A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Summary

We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.

Abstract

Gereedschappen die het uitoefenen van mechanische krachten om cellen en weefsels of waarmee kan kwantificeren de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel dramatisch bijgedragen tot het begrijpen van fundamentele mechanobiology. Deze technieken zijn uitgebreid gebruikt om aan te tonen hoe het ontstaan ​​en de progressie van verschillende ziekten sterk worden beïnvloed door mechanische signalen. Dit artikel presenteert een multi-functionele biaxiale (BAXS) platform dat mechanisch kunnen stimuleren enkele cellen of kwantificeren van de mechanische stijfheid van weefsels. De BAXS platform bestaat uit vier voice coil motoren die onafhankelijk kunnen worden bestuurd. Enkele cellen kunnen worden gekweekt op een flexibel substraat dat kan worden bevestigd aan de motor zodat men de cellen blootgesteld aan complexe, dynamische en ruimtelijk variërende spanning velden. Omgekeerd, doordat een kracht load cell, kan ook kwantificeren de mechanische eigenschappen van primaire weefsels ze worden blootgesteld aan deformatie cycli.In beide gevallen moet een goede set van klemmen worden ontworpen en gemonteerd aan de BAXS platform motoren om stevig vast te houden het flexibel substraat of het weefsel van belang. De BAXS platform kan op een omgekeerde microscoop worden gemonteerd gelijktijdige doorvallend licht en / of fluorescentie beeldvorming uit te voeren om de structurele of biochemische reactie van het monster tijdens het spannen experimenten onderzoeken. Dit artikel geeft experimentele details van het ontwerp en het gebruik van de BAXS platform en presenteert de resultaten voor enkele cel en hele weefsel studies. De BAXS platform werd gebruikt om de vervorming van kernen in enkele muis myoblast cellen in reactie meten spanning substraat en de stijfheid van geïsoleerde muis aorta meten. De BAXS platform is een veelzijdig instrument dat kan worden gecombineerd met verschillende optische microscopie om nieuwe mechanobiologische inzichten op de sub-cellulair, cellulaire en hele weefsel niveaus bieden.

Introduction

De mechanische micro speelt een belangrijke rol in vele celfuncties zoals proliferatie, migratie en differentiatie, die een grote invloed hebben op de ontwikkeling en homeostase van weefsels en ook ziekten ^1-6. In de loop der jaren, hebben een veelheid van experimentele instrumenten gebruikt om mechanisch te stimuleren cellen of weefsels en meet mechanische eigenschappen van biologische weefsels met als doel het vergroten van ons begrip van de fundamentele mechanobiology en het bestuderen van het ontstaan ​​en de progressie van ziekten ^6-17. Men moet echter vaak afhankelijk van verschillende experimentele apparatuur om de doelstellingen van een ....

Protocol

1. Mechanische vervorming van enkele cellen

1. Fabricage van een PDMS Ondergrond met ingebouwde TL-Beads
   Vóór vervaardiging van het substraat, worden fluorescente microsferen in water oplossing gesuspendeerd in isopropanol kraal menging te verbeteren op het PDMS vanwege de hydrofobe aard.
   1. Pipetteer 500 ul van fluorescerende microbolletjes in een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer bij 16.200 xg gedurende 10 minuten.
   2. Verwijder het supernatant en voeg 500 ul van isopropanol gevolgd door 5 min van vortexen. Plaats de flacon aan de kant 's nachts in het donker, zodat elke grote deeltjes aggregaten naar sediment.
   3. De v....

Results

Cel Stretching

De BAXS platform werd gebruikt om de mechanische reactie van de kern in enkele muis myoblast cellen (C2C12) blootgesteld aan een substraat vervorming van 25% onderzocht. Myoblast cellen worden aangetroffen in het spierweefsel en worden voortdurend blootgesteld aan mechanische rek en compressie in vivo. De vorm en mechanische eigenschappen van de celkern blijkt een belangrijke rol spelen bij de regulatie van genexpressie en transcriptionele activiteit .......

Discussion

De BAXS platform gepresenteerde vergemakkelijkt talrijke experimenten in de studie van mechanobiology uit onderzoek van enkelvoudige cellen tot volledige weefsels. Bovendien, het platform is zeer flexibel en configureerbaar, waardoor talrijke mechanische stimulatie experimenten en multi-axiale trekproeven. Het platform maakt ook het onderhoud van cellen en weefsels in fysiologische omstandigheden en toelaten om gelijktijdig microscopie tijdens het spannen experimenten. De twee experimenten in de vorige paragrafen beschr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your
FluoSpheres fluorescent microspheres	Invitrogen	F8810	Keep away from light.
Linear voice coil	Moticont	LVCM-051-051-01	The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slide	Edmund Optics	NT37-360	Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stage	Edmund Optics	38-960	Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoder	GSI microE systems	Mercury II 1600S - 0.5um resolution	reflective incremental encoder.
Motion controller	Galil	DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440	4 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cell	Honeywell	31 low	miniature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm)	Pin Service Austerlitz Insect pins		Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050	Micro Chem	SU-8 2050	Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment system	Glowresearch		Autoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagen	Invitrogen	A10483-01	Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342	Invitrogen	R37605	DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters	omega.ca	KHLV-0504/(10)-P	28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers	omega.ca	CN63200-R1-LV	Temperature controller; supply 24 V.
DMEM culture medium	Hyclone	SH3024301	Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-Streptomycin	Hyclone	SV30010	Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH3039603C	Keep frozen.
Trypsin 0.05%	Hyclone	SH30236.02	Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
Hepes	Wisent Inc	330-050-EL	HEPES-buffered salt solution
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2	Fisher Scientific	C614-500	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
Dextrose	Fisher Scientific	BP220-1	HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-1	Krebs physiological solution
KH2PO4	Fisher Scientific	BP362-500	Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2	Lindle	DIN:02154749	Krebs physiological solution oxygenation
Nocodazole	Sigma	M1404	Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-D	Sigma	C8273	Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITC	Sigma	F3777	Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stain	Fluka	43665	Used to stain and quantify collagen content