Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen In Vivo

Samenvatting

Vascularisatie is de sleutel tot een succesvolle aanpak in de tissue engineering. Daarom zijn betrouwbare technologieën die voor de ontwikkeling van vasculaire netwerken in weefsel-constructen evalueren. Hier presenteren we een eenvoudige en kosteneffectieve manier te visualiseren en kwantificeren vascularisatie in vivo.

Samenvatting

Onvoldoende vascularisatie wordt beschouwd als een van de belangrijkste factoren die het klinische succes van weefselengineering constructen zijn. Om nieuwe strategieën die gericht zijn op het verbeteren van de vascularisatie te evalueren, zijn betrouwbare methoden nodig om de in-groei van nieuwe bloedvaten in bio-kunstmatige steigers zichtbaar maken en kwantificeren van de resultaten. In de afgelopen paar jaar, heeft onze groep een volledige huid defect model dat de directe visualisatie van de bloedvaten zorgt door transilluminatie en biedt de mogelijkheid tot kwantificering via digitale segmentatie geïntroduceerd. In dit model, een chirurgisch creëert volle huidafwijkingen in de rug van muizen en vervangt ze door het geteste materiaal. Moleculen of cellen van belang kan ook in dergelijke materialen worden opgenomen om de mogelijke gevolgen te bestuderen. Na een observatie tijd van de eigen keuze, worden materialen geëxplanteerd voor evaluatie. Bilaterale wonden bieden de mogelijkheid van het maken van interne vergelijkingen thop het minimaliseren artefacten onder zowel particulieren als van het verminderen van het aantal dieren dat nodig is voor het onderzoek. In vergelijking met andere benaderingen, biedt onze methode een eenvoudige, betrouwbare en kosteneffectieve analyse. We hebben dit model uitgevoerd als een routine instrument om hoge-resolutie screening uitvoeren bij het testen vascularisatie van verschillende biomaterialen en bio-activatie benaderingen.

Inleiding

In de afgelopen decennia is tissue engineering opent een nieuwe therapeutische optie om weefsel gebreken te vervangen door het lichaam de eigen cellen ^1. Om het fysiologische proces van weefselregeneratie ondersteunen, steigers ontworpen als een biologisch afbreekbare structuur, die een scenario waar de cellen van het wondbed kan groeien en terugzetten van het defect ^2,3 geeft.

Onvoldoende vascularisatie wordt beschouwd als het belangrijkste obstakel, dat de klinische doorbraak van bioartificiële steigers ⁴ tegenhoudt zijn. Met de ingroei van cellen, de vraag naar voedingsstoffen en zuurstof toeneemt en vascularisatie van het materiaal essentieel. Onvoldoende of vertraagde vascularisatie kan dus leiden tot centrale necrose van weefsel vervaardigde producten ^5. Bovendien bloedvaten voorzien immuuncompetente cellen en verwijder de metabolische residuen in de regenererende gebied. Hoge infectiedruk en lage regeneratie zijn alleeneen aantal van de gevolgen van onvoldoende doorbloeding waargenomen in tissue engineering, die gericht worden afgewend door het verhogen van de doorbloeding van de steigers ^6,7.

Verschillende strategieën die gericht zijn op het verbeteren van vascularisatie aandacht voor de belangrijke rol van het biomateriaal zelf en de microstructuur van het schavot. Er zijn intensieve onderzoeksinspanningen om nieuwe benaderingen te ontwikkelen in het verschuiven van het genezingsproces van de reparatie aan regeneratie, waardoor (re) genereren van een weefsel met het dichtst fysiologische eigenschappen om de een te restaureren ^8,9. Biomaterialen die werden onderzocht en geëvalueerd met betrekking tot hun regeneratief potentieel inclusief collageen, fibrine, chitosan en alginaat ^10,11. Deze biomaterialen kunnen worden gebruikt en gecombineerd als een ruggengraat voor de bouw van nieuwe steigers met behulp van verschillende strategieën, zoals weefsel decellularisatie, zelf-assemblage, rapid prototyping en electospinning ^12. Om ENHkomstig het lichaam de eigen regeneratieve capaciteit, kunnen de steigers worden bioactivated. De opname van recombinant angiogene groeifactoren ¹³ of gen vectoren die coderen voor factoren ¹⁴ heeft aangetoond dat vascularisatie van de steiger te verbeteren. Het gebruik van stamcellen is algemeen blijkt een veelbelovende strategie om vascularisatie, waar mesenchymale stromale cellen en endotheliale progenitorcellen de meeste aandacht hebben gekregen ^15,16 verbeteren. Andere benaderingen proberen constructen die geprefabriceerde schipverkeer vóór transplantatie ¹⁷ bevatten bouwen. Ondanks intensieve inspanningen steiger ontwerp en de bio-activatie heeft geen strategie verbeterd vascularisatie in een klinisch significant niveau, met uitzondering van dermale vervanging in massieve brandwonden, wordt de vertaling van bioengineered materialen in de klinische routine enige plaats aarzelend ¹⁸ .

Een van de redenen waarom de vascularisatiekunstmatige weefselconstructen nog een onopgelost probleem, is het moeilijk om het succes van nieuwe technologieën in vivo mogelijkheden te evalueren. Hoewel in vitro experimenten belangrijke inzichten van de vascularisatie potentieel van steigers kunnen bepalen, worden gepaste diermodellen moeten essentiële parameters bestuderen zoals de biocompatibiliteit van het materiaal, de veiligheid en werkzaamheid van de behandeling en van bijzonder belang, de vascularisatie van het weefsel construeren. Daarom betrouwbare visualiseren en kwantificeren netwerken bloedvat in vivo essentieel.

In deze studie presenteren we een eenvoudige en betrouwbare methode die de visualisatie en kwantificering van het vasculaire netwerk binnen geëxplanteerde scaffolds toelaat. Deze methode is gebaseerd op tissue transillumination en digitale segmentatie. Aangezien deze werkwijze is niet-invasief, laat verdere moleculaire en histologische analyses van het doelmateriaal.

Protocol

1 Voorbereiding van de steigers

1. Genereer monsters van de steigers door het gebruik van 12 mm biopsie stoten.
2. Om bioactieve moleculen of cellen te introduceren in het schavot, tap de steigers door ze zachtjes knijpen met een steriel gaasje. Hydrateren vervolgens de steigers door toevoeging 160 pl van een oplossing die het biologisch actieve moleculen of cellen plaats. Dubbele controle van het succes van bioactivatie met cellen door metabole testen zoals MTT Testen.
3. Indien nodig vast of de verbindingen te testen cellen in de scaffold door afleveren, bijvoorbeeld in een fibrine-trombine oplossing of een hydrogel, wederom door rehydratie zoals beschreven in stap 1.2.
   OPMERKING: Deze stap kan van pas komen wanneer verbindingen of cellen niet mechanisch hechten aan het materiaal. Men kan ook de afgifte dynamiek van de verbindingen te controleren ..
4. Bereid de titanized mazen, die onder elke steiger in elk experiment en controle groep zal worden geplaatst, door cutting out ronde gevormde stukken, ongeveer 14 mm in diameter.
   OPMERKING: De titanized netwerk werkt als een fysieke grens vereist om de geregenereerde weefsel uit het wondbed begrenzen.

2 Dieren

1. Voorafgaand aan de uitvoering van het gepresenteerde model, raadpleeg de bijbehorende dieren bescherming wetten en het verkrijgen van toestemming van de lokale autoriteiten. In dit werk, werden alle experimenten uitgevoerd met muizen, volgens de huidige Duitse dierenwelzijn te handelen en door het District regering van Opper-Beieren (Regierung von Oberbayern) goedgekeurd.
2. Kiezen voor het dier en de stam voorzichtig. Hoewel het model is vastgesteld voor muizen, kan deze worden vertaald naar andere gemeenschappelijke dieren, zoals ratten, konijnen en varkens.
3. In het geval dat u werkt met pelsdieren, scheren de rug van de dieren vóór de implantatie van de steigers.
   OPMERKING: Dit werk maakt gebruik van muizen van 6 tot 8 weken oud met een lichaamsgewicht tussen 20 g en 25 g echter verschillende leeftijden en body gewichten kunnen ook worden gebruikt.

3 Anesthesie

1. Voeren de operatie onder steriele omstandigheden. Om de normale lichaamstemperatuur van het dier te houden, gebruik dan een warming mat.
2. Vóór anesthesie inhalatief krijgen de dieren buprenorfine in een dosis van 0,05-0,1 mg / kg lichaamsgewicht, subcutaan om 8 uur.
3. Plaats het dier onder inhalatieve anesthesie (isofluraan) of een gelijkwaardige standaard procedures toe te passen. Bevestig anesthesie hetzij door knijpen tenen van het dier of door een huid knijpen.
4. Om exsiccose voorkomen, injecteer 0,5 ml fysiologische zoutoplossing subcutaan aan het begin van de operatie.

4 Excisie van de Huid

1. Plaats het dier in een liggende positie en markeer de middellijn van de muis is terug met een fijne punt permanente pen (figuur 1A).
2. Definieer de excisie gebied. Plaats de gebreken in de in Figu gebiedre 1C. Merk op dat als de gebreken te caudaal geplaatst, dieren zijn meer vatbaar voor de verbanden en de steigers te verwijderen.
3. Maak ronde bilaterale defecten met behulp van een 10 mm biopsie punch (Figuur 1B). De stempel moet zorgvuldig worden gedwongen tegen de huid en mogen niet worden gebruikt om volledig snijden door de huid, maar de excisie gebied (Figuren 1C en 1E) bakenen.
4. Til uit de gemarkeerde huid met een pincet en de incisie langs de gemarkeerde cirkel met behulp van fijne chirurgische schaar (Figuur 1F). In het geval van bloeden, zorgvuldig te comprimeren met een steriel gaasje. Een stap-voor-stap beschrijving van de excisie wordt getoond in figuur 1.
   OPMERKING: Het defect is gemaakt met een kleinere punch dan de ene voor het genereren van de steigers, om de uitbreiding van het gebrek te compenseren als gevolg van de elasticiteit van de huid.

5 Steiger Implantatie

1. Om ruimte te maken voor de titaseerde mesh, breiden de scheiding van de huid en het onderliggende weefsel bij de wond grenzen voor 2-4 mm (Figuur 2A).
2. Plaats de titanized maas in het defect direct aan het wondbed en onder de wondranden (Figuren 2A en B).
3. Plaats steigers direct boven het gaas.
4. Hecht de steigers aan de aangrenzende wondranden met 4 tot 6 enkele knopen, waarbij de randen iets meer dan de steiger (figuur 2C).
   OPMERKING: Vermijd het gebruik van biologisch afbreekbare hechtingen.
5. Hechtdraad een transparant wondverband boven de gebreken naar het schavot te beschermen terwijl ze de controle van de wond (figuur 2D).

6 postoperatieve zorg

1. Houd een muis per kooi om de wederzijdse manipulatie van de dressing en de steigers af te wenden.
2. Evalueer de algemene toestand van de dieren dagelijks door het observeren motorische activiteit, lichaamsgewicht, tekenen van pijn, tolerantienaar de kleedkamer en zelfverminking. Ook toezien op de wond gebied voor bloeden, lokale en systemische tekenen van infectie en de positie van de dressing.
3. Om de pijn van het dier te beperken, injecteren buprenorfine per dag bij een dosering van 0,05-0,1 mg / kg lichaamsgewicht of vergelijkbare analgetica.
4. Als de muis verwijdert of beschadigt het wondverband, vervangen of sluit hem onder narcose.

7 Euthanasie en Explantatie van de Steiger

1. Op gewenste tijdstippen, offeren de dieren bij overdosis van pentobarbital (150 mg / kg).
2. Markeert de plaats van huidexcisie met een permanente marker die moet de steigers en zoveel van de muis rugvel mogelijk (figuur 3A).
3. Incise de huid langs de gemarkeerde lijnen met een schaar of een scalpel. Maak de gehele huid, inclusief de steigers en de titanized gaas, van het onderliggende weefsel door stomp voorbereiding (Fifiguur 3B).
4. Plaats de geëxplanteerd weefsel uitgestrekt op een petrischaal (Figuur 3C en D)

8 visualisatie en kwantificatie van de Vasculaire Netwerk

1. Transillumination:
   1. Het opzetten van een transillumination apparaat, door het monteren van een petrischaal boven een sterke bron van wit licht (100 Watt standaard gloeilamp).
   2. Fix een digitale camera boven de transilluminator om digitale foto's te verkrijgen.
   3. Plaats de monsters ondersteboven op de petrischaal via transilluminatie-apparaat.
   4. Neem foto's van de complete steigers in de macro-modus, alsmede van even grote gebieden van de normale huid. Bewaar de afbeeldingen in een TIFF-formaat voor verdere digitale analyse.
   5. Sla het weefsel voor verdere biochemische of histologische analyse.
2. Digitale segmentatie en kwantificering:
   1. Download en installeer de VesSeg-Tool-software, die kan worden verkregen free van lading op: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
   2. Open de foto met de VesSeg-Tool.
   3. Selecteer het gebied van de afbeelding onder de steiger voor digitale analyse (Afbeelding → Select).
   4. Om het contrast van de schepen te vergroten Gebruik de optie 'hysteresis drempeling "(Beeld → Vessel enhancement filter → hysteresis drempeling → Top-Hat transformatie → Bereken verbetering vat).
   5. Ga verder met de segmentatie van de kaart vaartuig (Afbeelding → enhancement Vessel filter → hysteresis drempeling → Drempel grenzen). Selecteer de eerste drempel ("Vessel dekking"), dus elke pixel, dat is zelfs op afstand schip-achtige, zal als schip worden geëtiketteerd. Selecteer de tweede drempel ("Achtergrond dekking"), zodat alleen de pixels die bijzonder schip-achtige zal als schepen worden geëtiketteerd.
   6. Controleer de automatische segmentatie voorstel handmatig niet-ingenomen vaartuigen commentaar en gemeenschappelijke vals-positieve structuren die gewoonlijk lang en dun, verblijf-achtige structuren zoals haren of hechtingen te elimineren.
   7. Bereken de lengte van de schepen en het totale gebied dat door schepen (Afbeelding → Afbeelding statistieken → Binary statistieken).
      OPMERKING: Bij de berekening van het schip-lengten zijn vaartuigen in de uiteindelijke kaart vaartuig verdund lijnen met een breedte van een pixel ^20.
3. Analyseer de natieve huid onder dezelfde parameters als de steigers, toewijzen van een waarde van 100% voor de natieve weefsel en verbinden de steiger die waarde. Bijvoorbeeld, indien het aantal witte pixels is 60% in het normale weefsel en 30% in het skelet, zou 50% vascularisatie van de steiger te vertegenwoordigen. Opmerking: De witte vaartuigen dekking is toegewezen aan de oppervlakte van een vierkant rondom het schavot. Pas het aantal witte pixels dekking consiDering dat het gebied van de cirkel is beduidend kleiner (π x ^R2) dan het vierkant (4 x ^R2).

Resultaten

Een betrouwbare bilaterale full skin defect kan worden gemaakt in de muizen (figuur 1) waarbij de huid kan worden vervangen door een biomateriaal bestudeerd (figuur 2). Hier worden zonder complicaties tijdens of na de operatieve procedure, noch macroscopische verschijnselen van infectie of vreemd lichaam reactie. In zeldzame gevallen wordt een steiger verloren wanneer een muis verwijdert deze. Wondcontractie werd niet waargenomen (figuur 3). Tissue transilluminatie toeg...

Discussie

Er moet succesvolle benaderingen kunnen verbeteren doorbloeding in tissue engineered constructen, die de ontwikkeling van nieuwe betrouwbare methoden vereist de vascularisatie processen binnen de biomaterialen bestuderen. Algemene methoden voor het maken steiger vascularisatie ex vivo toegankelijk omvatten het gebruik van microscopie, waarbij een hoge-resolutie tool biedt. In de meeste gevallen echter is deze werkwijze beperkt tot de analyse van kleine weefselgebieden en vaak kostbaar en tijdrovend. Bovendien o...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Duitsland	698G	Ethilon polyamid-6 precisiepunt-omgekeerd snijdende hechtdraad
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, VS	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, VS	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Duitsland	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Duitsland	13622	Steriele gaas (10 cm x 10 cm)
Dubbellaags collageen-gebaseerde scaffold (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, VS	88101
Isofluraan, vloeibaar gas voor inhalatieanesthesie	Baxter, Unterschleissheim, Duitsland	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude muizen, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Duitsland	Strain code 088	Athymische nude muizen, 6 tot 8 weken oud en met een lichaamsgewicht tussen de 20 en 25 g
Buprenorfine (0,3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, München, Duitsland
Titanium mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Keulen, Duitsland	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Duitsland	B1332020110614	Fibrine-trombine oplossing
Transparante kleefpleister (30,5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10