Een muis model van menselijke endoscopische schedelbasis reconstructie is ontwikkeld dat een semi-permeabel interface tussen de hersenen en de neus met behulp van nasale mucosale enten creëert. Deze methode staat onderzoekers aflevering aan het centrale zenuwstelsel van hoogmoleculaire geneesmiddelen die anders zijn uitgesloten door de bloed-hersenbarrière bij systemisch toegediend bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Heterotope Mucosal engrafting Procedure voor Direct Drug Delivery naar de hersenen in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Levering van geneesmiddelen in de hersenen wordt belemmerd door de aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière (BBB) die de doorgang van polaire en hoog molecuulgewicht uit de bloedbaan en in het hersenweefsel beperkt. Sommige directe levering succes bij mensen is bereikt via de implantatie van transcraniële katheters; maar deze methode is zeer invasief en geassocieerd met talrijke complicaties. Een minder invasief alternatief zou zijn om de hersenen te doseren via een chirurgisch geïmplanteerde, semipermeabel membraan zoals neusslijmvlies die wordt gebruikt om schedelbasis gebreken te herstellen na endoscopische transnasal tumorverwijdering chirurgie in mensen. Geneesmiddeloverdracht hoewel dit membraan zou effectief omzeilen de BBB en diffuse direct in de hersenen en de cerebrospinale vloeistof. Geïnspireerd door deze aanpak, een chirurgische benadering in muizen ontwikkeld die een donor septum slijmvlies geënt op een extracraniale chirurgische BBB defect gebruikt. Dit model is aangetoond effectieflaten de passage van verbindingen met hoog molecuulgewicht in de hersenen. Aangezien vele kandidaat-geneesmiddelen zijn in staat die de BBB, dit model is waardevol voor preklinisch testen van nieuwe therapieën voor neurologische en psychiatrische ziekten.
Inleiding
De behandeling van neurologische en psychiatrische ziekten wordt ernstig belemmerd door de aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière (BBB) dat meer dan 95% van alle mogelijke farmaceutische middelen voorkomt bereiken het centrale zenuwstelsel 1-3. Bijvoorbeeld, gliale afgeleide neurotrofe factor (GDNF) is effectief gebleken bij de behandeling van de ziekte van Parkinson als rechtstreeks geïnjecteerd in de hersenen te zijn, maar werkt niet als systemisch afgegeven, omdat deze niet kan doordringen de BBB 4-6.
Talrijke benaderde zijn ontwikkeld om te proberen dit probleem te omzeilen. Verbetering van systemische toediening van neurotheraputics is aangetoond met geneesmiddel conjugaten met antilichamen selectief voor transporteiwitten op de hersenen capillaire endotheel; deze werkwijze echter niet aangetoond toepasbaar voor een breed scala van geneesmiddelen 7,8 te zijn. Daarnaast heeft osmotische opening van de BBB gebruikt kliniekally, maar deze methode lijdt aan systemische dosis van het geneesmiddel in tegenstelling tot een gerichte aflevering aan de hersenen interessegebied 9. Aanzienlijke inspanningen werden in het optimaliseren transnasal levering in de hoop direct gericht op de hersenen 10-12 zetten. Hoewel enig succes is geboekt, zijn overtuigende resultaten alleen verkregen voor geneesmiddelen met endogene receptoren, zoals insuline 13,14 bezitten. Verder is het mechanisme van transnasal levering is controversieel met aanwijzingen indirecte binnenkomst in de hersenen via olfactorische neuron opname of via de bloedbaan 11 geweest. Direct transcraniële productietijd middels implanteerbare katheters is bereikt, maar deze procedure is zeer invasief en geassocieerd met talrijke complicaties 15,16. Tot op heden is er geen algemeen minimaal invasieve methode hoog molecuulgewicht leveren in de hersenen.
Die hierin is een muizen chirurgische ingreepdat zorgt voor een halfdoorlaatbare interface met de hersenen. Dit wordt bereikt door enten een slijmvlies explantaat 17 via een chirurgische craniotomie defect in een muis. Met deze procedure is aangetoond dat oplosbare verbindingen tot 500 kDa in het centrale zenuwstelsel (direct in het hersenparenchym en in cerebrospinale vloeistof) zowel tijd molecuulgewicht afhankelijke wijze 18 worden geleverd. Deze methode van het omzeilen van de BBB is een model voor schedelbasis defect reparaties bij mensen die vascularized mucosale enten gebruikt om gaten in de schedel te herstellen volgende transnasal endoscopische chirurgie 19,20.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voorafgaand aan de operatie te zorgen dat alle procedures die moeten worden gedaan zijn goedgekeurd door IACUC en eventuele aanvullende ethische of juridische autoriteiten en gebruik humane behandeling van dieren praktijken. Dit omvat het gebruik van steriele operatie voorwaarden, verlamming van de muis met behulp van IACUC goedgekeurde methode, smeren muizen ogen met dierenarts zalf tijdens de operatie, en het verstrekken van postoperatieve zorg. Ga niet verder met een operatie als er een vraag of aspecten van de procedure zijn goedgekeurd. Alle procedures die hierin uitgevoerd werden goedgekeurd door de Boston University Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van de dieren en Chirurgische Supplies
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten die worden gebruikt tijdens de operatie.
- Zorg ervoor dat alle technieken die worden uitgevoerd zijn goedgekeurd door de regelgevende instanties dier.
2. Het oogsten van het mucosale Graft
- Koos voor een genetisch identieke muizen van dezelfde leeftijd alsde experimentele muis en euthanaseren het in een IACUC goedgekeurde methode (hier: isofluraan stikken gevolgd door cervicale dislocatie).
- Met behulp van chirurgische schaar, verwijder de huid rond de neus regio muis hoofd blootstellen van de schedel.
- Met een pneumatische zaaimachine, teken met drie lijnen waarvan er twee zijdelings flankeren de nasale gebied en een derde overeenkomstig de ogen die de twee lijnen loodrecht verbindt.
- Drill down ventraal om het neustussenschot scheiden van het omringende weefsel. Een breder pad schade aan het slijmvlies vermijden maar het zal ook moeilijker om het membraan te isoleren. Een smalle snit dichter bij middellijn wordt aanbevolen.
- Gebruik een schaar om het septum vrij gesneden van elk weefsel vastgehouden aan het en bewaar het op een steriele zoutoplossing. Op dit moment is het transplantaat kan worden schoongemaakt om alle aangesloten weefsel te verwijderen. De ideale situatie is om onbeschadigd mucosale membranen blootgesteld aan weerszijden van het kraakbeen septum. Een grachterschip leveren membraan voor twee muizen ontvangen het oppervlak van het membraan is voldoende om de craniotomie sites hebben. Aanbevolen wordt het implantaat zo snel mogelijk gebruikt waarbij de onderzoeker door naar stap 3 zodra het transplantaat wordt geïsoleerd.
3. Chirurgische Implantatie van Mucosal Graft
- Met behulp van standaard, aseptische muizen chirurgische procedures, verdoven en monteer een muis in de stereological frame. Gebruik ongeveer 2% isofluraan in zuivere zuurstof met behulp van een knaagdier anesthesieapparatuur.
- Immobiliseer de muis in een stereotaxische apparaat met oor bars en een neus houder. Solliciteer oogzalf om de ogen en wrijf de hoofdhuid met betadine en 75% ethanol voor drie rondes. Met behulp van een schaar of een tondeuse, verwijder de vacht op het hoofd. Expose de schedel met een scheermesje en het niveau van de kop. Voer een craniotomie boven de plaats van de hersenen die worden gedoseerd. Wanneer bijvoorbeeld gericht op het striatum gesneden 1,25 mmdiameter rond gat in de schedel (gecentreerd op LD: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) met behulp van een pneumatische boor. Bevochtig de geboorde gebied met een steriele zoutoplossing en gebruik een scheermesje om de schedel te verwijderen.
- Verwijder de dura voorzichtig met de punt van een naald. Bovendien kan dit worden bereikt door een minimale hoeveelheid weefsel lijm op de vochtige durale oppervlak. Zodra deze laag is uitgehard kan laterale beweging met een scheermesje tip gebruikt worden om het membraan te verwijderen.
- Plaats het slijmvlies boven de hersenen oppervlak nemen uiterste zorg aan de epitheliale zijde houden geconfronteerd weg van de wond. Dit kan het beste gebeuren door de overdracht van de gehele septum op het oppervlak van de schedel naast het craniotomie site met pincet. Gebruik de punt van een paar chirurgische schaar, trek het membraan af van het kraakbeen en op de schedel en de hersenen oppervlak. Laat je niet door het membraan uitdrogen of aanraken met enig absorberend materiaal. De ent moet goed overlappen alle benige randen van de craniotomie site.
- Bedek het transplantaat met een steriel stuk nitril. Dit dient om de hechting van de huid tijdens heling voorkomen het transplantaat. De nitril moet groot genoeg zijn om het gehele slijmvlies te dekken. Trim overmatige membraan indien nodig. Vermijd beweging van het nitril zodra het in contact komt met het implantaat is gekomen.
- Sluit de huid met een lopende 5-0 steriele hechtdraad en laat de muis te herstellen voor 3-7 dagen voordat u verder gaat met de volgende stap. Verzorgen het nitril barrière of de mucosale ent tijdens sluiting huid niet te verstoren.
4. Toediening van Doseren Solution
- Na het veiligstellen van de verdoofde muis in het stereotaxisch frame, snijd de hechtdraad met een schaar en verwijder de overtollige huid rond de schedel.
- Verwijder het nitril barrière en reinig het oppervlak van de schedel. Gebruik steriele zoutoplossing en wattenstaafjes om het gebied schoon totdat het transplantaat zichtbaar. Het kan nodig zijn om het transplantaat snijden met een scheermesje of groter dan d gegroeidesired oppervlakte.
- Als het experiment langer dan een paar dagen zal zijn, is het verstandig om te implanteren minstens twee schedel schroeven aan het hoofd implantaat versterken.
- Plaats de ruim boven het implantaat zodat de randen in contact met de schedel. Solliciteer cyaanacrylaatlijm op de kruising tussen de put en de schedel. Vul het goed met een steriele zoutoplossing en controleer of er geen lekken zijn. Putten zijn gemaakt van gesneden injectienaalden.
- Solliciteer botcement op de schedel naar de bron vast te zetten.
- Verwijder de zoutoplossing uit de put met een pipet. Was het ook een paar keer om te controleren of lijm heeft niet gelekt inch Voeg de gewenste oplossing; in dit geval 50 pl fluorescerende dextran wordt gebruikt. Verwacht wordt dat water oplosbare verbindingen met een soortgelijke polariteit gelijk dextran zal gedragen. Levering van hydrofobe verbindingen of suspensies niet onderzocht met deze methode.
- Cap de bovenkant van de put met een cirkelvormig stuk nitril bevestigd aan deboven het gebruik van cyaanacrylaatlijm. Controleer de lijm niet in contact met de inhoud goed.
5. Analyse van Transmucosale Levering
- Nadat de gewenste hoeveelheid tijd is verstreken, verdoven de muis en wisselen de inhoud goed met een oplossing van blauwe kleurstof Evan's. Deze kleurstof wordt gebruikt om te controleren of het transplantaat was intact.
- Na 30 min, verdoven de muis zwaar, verwijder de kleurstof oplossing, en euthanaseren via onthoofding.
- Handmatig verwijderen van het implantaat en verwijder de hersenen met behulp van chirurgische schaar. Wees voorzichtig om de graft op zijn plaats te houden.
- Na verwijdering flash-bevriezen de hersenen in een oplossing van isobutaan gekoeld in een droog ijsbad.
- De hersenen in te bedden in Optimal Cutting Temperatuur (oktober) oplossing en plak bij 50 micrometer.
- Plaats de gewenste segmenten direct op een microscoopglaasje.
- Afbeelding de plak met behulp van een fluorescentie microscoop zodra LGO oplossing gedroogd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het verkrijgen van een voldoende grote neustussenschot explantaat is cruciaal voor de volgende stappen. Dit kan worden bereikt door het boren ter plaatse van de donor muis schedel figuur 1a. Snijden langs dit pad een explantaat voldoende de grootte te produceren zoals getoond in figuur 1b. Wanneer de boordiepte niet diep genoeg is, zal het transplantaat afgekapt en het zal moeilijk zijn om een voldoende grote membraan naar de hersenen bedekken verkrijgen. Boren meer lateraal dan de vo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De lastigste stap van de hierin beschreven werkwijze is de succesvolle overdracht van een voldoende groot slijmvlies op het hersenoppervlak. Deze stap wordt aanzienlijk vergemakkelijkt indien het geoogste neustussenschot is groot genoeg en goed schoongemaakt. Als het ventrale gedeelte van het septum wordt afgekapt, moet een nieuw implantaat worden verkregen. De boorhoek moet loodrecht op de muis zijn hoofd dat de mucosale membraan niet beschadigd door de boor. Indien een groter dan aanbevolen boorbaan genomen zal het ve...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Benjamin S. Bleier MD is lood uitvinder van voorlopige octrooi voor methoden van drug delivery aan het centrale zenuwstelsel.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door de Mcihael J. Fox Foundation voor onderzoek 2011 Rapid Response Innovations Parkinson Awards Program. De financiers hadden geen rol in onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Muizen | Taconic | C57BL/6 | |
| Isofluraan | Piramal Healthcare | ||
| Student schaar | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Pneumatische boor | MTI Dental | 333-CB | |
| Boorkop | |||
| Pincet | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 0,9% natriumchloride-injectie USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| Polystyreen petrischaal | Fisher | 08-757-12 | voor tijdelijk opslag van transplantaat |
| Kralensterilisator | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Zuurstof/isofluraan systeem | SurgiVet | V720100 | |
| Temperatuurregelsysteem | Physitemp | TCAT-2LV | |
| Stereotaxisch instrument voor kleine dieren | KOPF | Model 940 | |
| Oogzalf | |||
| Elektrisch scheerapparaat | |||
| Wattenstaafjes | Fisher | 23-400-106 | |
| 7,5% Providon-jood | Betadine chirurgische scrub | ||
| 70% Ethanol | |||
| Chirurgische blad roestvrij | Feather | 2976#10 | |
| Scalpelgreep - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 3% Hydogenperoxide | voor het schoonmaken van de schedel | ||
| Vetbond weefselkleefstof | 3M | 1469SB | |
| Naalden | Becton, Dickinson and Company | 305176 | naaldtip afgesneden en gebruikt alsmede |
| Spuiten | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| Nitril handschoenen | Denville Scientific Inc | G4162 | voor goede sluiting en bescherming van transplantaat |
| 5-0 Nylon hechtdraad | |||
| Student Halsey naaldhouder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Cyanoacrylaatkleefstof | commercieel verkrijgbare superlijm | ||
| Tandartskit, 1 lb, roze ondoorzichtig | Stoelting | 51458 | |
| Isobutaan (2-methylbutaan) | Aldrich | M32631 | voor droogijsbad |
| Droogigs |
Referenties
- Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
- Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
- Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
- Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
- Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
- Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
- Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
- Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
- Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
- Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
- Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
- Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
- Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
- Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
- Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
- Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
- Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
