Behandeling van primaire muis osteoblasten met retinoinezuur produceert een homogene populatie van vertakte cellen die morfologische en moleculaire kenmerken van osteocyten. De werkwijze overwint de moeilijkheid van het verkrijgen en handhaven primaire osteocyten in kweek, en kan voordelig zijn om cellen uit transgene modellen bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Toepassing van retinoinezuur aan Osteocyten Culturen van primaire muizen osteoblasten verkrijgen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De behoefte aan osteocyt culturen is goed bekend bij de gemeenschap van bot onderzoekers; isolatie van primaire osteocyten is moeilijk en produceert lage cel aantallen. Daarom is de meest gebruikte mobiele systeem is de osteocyt-achtige MLO-Y4 cellijn.
De hier beschreven methode heeft betrekking op het gebruik van retinoïnezuur een homogene populatie van vertakte cellen met morfologische en moleculaire kenmerken osteocyten genereren.
Na isolatie van osteoblasten uit muizen calvaria, is all-trans retinoic acid (ATRA) toegevoegd aan cel medium en mobiele controle wordt dagelijks uitgevoerd onder een omgekeerde microscoop. Eerste morfologische veranderingen zijn detecteerbaar na 2 dagen van de behandeling en differentiatie is over het algemeen in 5 dagen, met een geleidelijke ontwikkeling van dendrieten, verlies van het vermogen om de extracellulaire matrix te produceren, down-regulatie van osteoblasten markers en up-regulatie van osteocyt-specifieke moleculen. gehalte "> Dagelijkse mobiele controle is nodig vanwege de inherente variabiliteit van elektrische elementen, en het protocol kan worden aangepast met minimale variatie cellen verkregen van verschillende muizen en toegepast om transgene modellen.
De werkwijze is eenvoudig uit te voeren en vereist geen speciale instrumenten vereist, is het zeer reproduceerbaar en snel genereert een volwassen osteocyten populatie volledige afwezigheid van extracellulaire matrix, die het gebruik van deze cellen voor onbeperkte biologische toepassingen.
Inleiding
Osteocyten, de meest voorkomende soort bot cel, zijn terminaal gedifferentieerde, sterk vertakte cellen diep gelegen in het skelet. De cel lichaam van volwassen osteocyten zijn opgenomen in het bot lacunes en hebben diverse vormen; osteocyten met langwerpige cel lichamen zijn gevonden in de corticale bot, terwijl afgeronde osteocyten komen vaker voor in het trabeculair bot 1. Vertakte dendrieten verlengen van het cellichaam en wonen in kleine kanalen genoemd canaliculi, vormen een ingewikkeld web dat meerdere contacten niet alleen met andere osteocyten, maar ook met andere bot celtypen, het beenmerg, de bloedvaten en de bijbehorende pericytes maakt. Door de interstitiële vloeistof in leemten en canaliculi, osteocyten zijn uiteindelijk ook aangesloten op het circulatiesysteem, kunnen derhalve niet alleen lokaal maar ook systemische bijwerkingen, en omgekeerd hun gedrag kan door lokale en systemische 2 veranderingen worden geregeld beïnvloeden.
Destudie van osteocyten onlangs stroomversnelling, dankzij een aantal technische ontwikkelingen, zoals het genereren van weefsel-en celspecifieke transgene dieren, het gebruik van krachtige microscopische technieken en hoog-moleculaire screening 3,4. Echter, de kennis van deze cellen is nog onvolledig, voornamelijk als gevolg van de relatieve schaarste van voldoende in vitro modellen. Eigenlijk osteocyten zijn altijd moeilijk te verkrijgen en in cultuur te behouden vanwege de diepe ligging en het lage niveau van proliferatie dat zo'n gedifferentieerde celtype kenmerkt.
Langs de jaren is een aantal methoden ontwikkeld om primaire osteocyten 5-7 isoleren, maar ze produceren in het algemeen lage opbrengsten cel en het risico in dat zelfs een paar verontreinigende fibroblasten snel zal overwoekeren de osteocyten 8. Daarom heeft meest experimentele in vitro werk dusver uitgevoerd op de gevestigde osteocyten cel line MLO-Y4 9.
Extra in vitro methoden kon de mogelijkheid van het bestuderen van deze cellen te verbeteren en zou de analyse van osteocyt biologie en pathofysiologie verbeteren. Grotendeels worden aangenomen, moet deze methoden gemakkelijk te reproduceren, en zou geen bijzondere instrumenten of zeer lange tijd nodig heeft om celrijping bereiken. Belangrijk, indien van toepassing op primaire cellen, zouden zij het mogelijk te maken van transgene dieren. We hebben recent beschreven dat de behandeling van de osteoblast cellijn MC3T3-E1 en primaire osteoblasten met retinoïnezuur induceert een snelle fenotype wijziging leidt tot de ontwikkeling van een homogene populatie van vertakte cellen die morfologische en moleculaire kenmerken van osteocyten 10.
All-trans retinoïnezuur (ATRA) is actief metaboliet van vitamine A die gentranscriptie reguleert door binding nucleaire retinoïnezuur receptoren (RAR). RARbinden aan DNA als heterodimeren met de retinoïde X receptor (RXR), wat uiteindelijk leidt tot modulering van retinoïnezuur (RA)-responsieve doelgenen 11. ATRA is aangetoond dat differentiatie en rijping van verscheidene celtypes moduleren, waaronder andere vertakte cellen zoals neuronale cellen 12 en podocytes 13.
De hier beschreven methode is gebaseerd op de toevoeging van ATRA primaire osteoblasten. Om doeltreffend te zijn, ATRA te worden toegevoegd in een nauwkeurige maturatie op cellen uitgeplaat bij een bepaalde dichtheid; in onze ervaring deze voorwaarden zijn cruciaal voor het fenotype switch te verkrijgen van osteoblasten tot osteocyten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de nationale en Europese huidige regelgeving met betrekking tot de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden en werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Milaan goedgekeurd.
1. Isolatie van primaire Osteoblasten
De methode, met kleine wijziging, volgt de beschreven door Dodig et al. 14 procedure.
- Bereid verteren medium, door 0,1% collagenase P en 0,05% trypsine (vanaf 2,5% trypsine 10X, zonder fenolrood) met HBSS medium (Hanks gebalanceerde zoutoplossing, geen calcium, magnesium of fenolrood).
- Gebruik 3-4 dagen oude muizen (de procedure kan worden toegepast op zo weinig als 1 muis).
- Sacrifice door onthoofding. Spray het hoofd met 70% ethanol en blijf op ijs. Verwijder het vel en de spieren lagen door pincet en ontleden / chirurgische schaar.
- Verwijder voorzichtig de pariëtale botten enze te scheiden door de pijlnaad in twee helften. Zorg ervoor dat de botten zijn vrij van hechtingen en eventuele aanhangende weefsels en plaats individuele botdelen in goed-platen met HBSS medium totdat de procedure is afgerond.
- Gooi HBSS en voeg aan elk putje het verteren medium gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Verwijder het supernatant.
- Voeg nogmaals verteren medium gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Dit bespaart tijd de supernatant en plaats deze in alfa-MEM (Minimum Essential Medium) gesupplementeerd met 10% FBS (foetaal runderserum) en 1% streptomycine / penicilline.
- Herhaal de stappen 1.7 en 1.8 2x.
- Verzamel de drie verzamelde fracties, rotatie cellen door centrifugeren bij 425 g gedurende 5 min, gooi het supernatant, voeg 3 ml AANGEVULD alfa-MEM aan de celpellet opnieuw in suspensie, en overbrengen in een 25 cm2 kolf.
- Verander het medium na 24 uur om vuil en dode cellen te verwijderen.
- Voeg 50 ug / ml ascorbinezuur (AA) en 3 mM glycerol 2-fosfaat dinatriumzout hydraat (GP) aan het alfa-MEM medium.
- Daarna verandert het medium (alfa-MEM plus AA / GP) om de andere dag.
2. ATRA Protocol
- Voeren alle experimenten met ATRA (all-trans retinoïnezuur) in een verduisterde kamer te inactivatie te voorkomen.
- Bereid een 1X trypsine-oplossing in HBSS medium en laten 37 ° C tot gebruik.
- Verwijder het medium uit subconfluente cellen en zorgvuldig wassen met HBSS.
- Voeg 1 ml trypsine, voorzichtig zwenken de kolf om alle cellen worden gedekt door trypsine en incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C.
- Controleer de werkelijke losmaken van cellen onder een omgekeerde microscoop.
- Voeg 3 ml alpha MEM-medium tot trypsine te inactiveren.
- Herstel de cellen en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 425 g.
- Resuspendeer de celpellet in vers medium.
- Plaats een druppel in een hemocytometer telkamer, laat bezinken voor een paar minuten en tel de cell nummer.
- Plaats cellen in 25 cm2 flessen met een dichtheid van 10.000 cellen / cm 2 met alfa-MEM plus AA / GP. Wees ervan bewust dat celdichtheid voor de optimale ontwikkeling van cellulaire processen en intercellulaire contacten relevant is. Een uitgangspunt dichtheid hoger dan 10.000 cellen / cm 2 belemmert adequate ontwikkeling van celprocessen, maar lagere celaantallen resulteren in voortijdige celdood, door het ontbreken van intercellulaire contacten.
- Voeg 5 uM ATRA aan het medium elke 24 uur.
- Monitor de cellen dagelijks naar morfologie beoordelen: morfologische veranderingen zijn over het algemeen waargenomen na 48 uur. Indien na de eerste 24-48 uur, worden de cellen nog prolifererende, replate op het hierboven dichtheid. Een homogene populatie van volwassen osteocyten aanwezig is na 4-5 dagen. Afhankelijk van de wensen gebruikt cellen op elk tijdstip, tot 12-15 dagen.
- Wanneer cellen worden uitgeplaat op andere dragers (zoals dekglaasjes of goed-platen), er zeker van zijn dat de bovenstaande dichtheid wordt onderhouden enblijven ATRA elke 24 uur toe tot gebruik. Laat cellen om zich aan de nieuwe ondersteuning voor ten minste 24 uur voor het experiment.
3. Immunokleuring
- Voor immunokleuring, plaat de cellen op dekglaasjes en volg gevestigde methodieken (zie bijvoorbeeld Burry 15).
- Bijvoorbeeld voor indirecte immunofluorescentie, vast in 4% paraformaldehyde of koude aceton, incubeer achtereenvolgens met het primaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in een vochtige kamer, vervolgens de secundaire fluorescent gemerkt antilichaam in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min, in een vochtige kamer.
- Gebruik DAPI of analogen voor nucleaire tegenkleuring, en houder van anti-fading medium.
4. Alizarinerood kleuring en Extraction
- Plaat de cellen op dekglaasjes.
- Fixeer de cellen door onderdompeling van het dekglaasje in 70% ethanol gedurende 10 minuten.
- Bedek de cellen met enkele druppels alizarinerood kleuroplossing (1 mg / ml, pH 5,5)gedurende 30 minuten.
- Was de dekglaasjes met kraanwater. Monteer met een druppel glycerol op glas dia's en foto's maken met behulp van een rechtopstaande microscoop bij 10x en 20x vergroting.
- Na de bovenstaande procedure, herstellen de dekglaasjes door onderdompeling van de dia's in leidingwater.
- Zet elke dekglaasje in een goed plaat.
- Voeg 60% perchloorzuur (de hoeveelheid voldoende om de cellen volledig te bedekken zijn) en laat O / N bij 4 ° C onder zacht schudden.
- Lees de optische dichtheid van het supernatant spectrofotometrisch bij 450 nm golflengte.
- Waarden voor celaantal normaliseren, voeg Janus Groen (0,2% oplossing in PBS) aan de cel voorbereiding 10 minuten dekken.
- Zorgvuldig wassen met ultrapuur water.
- Voeg 0,5 N HCl (de hoeveelheid is genoeg om alle cellen te dekken) en schud voorzichtig met de hand voor een paar sec.
- Lees de absorptie bij 615 nm spectrofotometrisch.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Resultaten werden verkregen van 5 tot 10 onafhankelijke experimenten.
Celmorfologie
AA / GP behandelde primaire cellen hebben meestal geplaveide-achtige functies, kenmerkend voor volwassen osteoblasten. Afgewisseld vertakte cellen (zoals aangegeven door rode pijlen in figuur 1A) kan worden gevonden, die waarschijnlijk vertegenwoordigen enkele osteocyten.
Met ATRA behandeling, cellen snel beginnen met het weergeven vertakkin...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In de afgelopen jaren de osteocyt heeft ontpopt als de meest centrale cel in het bot. Onderzoek voorschotten worden geleidelijk onthullen van een aantal niet eerder verdacht of onbewezen osteocyt eigenschappen, die van enorme waarde voor het ontwerpen van nieuwe en betere behandeling voor een verscheidenheid van botziekten. Echter, onderzoek osteocyten biologie last van de beperkte beschikbaarheid van in vitro modellen zodanig osteoblasten die zijn gebruikt als surrogaat cellen gedurende een lange periode voor ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De financiering werd verstrekt door "Progetto een concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" naar MD, en Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Voorverwarmen op 37 °C voor gebruik |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Voorverwarmen op 37 °C voor gebruik |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycine/Penicilline | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbinezuur | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-fosfaat dinatriumzouthydraat | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Bescherm ATRA tegen licht |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Oplossen in PBS en filteren voor gebruik. Altijd werken onder een chemische kap. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Kan worden toegevoegd aan het secundaire antilichaam |
| Alizarine rood | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Groen | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchlorazuur | Sigma-Aldrich | 176745 | Gebruik met voorzichtigheid (huid- en oogbescherming worden aanbevolen) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Gebruik met voorzichtigheid (huid- en oogbescherming worden aanbevolen) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Pincetten #7, 0.40 x 0.5 mm uiteinden | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Pincetten #4, 0.40 x 0.45 mm uiteinden | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissectie-schaartjes, recht, 10 cm gebogen | World Precision Instruments | 14394 | |
| Chirurgische schaar, 14 cm, recht, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Kweekkolven | Corning | 430168 | |
| Putjesplaten | Corning | 3335 | |
| Thermanox dekglasjes | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscoop | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
Referenties
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. Osteocyte isolation and culture. Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).
- Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
