Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging

Samenvatting

Interacties tussen eiwitten zijn fundamenteel voor alle cellulaire processen. Met Bioluminescentie Resonance Energy Transfer, kan de interactie tussen twee eiwitten worden gecontroleerd in levende cellen en in real time. Bovendien kunnen de effecten van potentieel pathogene mutaties worden beoordeeld.

Samenvatting

Bepalingen op basis van bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET) een gevoelige en betrouwbare manier om eiwit-eiwit interacties in levende cellen te volgen. BRET is de niet-stralingsoverdracht van energie uit een "donor" luciferase-enzym een ​​"acceptor" fluorescent proteïne. In de meest voorkomende configuratie van deze test, de donor is Renilla reniformis luciferase en de acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Omdat het rendement van energie-overdracht is sterk verte-afhankelijke, observatie van de BRET fenomeen vereist dat de donor en acceptor worden in de nabijheid. Om te testen op een interactie tussen twee eiwitten van belang in gekweekte zoogdiercellen, wordt een proteïne uitgedrukt als een fusie met luciferase en de tweede als een fusie met YFP. Een interactie tussen de twee eiwitten van belang kan de donor en acceptor voldoende nauw energieoverdracht optreden brengen. Vergeleken met andere technieken voor het onderzoeken van eiwit-eiwit inwisselwerkingen, de BRET test is gevoelig, vergt weinig hands-on tijd en weinig reagentia, en is in staat om interacties die zwak, van voorbijgaande aard, of afhankelijk van de biochemische milieu binnen een levende cellen zijn te detecteren. Het is daarom een ​​ideale benadering voor het bevestigen mogelijke interacties voorgesteld door gist twee-hybride of massaspectrometrie proteomics onderzoek, en bovendien is het zeer geschikt voor kartering interactie gebieden, waarbij het effect van post-translationele modificaties van eiwit-eiwit interacties en evaluatie van het effect van mutaties die in de patiënt DNA.

Inleiding

Zowel klassieke koppeling en next-generation sequencing analyses van menselijke aandoeningen worden het openbaren van de klinische relevantie van eiwitten die betrokken zijn in een reeks van biologische pathways. Het is vaak het geval dat vóór de identificatie in deze studies, is er weinig of geen onderzoek naar de biologische functie van deze eiwitten zijn. Een vruchtbare weg beginnen de biologische functie van een eiwit van belang te bepalen welke andere eiwitten in de fysiologische omgeving interageert met. Karakteriseren van de moleculaire netwerken op deze manier geeft inzicht in de biologische processen die ten grondslag liggen van het menselijk fenotype.

De meest gebruikte grootschalige screening benaderingen voor het identificeren van kandidaat interactie partners voor eiwitten van belang zijn gist twee-hybride screening ¹ en massa-spectrometrie gebaseerde proteomics ^2. Deze methoden kunnen zeer succesvol zijn in het suggereren van potentiële interagerende eiwitten, maar are vals-positieve resultaten. Daarom is de bevestiging van een interactie die door gist twee-hybride of massaspectrometrie screening vereist validatie van de interactie met behulp van een tweede techniek. Typisch een co-immunoprecipitatie of pull-down test wordt gebruikt voor dit doel ^3. Een nadeel van dergelijke technieken voor validatie is de vereiste voor cellysis, die de intracellulaire omstandigheden die essentieel voor het behoud bepaald eiwit interacties kunnen worden vernietigd. Een tweede nadeel is dat zwak of voorbijgaande eiwit interacties tijdens wasstappen kan worden verstoord. Bovendien zijn deze testen vereisen aanzienlijke praktische tijd beperkt het aantal monsters dat gelijktijdig kan worden verwerkt, en vaak tijdrovende optimalisering van reagentia en protocollen.

Om enkele van de problemen in verband met co-immunoprecipitatie experimenten te overwinnen, zijn er verschillende tests ontwikkeld op basis van fluorescentie-en bioluminescent eiwitten die gebruikt kunnen worden in levende cellen. De eerste testen waren gebaseerd op fluorescentie (of Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), de niet-radiatieve energieoverdracht tussen twee fluorescente eiwitten met overlappende emissie-en excitatiespectra ^4. De efficiëntie van de energieoverdracht is sterk afstand afhankelijk, dus observatie van de FRET fenomeen vereist dat de donor en acceptor fluoroforen worden in de nabijheid. Om te testen op een interactie tussen twee eiwitten van belang, wordt een proteïne uitgedrukt als een fusie met het donor-fluorofoor (gewoonlijk cyaan fluorescerend eiwit, GVB) en de tweede als een fusie met de acceptor fluorofoor (gewoonlijk geel fluorescerend eiwit, YFP). Een interactie tussen de twee eiwitten van belang kan de donor en acceptor fluoroforen voldoende nauw energieoverdracht optreden brengen, wat zal resulteren in een meetbare toename van de lichtemissie door het YFP acceptor ten opzichte van de GVB donor. FRET is succesvol detecteren van eiwit-eiwit interacties in levende cellen ⁴ zijn. Het belangrijkste nadeel van het gebruik van FRET voor het detecteren van eiwit-eiwitinteracties is de vereiste externe verlichting voor excitatie van de donor fluorofoor. Buitenverlichting resulteert in hoge achtergrond in de emissie-signaal, ongewenste excitatie van de acceptor, en fotobleking van donor en acceptor fluoroforen. Deze effecten verminderen de gevoeligheid van de assay voor het detecteren van eiwit-eiwitinteracties.

Een modificatie van de FRET assay die het probleem van hoge achtergrond overwint externe belichting is de bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET) assay ^5,6. In het BRET systeem de donor fluorofoor wordt vervangen door een luciferase-enzym. Dus de energie voor de excitatie van de acceptor fluorofoor wordt gegenereerd in het systeem door de oxidatie van een luciferase substraat, waardoor Buitenverlichting overbodig. In dealgemene configuratie van deze test, de donor Renilla reniformis luciferase en acceptor YFP (voor een bespreking van alternatieve donor en acceptor eiwitten zien Pfleger et al.. ^5). Dienovereenkomstig, in dit systeem, een eiwit van belang gefuseerd aan luciferase en een potentieel interactie eiwit YFP, of vice versa. De BRET test vereist de toevoeging van coelenterazine als een substraat voor luciferase. Omdat coelenterazine is celpermeable, is het mogelijk BRET assays in levende cellen. Echter, inheemse coelenterazine instabiel in waterige oplossing en de enzym-onafhankelijke uitsplitsing van coelenterazine zowel vermindert de concentratie van substraat beschikbaar voor de test genereert en autoluminescence, die de gevoeligheid van metingen van luciferaseactiviteit vermindert. Het gebruik van BRET in levende cellen is vergemakkelijkt door de ontwikkeling van beschermde coelenterazines, die in waterige oplossing stabiel, maar worden gesplitst door cytosolische esterases na diffusie door het celmembraan actief coelenterazine in de cel ⁷ genereren.

Na toevoeging van substraat aan cellen die luciferase-en YFP-fusie-eiwitten, is energieoverdracht gevolg van eiwit-eiwit interacties gekwantificeerd door monitoring emissie van luciferase en YFP. Omdat eiwit interacties direct kan worden gecontroleerd in levende cellen in multi-well platen, de BRET test is een eenvoudige, schaalbare methode voor het valideren van vermeende interacties die is kosten-en tijdbesparend.

Naast valideren vermeende interactors geïdentificeerd proteomische onderzoeksstudies, kan het BRET systeem ook worden gebruikt om testkandidaat interactors gevolg van eerdere biochemische en structurele studies van het eiwit van belang. Zodra de aanwezigheid van een eiwit-eiwit interactie is vastgesteld (hetzij via het BRET assay of andere technieken), de mogelijkheid van de BRET assay emp zijngelegeerd verder om de interactie te karakteriseren. Bijvoorbeeld kan het interagerende regio in kaart gebracht door het genereren afgeknotte versies van de eiwitten, en de betrokkenheid van specifieke resten in de interactie kan worden aangetoond door het creëren puntmutaties. Bovendien kan het modulerende effect van posttranslationele modificaties of kleine moleculen (bijvoorbeeld geneesmiddelen of liganden) van eiwit-eiwit interacties worden onderzocht ^8-10.

De BRET test heeft ook een groot potentieel voor het onderzoek naar mutaties geïdentificeerd in patiënten DNA. Wanneer op een rol voor een mutatie is vastgesteld, het bestuderen van het effect van de mutatie van eiwit-eiwit interacties met BRET kan meer onthullen over de moleculaire etiologie van het fenotype ^11. Sinds de komst van de volgende generatie sequencing methodologieën, het steeds vaker meerdere potentieel schadelijke mutaties worden geïdentificeerd in een individu, in welk geval het duidelijk is welke rele zijnvant het fenotype ^12. In deze situatie kan de BRET test waardevol bij de evaluatie van de impact van de mutaties op de functie van eiwitten en daarmee hun relevantie voor de stoornis.

Protocol

1. Creatie van plasmiden

1. Subkloneren van het cDNA voor elk eiwit van belang in zowel de PLUC en pYFP vectoren, middels standaard moleculair biologische technieken (figuur 1). Voor gedetailleerde protocollen zie Green et al. ^13.
2. Sequence alle construeert om te verifiëren dat de eiwitten van belang zijn in frame met de Luc / YFP sequence zonder tussenliggende stopcodons.
3. Voer wens te bevestigen dat de fusie-eiwitten behouden biologische activiteit functionele bepalingen. In dit geval van de subcellulaire lokalisatie van YFP fusie-eiwitten werd vastgesteld door fluorescentie microscopie.
4. Maak expressieplasmiden passende Luc en YFP controle eiwitten door engineering van de relevante targeting signalen in de PLUC en pYFP expressie vectoren. In de hier gepresenteerde geval, het genereren van nucleaire-gerichte Luc en YFP constructen door het invoegen van een nucleair lokalisatie signaal in de PLUC en pYFP vectoren.
5. Makeneen positieve controle construct waarin Luc en YFP verweven is in een enkel polypeptide. In de hier gepresenteerde geval genereren van een positieve controle waarbij de YFP coderende sequentie in de vector is geïnsereerd PLUC.
6. Selecteer een neutrale vulstof plasmide worden gebruikt om de massa van DNA gelijk in transfectie mixen. Gebruik van een plasmide dat geen eukaryote promotor en derhalve transcriptioneel inactief zoogdiercellen, zoals een bacteriële kloneringsvector.

2. Voorbereiding van DNA Mixes

1. Schat de concentratie van de in sectie 1 gebaseerd op absorptie bij 260 nm beschreven plasmiden (1 absorptie eenheid overeenkomt met 50 ug / ml DNA). Bepaal de molecuulmassa van elk plasmide door het aantal basenparen vermenigvuldigen met 650 Da. Gebruik de concentratie en molecuulgewicht aan de molaire concentratie van elk plasmide preparaat te berekenen. Verdun het plasmide-DNA preparaten met een concentratie van 36 nM. Dit zullen de werkvoorradendat zal worden gebruikt om de DNA mixen voor transfectie bereiden.
2. Bereid een controle-DNA mengsel dat 1800 ng plasmide vulstof in een eindvolume van 20 pl water.
3. Bereid een controle-DNA mengsel dat 5 pl van de PLUC-controleconstruct. Voeg vulmiddel plasmide aan de totale DNA massa tot 1.800 ng brengen. Voeg water om het eindvolume tot 20 pi te brengen.
4. Bereid een controle-DNA mengsel dat 5 pl PLUC-controleconstruct en 5 pl pYFP-controleconstruct. Voeg vulmiddel plasmide aan de totale DNA massa tot 1.800 ng brengen. Voeg water om het eindvolume tot 20 pi te brengen.
5. Bereid een controle DNA mix met 5 pi van de positieve controle construct. Voeg vulmiddel plasmide aan de totale DNA massa tot 1.800 ng brengen. Voeg water om het eindvolume tot 20 pi te brengen.
6. Bereid de volgende DNA mixen testen homodimerisatie van een eiwit van belang, X. Voor elke DNA mengsel gecombineerd 5 ul van de desbetreffende PLUC bouwen en 5 ul van de pvFP bouwen. Voeg vulmiddel plasmide aan de totale DNA massa tot 1.800 ng brengen. Voeg water om het eindvolume tot 20 pi te brengen.
   A) PLUC-controle en pYFP-X
   B) PLUC-X en pYFP-controle
   C) PLUC-X en pYFP-X
7. Bereid de volgende DNA-mengsels te testen op interactie tussen twee eiwitten van belang, X en Y. Voor elke DNA mengsel gecombineerd 5 ul van de desbetreffende PLUC bouwen en 5 ul van de pYFP construeren. Voeg vulmiddel plasmide aan de totale DNA massa tot 1.800 ng brengen. Voeg water om het eindvolume tot 20 pi te brengen.
   A) PLUC-controle en pYFP-X
   B) PLUC-X en pYFP-controle
   C) PLUC-controle en pYFP-Y
   D) PLUC-Y en pYFP-controle
   E) PLUC-X en pYFP-Y
   F) PLUC-Y en pYFP-X

3. Transfectie

1. Oogst Subconfluente HEK293 cellen van een 75 ^cm2 kolf. Verdun 10% van de totale cellen in 13 ml kweekmedium. Breng 130 pi celsuspensie in elk putje van een witteduidelijke bodem 96-well weefselkweek plaat. Kweekcellen voor 24 uur.
2. Bereken het aantal putten worden getransfecteerd door het aantal DNA mixen vermenigvuldigen met 3. Breng serumvrij kweekmedium tot kamertemperatuur. Bereid een master mix met 6,3 ul van serum-vrij medium en 0,18 pi transfectiereagens per putje. Meng door vortexen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
3. Bereid transfectie mengsels door toevoeging van 2 pi DNA mix 20 gl serumvrij medium / transfectie reagens master mix. Niet vortex. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
4. Transfecteren drie putjes met elke transfectie mix afgifte 6,5 gl transfectiemengsel per putje. Kweek van de cellen nog eens 36-48 uur.

4. Meting van BRET Signal

1. Los levende cellen luciferase substraat bij 34 mg / ml in DMSO door vortexen.
2. Verdun gereconstitueerde levende cellen luciferasesubstraat op 1:1000 in substraat verdunning medium popnieuw verwarmd tot 37 ° C. Laat 50 pi substraat verdunning medium per well. Vortex te mengen. Een neerslag kan vormen, maar zal niet interfereren met de test.
3. Zuig het kweekmedium van de 96-well plaat. Pipetteer 50 ul verdund levende cellen luciferase substraat in elk putje. Kweekcellen voor ten minste 2 uur (tot 24 uur).
4. Verwijder het deksel van de 96-well plaat en incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de luminometer.
5. Meet emissie van Luc en YFP een goed tegelijk. Meet emissie van Luc met behulp van een filter langer dan 470 nm blokkeren golflengten. Meet emissie uit YFP met een 500-600 nm band-pass filter. Integreer emissie signalen over 10 sec.

5. Data Analysis

1. Gemiddeld de Luc emissie metingen van de 3 putjes die alleen het vulmiddel plasmide ontvangen. Trek deze waarde van alle andere Luc emissie metingen aan de-achtergrond afgetrokken Luc emissiewaarden produceren.
2. Gemiddeld de YFP emissie metingen van de 3 putjes die alleen het vulmiddel plasmide ontvangen. Trek deze waarde van alle andere YFP emissie metingen aan de-achtergrond afgetrokken YFP emissiewaarden produceren.
3. Voor elk putje, verdelen de-achtergrond afgetrokken YFP emissiewaarde door de-achtergrond afgetrokken Luc emissiewaarde de ongecorrigeerde BRET verhouding geven.
4. Gemiddeld ongecorrigeerde BRET verhoudingen van de drie putjes die waren getransfecteerd met alleen de PLUC controle plasmide. Trek deze waarde van alle andere ongecorrigeerde BRET verhoudingen aan de gecorrigeerde BRET verhoudingen geven.
5. Voor elk van de resterende sets van gecorrigeerde BRET verhoudingen gemiddelde waarden van de drie getransfecteerde putten BRET een uiteindelijke verhouding te verkrijgen.

Resultaten

Het principe van de BRET test wordt geïllustreerd in Figuur 2. De test opstelling gebruikt in de experimenten die hier voorgesteld wordt in Figuur 3. De detectie van een sterk BRET signaal uit cellen getransfecteerd met een luciferase-YFP fusieproteïne bevestigd dat energieoverdracht waarneembaar was in deze experimentele opstelling (figuur 4).

Ons onderzoek richt zich op de rol van het gezin foxp van transcriptionele repressors in ontwikkel...

Discussie

Het ontwerp van het fusie-eiwit expressie constructen is een cruciale stap in het opzetten van de BRET assay. In de hier gepresenteerde experimenten werden de eiwitten van belang gefuseerd aan de C-terminus van luciferase of YFP. Het is ook mogelijk en noodzakelijk zijn, eiwitten gefixeerd op de N-terminus van luciferase / YFP. Voor sommige eiwitten, fusies kunnen alleen worden bij de N-of C-terminus aanvaard Om verstoring van de eiwit structuur en functie te voorkomen. Verder is het voor transmembraan eiwitten, waarin ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Nanodrop 8000	Nanodrop		Elke spectofotometer die in staat is om absorptievermogens op 260 nm te lezen, is geschikt. Het bepalen van de moleculaire massa van het plasmide is cruciaal voor het berekenen van DNA-hoeveelheden die in transfectiemixen zullen worden gebruikt.
96-microwell platen, platte bodem, wit	Greiner Bio One	655098	Witte platen verminderen de overspraak tussen wells en maximaliseren de gevoeligheid van luminescentiedetectie. Wells met een doorzichtige bodem maken het mogelijk om de celdichtheid te controleren. Platen moeten geschikt zijn voor celcultuur. Indien een boven-lezende luminometer wordt gebruikt, moet het platendeksel worden verwijderd.
Infinite F200Pro plate reader met controlesoftware	TECAN		Gebruik de 'Blue 1' en 'Green 1' filters voor luminescentiemeting en de filtersets en dichoische spiegel voor GFP voor fluorescentiemeting. Elke boven-lezende plate reader met de mogelijkheid om dual-kleur luminescentie en fluorescentie te meten is geschikt.
pLuc, pYFP, positieve controleplasmide	N/A	N/A	Plasmiden zijn beschikbaar bij de auteurs op aanvraag.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Fillerplasmide voor het egaliseren van DNA-massa in transfectiemixen. Elke plasmide zonder eukaryotisch promotor zou geschikt zijn.
HEK293 cellen	ECACC	85120602	Andere cellijnen die met redelijke efficiëntie transfecteren kunnen geschikt zijn.
DMEM, hoge glucose, met fenol rood	Gibco	41966	Dit is het medium dat wordt gebruikt voor het kweken van HEK293 cellen. Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik. Indien een andere cellijn wordt gebruikt, vervang het hier beschreven groeimedium met cellijn specifiek medium.
DMEM, hoge glucose, geen fenol rood (substraat verdunningsmedium)	Gibco	21063	Dit is het substraat verdunningsmedium dat wordt gebruikt voor verdunning van het luciferase substraat (EnduRen) omdat het geen fenol rood bevat, wat de gevoeligheid van de test verlaagt. Bevat HEPES om de juiste pH tijdens luminescentiemetingen te handhaven terwijl de cellen buiten de CO2 incubator zijn. Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM wordt gebruikt voor verdunning van GeneJuice transfectiereagens. Andere serum-vrije media zouden ook geschikt zijn. Opwarmen tot kamertemperatuur voor gebruik.
Fetaal bovien serum	Gibco	10270	Voor suppletie van celcultuur media op een concentratie van 10% v/v.
GeneJuice transfectiereagens	Novagen	70967	Bij gebruik van een andere cellijn dan HEK293, kan het nodig zijn om de verhouding van GeneJuice transfectiereagens naar DNA in de transfectiemixen aan te passen. Andere transfectiereagentia kunnen worden gebruikt. Bij gebruik van een alternatief transfectiereagens kan het nodig zijn om de hoeveelheid DNA die in de transfectiemixen wordt gebruikt te optimaliseren op basis van de instructies van de fabrikant.
DMSO	Sigma	D2650	Gebruik steriele DMSO die geschikt is voor weefselkweek.
EnduRen levend-cel substraat	Promega	E6481	Reconstitueer EnduRen tot 34 mg/ml in DMSO. Bij verdunning van EnduRen in cultuurmedium kan zich een neerslag vormen. Dit zal de test niet storen. Bewaar gereconstitueerd EnduRen bij -20 °C, en vermijd meerdere vries-ontdood cycli. Zorg ervoor dat gereconstitueerd EnduRen volledig ontdooid is voordat het wordt verdund in cultuurmedium.