Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

Summary

Enkele cel genexpressie test is noodzakelijk om inzicht stamcel heterogeniteiten.

Abstract

Heterogeniteit van stamcellen bevolking belemmert gedetailleerd inzicht in stamcel biologie, zoals hun differentiatie neiging tot verschillende geslachten. Een enkele cel transcriptome test kan een nieuwe benadering voor het ontleden van individuele variatie zijn. We hebben de enkele cel qRT-PCR-methode ontwikkeld, en bevestigde dat deze methode werkt goed in verschillende genexpressie profielen. In enkele cel niveau, elke menselijke embryonale stamcellen, gesorteerd per OCT4 :: EGFP positieve cellen, heeft een hoge expressie in OCT4, maar een ander niveau van NANOG expressie. Onze enkele cel genexpressie test moet nuttig zijn om de bevolking heterogeniteit ondervragen zijn.

Introduction

De meeste hogere eukaryote populaties heterogeen derhalve de analyse van gepoolde populatie, is het vaak moeilijk te interpreteren cellulaire functies. Individuele cellen binnen een populatie kan subtiel verschillend zijn, en deze verschillen kunnen belangrijke gevolgen hebben voor het pand en de functie van de gehele bevolking ^{1, 2.} Vooral menselijke embryonale stamcellen (hESCs) bekend heterogene, die verschillende niveaus van pluripotentie en diverse mogelijkheden veroorzaakt geslacht specificatie fijn specifieke wijze ^{3, 4} zijn. Zo kunnen verschillende celoppervlak antigenen worden gebruikt om gedifferentieerde pluripotente stamcellen catego....

Protocol

1. Bereiding van een 96-well plaat

1. Meng 1 ui van Single Cell DNase1 tot 9 pl Single Cell Lysis Solution.
2. Plaats de 10 ul gemengde oplossing in elke well van 96-well PCR plaat.

2. Detaching hESCs voor FACS Zuivering

1. Maak OCT4 :: EGFP ES cellijn van 60 mm schaal met 1 ml Accutase gedurende 20 min bij 37 ° C, die werden geneutraliseerd met menselijke ES media.
2. Bereid celpopulatie in 1 ml FACS buffer en stel de cel 1 x 10 ⁶ cellen / ml.
3. Passeren de cel monster door een 35 um cel zeef cap buis.
4. Bewaar de buis in ijs voordat celsorteren.

Results

Efficiënte en robuuste cel RNA-amplificatie

Om de transcriptie variatie tussen hESCs minimaliseren, gebruikten we OCT4 :: EGFP hESC kloon voor FACS zuivering. Na het sorteren OCT4 :: EGFP-positieve cellen in een 96-well plaat, wordt elke cel gelyseerd in lysis buffer en omgezet poly (A) + RNA van volledige lengte cDNA met SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primer en verankering met SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) door SMART template regelende techniek. De over.......

Discussion

Enkele cel gen profilering kan een belangrijk instrument om de functionaliteit van een enkele cel of een gehele populatie te voorspellen zijn. Vanwege technische beperking, heeft hele gen profielanalyse beperkt tot gemiddelden bevolking. Variaties in genexpressiepatronen en niveaus tussen individuele cellen en subpopulaties zijn voorgesteld om onjuiste interpretatie veroorzaken. Zulke uiteenlopende cellulaire aspecten zijn te vinden in hESCs en hun heterogeniteit veroorzaakt subtiel verschillende mogelijkheden voor het .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well PCR Plate	USA scientific	1402-8900
Ambion Cell Lysis Kit	Life Technologies	4458235
SMARTScribe Reverse Transcriptase	Clonetech	639536
ExoSAP-IT	USB	78200
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity	Invitrogen	11304
10 mM dNTP Mix, PCR Grade	Invitrogen	18427
SYBR Universal 2X Master Mix	Kapa biosystem	KR0389
Accutase	Innovative Cell Tech	S-1100-1
FACS buffer			45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized
35 μm cell strainer cap tubes	BD Biosciences	352235