Methodenartikel

Een Low-cost methode voor het analyseren van de inbeslagneming-achtige activiteit en beweging in Drosophila

DOI:

10.3791/51460

⸱

19 februari 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Franciscan University of Steubenville, 2Department of Computer Science, Franciscan University of Steubenville

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van een webcam en een combinatie van gratis en goedkope software programma's, kan locomotief patronen in Drosophila melanogaster worden geanalyseerd om verschillen in de snelheid, afstand en tijd van de verschillende motorische activiteiten op te sporen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Video tracking systemen zijn op grote schaal gebruikt om Drosophila melanogaster beweging te analyseren en op te sporen diverse afwijkingen in locomotief gedrag. Hoewel deze systemen een schat aan gedrags-informatie kunnen verschaffen, kunnen de kosten en complexiteit van deze systemen worden onbetaalbaar voor vele laboratoria. We hebben een goedkope test voor het meten van locomotieven gedrag en inbeslagneming beweging in D. melanogaster ontwikkeld. Het systeem maakt gebruik van een web-cam om beelden die kunnen worden verwerkt met behulp van een combinatie van goedkope en gratis software op te sporen de afstand verplaatst te vangen, de gemiddelde snelheid van de beweging en de duur van de beweging gedurende een bepaalde tijdspanne. Om de bruikbaarheid van dit systeem te demonstreren, onderzochten we een groep D. melanogaster mutanten, Bang-gevoelige (BS) verlamden, die 3-10 keer meer vatbaar voor aanvallen-achtige activiteit (SLA) dan wildtype vliegen zijn. Met behulp van dit nieuwe systeem, waren we in staat om te detecteren dat de BS mutandist bang zinloze (BSS) vertoont lagere niveaus van verkennende motoriek in een nieuwe omgeving dan wild type vliegen. Daarnaast is het systeem gebruikt om te identificeren dat de metformin, die gewoonlijk wordt gebruikt om type II diabetes, vermindert de intensiteit van SLA in de BS mutanten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gezien de korte levensduur en de robuuste genetische tools beschikbaar, Drosophila melanogaster is een uitstekend model voor het onderzoek naar de etiologie van verschillende ziekten en de onderliggende fysiologie van verschillende biologische processen. In veel gevallen is het voordelig om de effecten gedrags, genetische of farmacologische manipulaties hebben voor beweging bij deze modelorganismen 1,2 meten.

Er zijn verschillende methoden die algemeen worden gebruikt voor het meten vliegverkeer tweedimensionaal 3-7. Deze systemen kunnen het volgen van meerdere vliegen tegelijkertijd ondersteunen en kan de snelheid, opnemen weglengte meten en registreren van het percentage van de tijd een vlieg heeft bewegende doorgebracht. Ze zijn gebruikt om beweging te bestuderen in verschillende contexten, waaronder de effecten van geneesmiddelen op motoriek en seksuele dimorfe aard van vliegverkeer 6-9. Het grote nadeel van deze systemen is de kosten van het bijhouden systeem of de bijbehorende software en camera. In sommige gevallen kan deze uitgevoerd in de duizenden dollars. De kostprijs is een bijzondere zorg voor een laboratorium dat slechts beperkt gebruik van zo'n systeem nodig, bijvoorbeeld kwantificeren locomotief patronen van een onlangs geïsoleerd mutant.

Een eenvoudiger, maar minder robuuste methode is om systemen die beweging op te nemen op basis van het aantal keren dat een vlieg kruist een infrarode lichtstraal pad dat wordt geplaatst in het midden van een gesloten buis 10,11 gebruiken. Hoewel dergelijke systemen waardevolle informatie over beweging en slaap-waak cycli kunnen geven, ze kan over of onder de raming van de beweging omdat ze niet aan de werkelijke pad van de vlieg te vangen. Zo zal vliegen die aanzienlijke beweging vertonen aan de uiteinden van de buis zo laag verkeer meld vliegt maar met verdere hoge resolutie methoden zijn gebruikt om te proberen en omzeilen deze beperkingen 12.

Eenvoudiger en goedkoper nog klimmen apparaten die geotaxi metens, de opwaartse beweging van vliegen, via een buis of een reeks buizen 2,13. Hoewel dergelijke systemen zijn goedkoop en kunnen gemakkelijk geotaxis afwijkingen te laten, ze niet te veel andere aspecten van de beweging die van belang zijn voor de onderzoekers zou zijn vast te leggen.

Voor veel labs, een low-cost robuuste analyse systeem dat eenvoudig te installeren en te bedienen zou een voordelige hulpmiddel voor het karakteriseren van gedragsverschillen in D. melanogaster stammen zijn. Hier beschrijven we een test waarmee kan worden opgezet voor minder dan tweehonderd dollar en is in staat om informatie over de weg, de snelheid en de duur van de beweging van de vlieg geven. Om de werkzaamheid van de test tonen presenteren we gegevens aantonen dat het kan worden gebruikt voor het identificeren, 1) een motorische defect in een Bang-gevoelige (BS) mutant die gevoelig is voor aanvallen en 2) het vermogen van het geneesmiddel metformine, die wordt vaak gebruikt voor de behandeling van type II diabetes, de intensiteit van aanvallen-achtige activiteit (SLA) i verminderenn twee BS mutanten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van de individuele Flies voor Locomotion Assay

  1. Transfer vliegt door zachtjes te tikken in individuele lege flacons en dop de flesjes met een katoenen plug. Laat vliegen om ongestoord 20-30 minuten zitten voor observatie. Het is belangrijk om niet verdoven de vliegen binnen het uur voor gedragsobservatie als eerdere studies hebben gevonden blootstelling anesthesie gedrag te veranderen in vergelijking met niet-verdoofde vliegen 14.
  2. Tik voorzichtig de vlieg uit de flacon en plaats individuele vliegen onder een diameter van 5 cm petrischaal deksel (5 mm hoog) met kleine spleten lucht doorgang mogelijk te maken. Verlichten van beneden en observeer de vliegen met behulp van een webcam boven de petrischaal gemonteerd.

2. Voorbereiding van de individuele Flies voor Inbeslagneming Assay

  1. Feed twee dagen oude beslag gevoelige vliegen ofwel standaard gist / maïsmeel / agar media of standaard media gemengd rechtstreeks met drugs. Want hier de overgelegde gegevens werden vliegen gevoed ofwel 1 keerf standaard media of 1 g standaard media gemengd met 25 mg metformine.
  2. Na de vliegen gevoed hebben voor twee dagen op de media of media plus drug, zet ze door zachtjes te tikken in individuele lege flacons en dop de flesjes met een katoenen plug. Laat vliegen om ongestoord te zitten voor 20 minuten voor observatie. Het is belangrijk om niet verdoven de vliegen binnen het uur voor gedragsobservatie als eerdere studies hebben gevonden blootstelling anesthesie gedrag te veranderen in vergelijking met niet-verdoofde vliegen 14.
  3. Vortex individuele flacons met een vlieg op een lab vortexer met de hoogste instelling voor 10 sec. Plaats de geïmmobiliseerde vlieg op een leeg wit vel papier direct onder een webcam boven het document opgezet.

3. Video Recording

  1. Noteer de beweging of SLA met de HandyAvi softwareprogramma http://www.azcendant.com/download.htm . Dit programma maakt gebruik van de webcam aanbeelden vast te leggen op basis van de gebruikersinstellingen.
  2. Selecteer de time-lapse beelden optie onder het tabblad Capture, Wanneer het venster wordt geopend, selecteert u de webcam als het opnameapparaat. Voor de meeste experimenten het videoframe grootte van 640 x 480 is voldoende.
  3. Selecteer Intel IYUV codec voor het comprimeren en kies 0,1 sec / frame voor de inbeslagneming assay of kies 0,1-0,5 sec / frame voor de beweging test. Onder het tabblad Geavanceerd en selecteer een. Bmp image bestand voor elke capture en selecteer een map voor het programma om de beelden die het duurt (het beeld stack) op te slaan.
  4. Plaats een dode vlieg op het vel papier. Klik op de doos Video-instellingen en de instellingen onder het tabblad Apparaat-instellingen, zodat er een helder witte achtergrond en een duidelijk contrast met de donkere vlieg.
  5. Klik op de Start-knop om de opname te starten. Zodra de opname periode is voltooid, klikt u op de stop-knop. De afbeelding stapel moet nu in de geselecteerde map. Opmerking: Voordat u opneemt, zorgen ervoor dat de volder geselecteerd voor het beeld stapel leeg is.

4. Data analyse met behulp van ImageJ

  1. Open NIH gratis software voor beeldverwerking ImageJ, die kan worden gedownload via http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Opmerking: Naast het downloaden van het programma, moet de Multitracker plug-in gedownload en geïnstalleerd, zoals aangegeven op http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
  2. Importeer de afbeelding stapel in ImageJ door te klikken op het tabblad Bestand en vervolgens Importeren → Afbeelding volgorde.
    1. Selecteer de map die het beeld stapel bevat, markeert een van de afbeeldingen en kies openen. Een Sequence Opties dialoogvenster zal openen. Klik op de namen sorteren numeriek en selecteer vervolgens op OK en de afbeelding stapel zal in ImageJ worden geladen.
  3. Drempel alle beelden zodat elk bestaat uit een witte achtergrond met de vlieg zijngeconverteerd naar een zwarte stip. Om dit proces te beginnen, de afbeelding naar een 8-bits-formaat aan door Type → 8 bit onder het tabblad Beeld.
    1. Klik op het tabblad Beeld nogmaals in en selecteer Aanpassen → Drempel. Dit zal de drempel dialoogvenster waarin de drempel afgesneden punt kan worden aangepast openen.
    2. Scan door de afbeeldingen om te zien of er extra zwarte stippen of als een plak mist een zwarte stip. Als dit het geval is, passen de drempel om het probleem te verlichten. Gewoonlijk is de drempel niet te worden aangepast als het programma standaard voldoende waarde.
      Opmerking: Elke dia in de stapel mag slechts een zwarte stip die de positie van de vlieg te hebben.
    3. Selecteer van toepassing in de Drempel dialoogvenster en een Convert to dialoogvenster Masker zal openen. Geen van de opties klikt, maar klikt u op OK om de drempel afbeelding stapel.
  4. Na drempelen het beeld stapel, selecteer de Multitracker plug-in onder het tabblad Plugins ommeet de beweging van de vlieg in pixels. De Object Tracker dialoogvenster verschijnt.
    1. Klik op alle vier opties gegeven in het dialoogvenster en selecteer vervolgens OK. De Multitracker plug-in en bevestig vervolgens de coördinaten naar de zwarte stip in elk segment en een lijst van deze in de resultaten venster evenals de totale weglengte in pixels. Het venster Paden geeft een grafische weergave van het pad de vlieg nam.
    2. Kopieer de x-en y-coördinaat lijst van het venster Resultaten en plak de gegevens in een Excel-spreadsheet. Als een dia in de stapel niet over een zwarte stip in staat, zal het Multitracker programma stoppen op die dia. Als dit gebeurt, is het nodig om terug te gaan naar stap 4.2 en opnieuw drempel de stapel zodat de vlieg registers als een zwarte stip in de dia betrokken.
  5. Om te zetten de padlengten van pixels naar cm, nemen een aparte afbeelding van twee punten die verdeeld zijn een cm van elkaar op een vel wit papier.
    1. Volg de bovenstaandestappen (3.1-4.4.2), de x bepalen y pixel coördinaten van de twee punten en deze informatie aan het aantal pixels dat overeenkomt met een cm te bepalen. De conversiefactor wordt gebruikt in stap vijf tot bewegingsgegevens in cm genereren. Opmerking: Zodra dit is gebeurd, is het belangrijk om de voor alle toekomstige opnamen vaste camera houden. Elke keer dat de camera wordt bewogen of worden aangepast, moet men deze stap herhalen om de pixels te zetten in cm.
    2. De weglengte die wordt gegenereerd door de Multitracker plug-in beweging overschat omdat kleine fluctuaties in lichaamshouding en lichtintensiteit / reflectie de grootte en het centrum van de zwarte stip die wordt gegenereerd wanneer drempelvorming de beelden beïnvloeden. Dit geluid moet om een ​​nauwkeurige schatting van vliegverkeer te worden verwijderd.

5. Data analyse met behulp van Excel

  1. Verwijder het lawaai van de geregistreerde gegevens door het importeren van de reeks x, y coördinaten gegenereerd door de Multitracker prOGRAMMA in Fly Analysis, een Excel Visual Basic-programma gemaakt door de auteurs. (Het programma is beschikbaar door contact met de auteurs.)
  2. Klik op de Click Me knop en selecteer een drempelwaarde cut-off. Selecteer een drempelwaarde van 0,5 cm / sec voor SLA analyse of selecteer een waarde tussen 0,1-0,3 cm / sec voor bewegingsanalyse. Klik op OK en het programma zal de snelheid, tijd en afstand van de beweging te berekenen. Opmerking: Het programma gebruikt een schuifraam analyse van de gegevens in opeenvolgende 0,5-1,0 seconden bakken evalueren en berekent de snelheid tijdens dat venster. Alles boven de gebruiker gedefinieerde cutoff behandeld als vliegverkeer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven techniek is al eerder gebruikt om verschillen in SLA in de Drosophila mutanten BS 1 analyseren. De hier gepresenteerde resultaten betreffen de BS stammen gemakkelijk geschokt (eas), bang zinloze (BSS), en technische knock-out (TKO). De EAS locus codeert een ethanolamine kinase betrokken fosfatidylethanolamine synthese 15 en TKO locus codeert voor een mitochondriaal riboprotein 16. De bss mutatie is een allel van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij de behandeling van motorische of bewegingspatronen in Drosophila, is het nuttig om in staat om informatie over de afgelegde afstand, de snelheid van de beweging en het bewegingspatroon te halen. Om deze informatie te halen, is dure apparatuur oudsher werkzaam, dat is vaak onbetaalbaar voor kleinere laboratoria of laboratoria die willen dergelijke testen spaarzaam 4,8,9 gebruiken.

De hier beschreven test kan worden gebruikt om te bepalen de afgelegde afstand (f...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen ook dank aan Kris Brander, Stephen McKinney, Laura Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer, en Megan Hyde uiten voor hun werk in de fine-tuning van deze test.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
WebCamLogitechPro900Elke kwaliteit webcam is voldoende.
HandiAVI time-lapse softwareAzcendant softwareDe nieuwste versie is te vinden op http://www.azcendant.com/
ImageJNIHDe nieuwste versie is te vinden op http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Multiracker Plug-InNIHDe nieuwste versie is te vinden op http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html
VortexerVWRVortex Genie 2De meeste standaard formaat vortexers zoals de Vortex Genie 2 zijn voldoende.
5 cm Petri schotel dekselLabM LimitedD011Kleinere of grotere Petri schotel deksels kunnen worden gebruikt voor een arena in beweging assay.
Lichtboxop maat gemaaktGemaakt van schrootmateriaal. Verlichting wordt gebruikt voor de locomotieve assay. Afhankelijk van de kamer verlichting, is het mogelijk om de assay uit te voeren zonder de lichtbox. 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in. 1496, 94-103 (2013).
  2. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).
  3. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  4. Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).
  5. Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).
  6. Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, (2002).
  7. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
  8. Martin, J. R. A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).
  9. Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila. J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).
  10. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13, 489-499 (2012).
  11. Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour. PLoS One. 5, (2010).
  12. Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program. PLos ONE. 7, (2012).
  13. Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia. Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).
  14. Seiger, M. B., Kink, J. F. The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila. Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).
  15. Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis. Cell. 79, 2333 (1994).
  16. Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12. Cell. 51, 165-173 (1987).
  17. Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. , 187-534 (2011).
  18. Hardie, D. G. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).
  19. Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bewegingsanalyse van Drosophilawebcam trackingImage J verwerkingsoftware voor vliegenanalyselocomotorisch gedragbang gevoelige mutantenmetforminbehandelingvideoportaaldata analyse

Gerelateerde artikelen