Isolatie van Kleine Noncoding RNA's uit humaan serum

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het extraheren van kleine RNA uit menselijk serum. We hebben deze methode om microRNA kanker serum te isoleren voor gebruik in DNA arrays en ook singleplex kwantitatieve PCR. Het protocol maakt gebruik van fenol en guanidiniumthiocyanaat reagentia met modificaties van hoge kwaliteit RNA opleveren.

Samenvatting

De analyse van RNA en de expressie ervan is een gemeenschappelijk kenmerk in veel laboratoria. Van belang is het ontstaan ​​van kleine RNAs, zoals microRNAs, die worden aangetroffen in zoogdiercellen. Deze kleine RNA's zijn krachtige gen regelgevers beheersen van vitale routes zoals groei, ontwikkeling en dood en veel belangstelling is gericht op hun expressie in lichaamsvloeistoffen. Dit komt door de ontregeling in menselijke ziekten zoals kanker en hun mogelijke toepassing als serumbiomarkers. Echter, de analyse van miRNA expressie in serum problematisch zijn. In de meeste gevallen is de hoeveelheid serum wordt beperkt en serum bevat geringe hoeveelheden totaal RNA, waarvan slechts kleine RNAs vormen 0,4-0,5% ^1. Dus de isolatie van voldoende hoeveelheden van kwaliteit RNA uit serum is een grote uitdaging voor onderzoekers vandaag. In dit technische document tonen we een werkwijze die op 400 gl menselijk serum gebruikt om voldoende RNA voor zowel DNA arrays of qPCR analyse. De eendvantages van deze werkwijze zijn de eenvoud en het vermogen om hoge kwaliteit RNA opbrengst. Het vereist geen speciale kolommen voor zuivering van kleine RNA's en maakt gebruik van algemene reagentia en hardware gevonden in gemeenschappelijke laboratoria. Onze werkwijze gebruikt een Phase Lock Gel fenol verontreiniging te elimineren terwijl tegelijkertijd de hoge kwaliteit waardoor RNA. We introduceren ook een extra stap om alle verontreinigingen verder te verwijderen tijdens de isolatie stap. Dit protocol is zeer effectief bij het isoleren van totaal RNA opbrengst tot 100 ng / ul uit serum, maar kan ook worden aangepast voor andere biologische weefsels.

Inleiding

In de afgelopen jaren is er een groeiende druk om nieuwe biomarkers te ontdekken voor de vroege opsporing van ziekten bij de mens. Veel aandacht is gericht op het gebruik van kleine RNA's zoals microRNA ² (miRNAs of miRs) als potentiële markers. Deze kleine RNAs worden aangetroffen in lichaamsvloeistoffen zoals serum en studies hebben aangetoond ze bestand tegen afbraak en stabiel zijn over een bereik van variërende omgevingsomstandigheden ^3. Gezien deze kenmerken, serum of circuleren miRNAs zijn de ideale biomarker ^{4, 5.} Momenteel zijn er twee belangrijke benaderingen voor het isoleren van kleine RNA uit biologische vloeistoffen. De eerste benadering maakt gebruik van kolommen gebaseerde technologie te binden en elueren de kleine RNAs ^6, terwijl de tweede benadering gebruikt de langdurige protocol met fenol en guanidine thiocyanaat reagentia ^7. We hebben een eenvoudig, effectief, kolomvrije protocol om kleine RNA te isoleren uit humaan serum ontwikkeld. Het geïsoleerde RNA is onmiddellijklijk bruikbaar in afgeleide toepassingen, met inbegrip van DNA-oligonucleotide arrays en RNA sequencing.

Dit protocol is ontwikkeld omdat we werden geconfronteerd met een aantal problemen bij het gebruik van fenol gebaseerde methoden voor het isoleren van RNA uit serum. De traditionele benadering Chomczynski wordt vaak gebruikt in de meeste laboratoria met verschillende reagentia verkrijgbaar bij de meeste commerciële verkopers. Maar gezien de grootschalige toepassing ervan, strenge richtlijnen zijn niet ontwikkeld om consequent produceren hoogwaardige RNA van lichaamsvloeistoffen, met name bloed of serum.

Veel voorkomende problemen in verband met het isoleren van RNA uit het serum onder lage opbrengsten RNA en besmetting met reagentia gebruikt tijdens de isolatie, met name fenol. Onze aanpak elimineert deze fenol verontreinigingen van hoge kwaliteit RNA voor downstream-analyse zoals kwantitatieve PCR (qPCR) en RNA sequencing. We hebben verder getest dit RNA op miRNA arrays.

Protocol

Opmerking: Human serum monsters van gezonde patiënten of patiënten met kanker werden verkregen met geïnformeerde toestemming op grond van goedgekeurde menselijke ethische protocollen van het Royal Prince Alfred Hospital van Sydney (Protocolnummer X10-0016 en HREC/10/RPAH/24) en de University of Technology, Sydney. Serummonsters werden verzameld van patiënten voor de operatie uit verschillende Sydney ziekenhuizen en in opslag bij -80 ° C.

1. Kleine RNA isolatie uit serum

Totaal RNA werd bereid uit humaan serum met een aangepaste versie van de Tri-Reagent RT LS protocol.

1. Ontdooi bevroren serum monster op ijs en vervolgens overbrengen 400 ul van de vers ontdooide serum in een gemerkte microcentrifugebuis.
2. Verdun het serum met 100 ul RNase-free _H2O en voeg proteinase K in een concentratie van 1 mg / ml.
3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten om eiwitvertering zodat door proteïnase K
4. To zorgen voor volledige oplossen, voeg 1,5 maal het volume van Tri-reagens RT LS en 100 ul van 4-broomanisol.
5. Kort keren de homogenaat, repetitieve pipetteren voor 5 sec en overbrengen naar een gelabelde 2 ml Heavy Phase Lock buis.
6. Draai het homogenaat bij 12.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
7. Giet voorzichtig minimaal 1 ml van de verkregen waterige oplossing in een nieuwe DNA LoBind buis. De organische en interfase moeten worden gevangen onder de witte gel van de Phase Lock buis.
8. Voeg 5,0 ui glycogeen (5 mg / ml) en 500 ul 100% isopropanol aan de waterige oplossing, te mengen door omkeren en incubeer O / N bij -20 ° C.
9. Na O / N incubatie gecentrifugeerd het monster gedurende 20 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C gecentrifugeerd.
10. Verwijder het supernatant helder en uitvoeren van een "flash" rotatie gedurende 2 min bij 16.000 xg bij 4 ° C gecentrifugeerd.
11. Verwijder voorzichtig de heldere solution rondom de pellet met behulp van een pipet.
12. Was de pellet met 1 ml 70% ethanol en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 minuten. Giet het wassen oplossing en herhaal wasstap.

2. RNA Resuspension in Solution

1. Resuspendeer de pellet in 10 ul RNase-free _H2O, zodat de tablet volledig is opgelost. Om het RNA volledig opgelost het monster tot 55 ° C gedurende 5 minuten worden verwarmd. Gedurende deze tijd, meng het monster met herhaalde pipetteren. Voor een hogere totale RNA opbrengst, bundelen twee RNA voorbereidingen van dezelfde patiënt.
2. Kwantificeren de geresuspendeerd RNA met behulp van een UV-Vis spectrofotometer en de RNA kwaliteit te beoordelen met behulp van een 2100 Bioanalyzer. Bewaar de samengevoegde RNA monsters bij -80 ° C voor gebruik in stroomafwaartse toepassingen.

Resultaten

Figuur 1 toont een typische UV / Vis-spectrum van RNA geïsoleerd uit serum. Uit dit profiel hebben we vastgesteld eiwit verontreinigingen bij 280 nm met fenol en organische verontreinigingen zowel 270 nm en 230 nm respectievelijk. Residu guanidinium thiocyanaat werd waargenomen bij 260 nm. Om verontreinigingen te verminderen, een aantal optimalisatie stappen gezet naar de standaard Tri-reagens RT-LS procedure. We voegden 5 mg / ml glycogeen om zowel de totale RNA opbrengst te verhogen en te verminderen ...

Discussie

De bevolking van microRNA vormt ongeveer 0,4-0,5% van het totaal RNA in het serum gevonden. Verder is er ook een hoog eiwitgehalte in humaan serum. RNA verbeteren en zowel eiwit en fenol verontreinigt hebben we de traditionele benadering Chomczynski ⁹ gemodificeerd met de toevoeging van verschillende stappen.

Totaal RNA werd geïsoleerd uit serum met behulp van de standaard Tri-reagens RT-LS (Molecular Research Centre) maar wanneer deze wordt uitgevoerd in ons laboratorium, deze me...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Center, USA	TR 118
RNase free H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491
Heavy Phase Lock tube	5PRIME	2302830	2 ml capaciteit
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1,5 ml capaciteit
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5 mg/ml
RNA grade isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Gekoelde centrifuge	John Morris
Nanodrop UV-Vis spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific, USA
RNA grade ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent, USA