau, die mogelijk invloed heeft op hun differentiatie capaciteiten jegens alle somatische cellijnen.

Cellulaire en moleculaire heterogeniteit kan worden gedicteerd door transcriptie profilering, die de 'single cell transcriptome' wordt genoemd en benadrukt nieuwe benaderingen voor de kwantificering van genexpressie niveaus 8-10. Voor de analyse van genexpressie niveaus in individuele cellen ontwikkelden we een eenvoudig maar robuust protocol van eencellige kwantitatieve RT-PCR. We bevestigden de effectiviteit en haalbaarheid van ons protocol door het vergelijken van elke helft van enkele cellysaten evenals serieel verdunde totaal RNA van hESC ', wat resulteert in een minimale technische variaties en verschillen. Verder gebruikten we een genetische reporter lijn homogene p isolerenEVOLKING van hESCs gebruik gene targeting systeem. De donor vector voor targeting OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro construct) en een paar TALEN plasmiden werden gebruikt 11. De donor vector en een paar TALEN plasmiden werden geïntroduceerd in hESCs (H9, WA09) met behulp van onze nucleofectie en stamselectie protocol en het onderhoud van hESC 'werd uitgevoerd op basis van onze routine protocol 12. We bevestigden deze genetische reporter lijn uiten EGFP voor OCT4 expressie in OCT4 :: EGFP hESCs.

Ons resultaat toont aan dat individuele hESCs (gesorteerd op OCT4 :: EGFP sterk positieve cellen) in het bezit een hoge mate van OCT4 expressie, maar verschillende niveaus van NANOG expressie. Dus moet onze enkele cel genexpressie test nuttig populatie heterogeniteit van pluripotente stamcellen te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van een 96-well plaat

  1. Meng 1 ui van Single Cell DNase1 tot 9 pl Single Cell Lysis Solution.
  2. Plaats de 10 ul gemengde oplossing in elke well van 96-well PCR plaat.

2. Detaching hESCs voor FACS Zuivering

  1. Maak OCT4 :: EGFP ES cellijn van 60 mm schaal met 1 ml Accutase gedurende 20 min bij 37 ° C, die werden geneutraliseerd met menselijke ES media.
  2. Bereid celpopulatie in 1 ml FACS buffer en stel de cel 1 x 10 6 cellen / ml.
  3. Passeren de cel monster door een 35 um cel zeef cap buis.
  4. Bewaar de buis in ijs voordat celsorteren.

3. Lysis van FACS-gezuiverde cel in elke well van de 96-well plaat

  1. Sorteer de steekproef voor EGFP positieve cellen op een cel sorter met een getrainde operator. Zet de cel in Single Cell Lysis/DNase1 oplossing in 96-well PCR-plaat. Indien nodig, de 96-wells plaat met voorbeeld worden opgeslagen in een -80 ° C diepvriezer minder dan een maand.
  2. Incubeer de monsters 5 minuten bij kamertemperatuur cellysis.
  3. Voeg 1 ul van Stop Oplossing voor lysis reactie te stoppen.
  4. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur.

4. Reverse Transcriptie

  1. In elk een 0,5 pi aliquot van 20 uM SMA-T15, SMA-A.
  2. Voeg 4 ui 5X buffer, 2 pl DTT, 1 ui reverse transcriptase en 1 pi dNTP aan elk putje.
  3. Voeren reverse transcriptie in een PCR-apparaat.
    1. Stel de thermische programma bij 42 ° C x 90 min. en inactiveren reverse transcriptase bij 85 ° C x 5 minuten.

5. Amplification

  1. Voeg 4 ul van ExoSAP-IT reagens aan elk reverse getranscribeerd monster.
    1. Incubeer monsters bij 37 ° C gedurende 15 min en 80 ° C gedurende 15 minuten om de ExoSAP-IT reagens inactiveren.
  2. Bereid PCR-mix wet SMA-p2 (2 nM)
  3. Voeg 10 ul PCR reactiemengsel aan elk reverse getranscribeerd monster.
  4. Voer de versterking, bestaande uit 20 cycli van denaturatie (94 ° C gedurende 30 seconden), annealing (57 ° C gedurende 30 seconden) en verlenging (68 ° C gedurende 10 min).

6. QRT-PCR Prestatie

  1. Voeg 10 ul van 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ui cDNA geamplificeerd, 2 nM primers en 7 ui water aan elke well.
    1. Stel het programma gevolgd door 95 ° C gedurende 3 seconden, 60 ° C gedurende 30 seconden x 40 cycli.
  2. Voer in tweevoud voor technische fouten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efficiënte en robuuste cel RNA-amplificatie

Om de transcriptie variatie tussen hESCs minimaliseren, gebruikten we OCT4 :: EGFP hESC kloon voor FACS zuivering. Na het sorteren OCT4 :: EGFP-positieve cellen in een 96-well plaat, wordt elke cel gelyseerd in lysis buffer en omgezet poly (A) + RNA van volledige lengte cDNA met SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primer en verankering met SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) door SMART template regelende techniek. De over...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enkele cel gen profilering kan een belangrijk instrument om de functionaliteit van een enkele cel of een gehele populatie te voorspellen zijn. Vanwege technische beperking, heeft hele gen profielanalyse beperkt tot gemiddelden bevolking. Variaties in genexpressiepatronen en niveaus tussen individuele cellen en subpopulaties zijn voorgesteld om onjuiste interpretatie veroorzaken. Zulke uiteenlopende cellulaire aspecten zijn te vinden in hESCs en hun heterogeniteit veroorzaakt subtiel verschillende mogelijkheden voor het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen de leden van de Lee lab bedanken voor waardevolle discussies over het manuscript. Werk in de Lee lab werd ondersteund door subsidies van Robertson Investigator Award van New York Stem Cell Foundation en uit Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well PCR PlateUSA scientific1402-8900
Ambion Cell Lysis KitLife Technologies4458235
SMARTScribe Reverse TranscriptaseClonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
Platinum Taq DNA polymerase High FidelityInvitrogen11304
10 mM dNTP Mix, PCR GradeInvitrogen18427
SYBR Universal 2X Master MixKapa biosystemKR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
FACS buffer45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter gesteriliseerd
35 μm cell strainer cap tubesBD Biosciences352235

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  2. Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
  3. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
  4. Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
  5. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
  6. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
  7. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
  8. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
  9. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  10. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  11. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
  12. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
  14. Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
  15. Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single cel qRT PCRfluorescentie geactiveerde cel sorteringreverse transcriptiepolymerasekettingreactieOCT4 EGFP positieve cellengenexpressieprofileringpopulatieheterogeniteitstamcelmarkers

Gerelateerde artikelen