Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Samenvatting

Spatiotemporele informatie over dynamische eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van de biologie. Een type superresolutiemicroscopie genaamd fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) onthult unieke informatie over de cytokinetische Z-ring in bacteriën: zowel het kralenachtige uiterlijk als de snelle dynamica van FtsZ binnen de ring.

Samenvatting

Beeldvorming van biologische monsters met behulp van fluorescentie microscopie is aanzienlijk gevorderd met nieuwe technologieën om de resolutie barrière van de diffractie van het licht waardoor super-resolutie van de live samples te overwinnen. Er zijn drie hoofdtypen van super-resolutie technieken - gestimuleerde emissie uitputting (STED), single-molecule lokalisatie microscopie (met inbegrip van technieken zoals PALM, STORM, en GDSIM), en gestructureerde verlichting microscopie (SIM). Terwijl STED en single-molecule lokalisatie technieken tonen de grootste stijgingen in de resolutie, zijn ze langzamer geweest om grotere snelheden beeldverwerving bieden. Driedimensionale SIM (3D-SIM) is een wide-field fluorescentie microscopie techniek die een aantal voordelen ten opzichte van zowel enkele molecule lokalisatie en STED biedt. De resolutie wordt verbeterd, met typische laterale en axiale resoluties van 110 en 280 nm, respectievelijk monsternemingsdiepte tot 30 urn van het dekglaasje, waardoorbeeldvorming van gehele cellen. Recente ontwikkelingen (snel 3D-SIM) in de technologie verhogen de opnamesnelheid van rauwe beelden zorgt voor een snelle vangst van biologische processen die zich in seconden, terwijl de foto-toxiciteit en fotobleking aanzienlijk te verminderen. Hier beschrijven we het gebruik van een dergelijke werkwijze voor het bacteriële cellen die de fluorescentie-gemerkte cytokinetic FtsZ eiwit aan hoe cellen geanalyseerd en het soort unieke informatie dat deze techniek kan verschaffen.

Inleiding

Een aantal verschillende beeldvormende technieken zijn gebruikt in de jaren bacteriën, waaronder diverse elektronische en optische microscopie technieken te bestuderen. Terwijl elektronenmicroscopie biedt zeer hoge resolutie, tot de nanometer, de noodzaak van een vacuüm en het gebruik van contrastmiddelen heeft deze techniek om vaste en ingebedde monsters beperkt. Artefacten kunnen ook worden geïntroduceerd door langdurige monstervoorbereiding en een vakman nodig om de monsters te bereiden, en de beelden te analyseren en te interpreteren. Optische microscopie biedt de voordelen van een eenvoudigere monstervoorbereiding en de toepassing van meerdere labels met relatief gemak in vergelijking met elektronenmicroscopie. Met fluorescerende eiwitten en kleurstof conjugaten, de mogelijkheid om levende cellen te bestuderen met fluorescentie microscopie is ook mogelijk. Met verbeteringen in stabiliteit en fluorescerende fluorofoor eiwitgrootte / die leidt tot celtoxiciteit, alsmede vooruitgang afgenomen cameradetectie technologie, fluorescentie microscopie met behulp van wide-field en confocale beeldvormende systemen is aanzienlijk uitgebreid onze kennis van de ruimtelijke dynamiek van cellen. Met behulp van deze technieken, is onze kennis van de bacteriële cel in de afgelopen 20 jaar sterk ontwikkeld tot een veel meer gedetailleerde weergave die een hoge mate van structurele en eiwit organisatie binnen de bacteriële cel ¹ openbaart.

Echter, conventionele werkwijzen optische microscopie diffractie beperkt, waardoor de inherente resolutie is ongeveer de helft van de golflengte van het excitatielicht worden gebruikt. Zelfs met de meest optimale conventionele optische microscopie systeem de beste laterale resolutie is ongeveer 220-250 nm en de axiale resolutie is ongeveer 500 nm (zie voor Schermelleh et al. ^2). Voor bacteriële cel biologen in het bijzonder, dit nog steeds ernstig ons begrip van de ruimtelijke organisatie van deze kleine cellen beperkt; het zijn slechts 1-2 micrometer in diametereter en 1-10 micrometer in lengte. Er is ook behoefte aan hogere resolutie technieken die kunnen worden uitgevoerd op levende cellen waarin dynamisch ruimtelijk gedrag van een eiwit kan worden geanalyseerd om te vullen in vitro data.

In de afgelopen tien jaar hebben een aantal super-resolutie fluorescentie imaging technieken ontwikkeld. Super-resolutie microscopie beschrijft beeldvormende technieken die ten minste het dubbele van de laterale resolutie verkrijgbaar met conventionele lichtmicroscopie, waardoor het diffractie barrière overwinnen. Deze technieken manipuleren verlichting en / of analyse van het uitgestraalde licht werkelijke toename in de schijnbare resolutie maken. Er zijn drie hoofdtypen van super-resolutie technieken - i) gestimuleerde emissie uitputting microscopie ³ (STED); ii) single-molecule lokalisatie microscopie, met inbegrip van technieken zoals fotoactivatie lokalisatie microscopie ^4,5 (PALM), stochastische optische reconstructie microscopie ^{6 (STORM), directe STORM 7 (dSTORM), en de grondtoestand uitputting met individuele molecuul terugkeer 8 (GDSIM); en iii) gestructureerde verlichting microscopie 9-12 (SIM). Single-molecule lokalisatie technieken bieden de grootste stijgingen in laterale resolutie, tot tussen de 10-40 nm in biologische monsters. In veel implementaties van single molecule lokalisatie microscopie wordt monsternemingsdiepte beperkt tot de uitdovende golf en de eerste implementaties van STED zijn ook beperkt in de bemonsteringsdiepte. De recente ontwikkelingen zoals het gebruik van adaptieve optiek exploitatie van astigmatisme in de functie punt verspreiden op verschillende brandpunten, multi-plane detectie en middels twee doelen de axiale positie van het uitgezonden licht afleiden gezien verbeteringen in zowel de axiale diepten resolutie en sampling in zowel STED en single molecule lokalisatie 13,14. Data-acquisitie tarieven voor STED en single-molecule lokalisatietechniekenzijn ook relatief traag vanwege het grote aantal beelden die moeten worden verworven voor de maximale resolutie (tot 50.000 voor lokalisatie technieken). Deze langzame data acquisitie leent zich niet voor de beeldvorming van levende monsters zonder aangepaste modificaties dat vaak vrij duur. Deze twee technieken zijn momenteel optimaal geschikt voor vaste monsters (voor een overzicht zie 2,15), echter veel werk wordt gedaan om deze beperking te pakken.}

Drie dimensionale gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM) is een wide-field techniek die zowel laterale en axiale resolutie resulteert in een resolutie van ongeveer 110 en 280 nm, respectievelijk verbetert. Monsternemingsdiepte tot 30 urn van het dekglaasje, waardoor beeldvorming van gehele cellen. De variatie van de 3D-SIM ontwikkeld door Sedat, Agard, en Gustaffsson op de optische microscoop eXperimental (OMX) platform gaat de verlichting van het monster met een bekend patroon raster dat in 15 verschillende bewogen wordtposities in elke zvliegtuig ^9-11. De franjes in de resulterende moirépatronen die zijn gemaakt in de frequentie ruimte buiten het waarneembare gebied worden gemeten. De informatie van de frequentieruimte is computationeel gereconstrueerd tot een zichtbaar beeld super-resolution ^10,11 genereren. De relatieve snelheid waarmee de onbewerkte beelden kunnen worden verkregen met deze techniek maakt beeldvorming van levende cellen. Het is echter belangrijk op te merken dat voor de biologische processen die zich op een tijdschaal van seconden, de overname koers van de ruwe beelden is nog steeds te langzaam om dynamische veranderingen vast te leggen. Voor de tijd-serie met een opnamesnelheid van seconden, kan de herhaalde aankoop zonder voldoende hersteltijd leiden tot fototoxiciteit en fotobleking, vooral tijdens live-beeldvorming van kleine bacteriële cellen.

Om deze problemen te overwinnen, hebben recente ontwikkelingen voor snel 3D-SIM (F3D-SIM) ontwikkeld. Hier beschrijven we een zogenaamde OMX Blaze ¹⁶ dat ik wasntroduced eind 2011 Deze technologie maakt het patroon belichting zonder het gebruik van fysieke raster gebruikt als bij eerdere systemen. Het gebruik van storende lichtstralen en nieuwe shutter technologie zorgt voor de creatie van het patroon het licht op het monster in een zeer snelle manier. De snelheid van beeldopname werd verder verbeterd met de introductie van wetenschappelijke complementaire metaaloxide halfgeleider (scmos) camera's, vooral in vergelijking met de bestaande EMCCD camera. Deze veranderingen resulteerden in een mogelijke beeld acquisitie snelheid van een beeld per seconde voor een bemonstering diepte van 1 micrometer (512 x 512 pixels, 9 z-schijfjes), waardoor controle van dynamische veranderingen in cellen die zich voordoen binnen enkele seconden ^16. De daling van de schijnbare belichting (excitatie) maal levende cellen met deze methode maakt ook langere tijdreeks worden gevangen of een verhoging van de opnamesnelheid.

De toepassing van F3D-SIM microscopie Hier beschrijven wij examine de structuur en de dynamische beweging van de cytokinetic Z ring in de cellen twee bacteriesoorten: het staafvormige model organisme Bacillus subtilis en coccoïde menselijk pathogeen Staphylococcus aureus. FtsZ is een tubuline-achtige cytoskelet eiwit dat een belangrijke rol bij de celdeling in bacteriën ^17,18 speelt. Lokaliseert de verdeling plaats tenminste 20 andere verdeling eiwitten werven, die de verdeling inrichting ^17,18 en wordt beschouwd als de kracht voor cel vernauwing ^19-23 verschaffen. Deze methode blijkt dat FtsZ ongelijkmatig verdeeld rond de Z ring in beide organismen in een korrel-achtige regeling; oplossen van de lang gekoesterde vraag of de Z ring een continue uniforme riem rond de cel, zoals gevisualiseerd door conventionele wide-field fluorescentiemicroscopie of een discontinue structuur zoals voorgesteld door cryo-electron tomografie (ECT) ^24. We zien hoe het vermogen van 3D-SIM sterk kunnen verbeteren ruimtelijke onderzoek klein (1micrometer diameter) ronde cellen zoals S. aureus die verdelen in drie opeenvolgende loodrechte vlakken (x, y, z). Time-lapse studies deze technieken blijkt dat de structuur van de Z-ring is dynamisch, met bruto organisatie veranderingen in de ring, in plaats FtsZ moleculen in en uit een vaste steiger ^24.

Protocol

1 Monstervoorbereiding

1. Voorbereiding van B. subtilis Cells for Imaging
   1. Inoculeer 10 ml Penassay Broth (PAB, ook bekend als antimicrobiële Medium 3) met een enkele kolonie van B. subtilis stam SU570 (168 trpC2 ftsZ :: ftsZ-GFP-spec) ^16. Groeien 's nachts in een laag toerental (100 tpm) schudder bij 30 ° C.
   2. Verdun de overnacht cultuur 0,05 _A600 (absorptie bij 600 nm) in vers PAB bij 30 ° C met hoge snelheid (215 rpm) en schudden groeien tot mid-exponentiële fase (A ₆₀₀ -0,4).
   3. Voeg in een schroef bedekte glazen fles 2 g van elektroforese-grade agar in 100 ml 1x groeimedium (PAB). De agar in een autoclaaf. Dit kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele maanden, en correct de agarose smelten wanneer nodig. Laat bij kamertemperatuur stellen.
   4. Bevestig een lijm frame (65 ul capaciteit; zie Tabel van Materialen) op een standaard glass microscoop glijbaan. Om dit te doen, verwijder de dunne polyester plaat (elke lijm frame wordt gepositioneerd tussen twee polyester platen, een dunne en een dikke, en heeft het centrum plein verwijderd) en de lijm zichtbaar oppervlak van het frame op het oppervlak van het objectglaasje. Dit zorgt ervoor vierkant vormt bovenop de dia. Laat de dikke polyester blad bevestigd aan het frame als dit voorkomt het dekglaasje vast te houden in daaropvolgende stappen.
   5. Smelt de agarose-oplossing in een magnetron tot het kookpunt en de pipet 67 ul in de lijm frame. Onmiddellijk plaatsen een dekglaasje bovenop een vlak oppervlak te creëren en reactie bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten. Verwijder het dekglaasje voor 1-2 min, terwijl het monster wordt geoogst.
   6. Oogst van 1 ml aliquot van het monster en centrifugeer bij 5900 xg gedurende 30 sec. Schenk de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in 200 ul vers PAB.
   7. Neem 2,5 pi van het geconcentreerde monster en pipet op een pre-preparode agarose pad. Verspreid het monster gelijkmatig langs het platte vlak van de agarose pad. Verwijder de lijm frame van de microscoop dia met een pincet, terwijl niet de agarose pad te raken.
   8. Breng de agarose pad van de microscoop dia naar een diameter van 35 mm petrischaal met een glazen dekglaasje bodem. Inverteer de agarose pad zodat de celsuspensie en dekglaasje van de petrischaal in direct contact met elkaar. De bodem van de petrischaal heeft een brekingsindex van 1,525 voor hoge resolutie afbeelding.
2. Voorbereiding van Levende S. aureus Cells for Imaging
   1. Inoculeer 10 ml L-bouillon met een enkele kolonie van S. aureus stam SA94 (SH1000 met ploeg-FtsZ-GFP en pGL485; Erm ^r, Cm ^{r) 25.} Groeien 's nachts in een laag toerental (100 tpm) roterende schudder bij 37 ° C.
   2. Verdun de overnacht cultuur 0,05 _A600 (absorptie bij 600 nm) in vers L-bouillon met 0,05 mM IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) de productie van het fusie-eiwit te induceren.
   3. Incubeer bij 37 ° C met een hoge snelheid (215 rpm) schudden en te groeien tot medio exponentiële fase (A ₆₀₀ ~ 0.4).
   4. Volg de stappen 1.1.3 - 1.1.8 zoals beschreven voor B. subtilis levende cellen voorbereiding.
      Opmerking: Voeg de juiste concentratie van de inductor agarose oplossing in stap 1.1.3 voor stammen die een fluorescerend fusie-eiwit onder controle induceerbare expressie.

2 Voorbereiding van de microscoop

Deze methode maakt gebruik van een DeltaVision OMX (optische microscoop, experimenteel) 3D-SIM-imaging-systeem uitgerust met een Blaze module. Voor de experimenten beschreven, maar een laser en een camera gebruikt. De verlichting en lichtweg beschreven in figuur 1. Hierbij wordt verondersteld dat de microscoop over passende kalibratie optische transferfunctie (OTF)bestanden en licht collimatie onderhoud uitgevoerd.

1. Voor live-cell imaging experimenten, zorg ervoor dat de verwarming podium wordt gehecht aan de keramische podium en de doelstelling-verwarming kraag om de doelstelling (60X 1,42 NA olie objectief) is bevestigd.
2. Schakel de doelstelling en het stadium kachels minstens 4 uur voorafgaand aan de beeldvorming en langzaam opvoeren van de temperatuur op de gewenste waarde met een maximale snelheid van 5 ° C / uur. Het wordt aanbevolen om dit proces de avond voorafgaand beginnen beeldvorming en oprit bij 3 ° C / 4 uur. Voor live-cell experimenten met B. subtilis zijn de meeste experimenten uitgevoerd bij 30 ° C. Voor S. aureus, zijn alle experimenten uitgevoerd bij 37 ° C.
3. Op de dag van het experiment, schakelt het systeem ten minste 1 uur vóór beeldvorming om het systeem en lasers volledig stabiliseren. Laad de kleine schotel podium insert op de verwarmde podium om voor te verwarmen.
   1. Zet de master controller werkstation.
   2. Zet de beeldverwerking workstation.
   3. Zet de camera aan koeler op de vloer buiten de microscoop behuizing.
   4. Schakel alle scmos camera's (ook al zijn ze niet allemaal gebruikt).
   5. Binnen in de laser en elektronica behuizing, schakelen:
      1. Instrument controller chassis.
      2. Nanomotion chassis.
      3. Jena controller voor de Z piëzo.
      4. Alle 4 galvo motor controllers.
      5. Primaire laser controle module.
      6. Secundaire laser controle module.
      7. Alle camera werkstations.
      8. OMXIC werkstation.
   6. Op de master controller werkstation, opent u de OMX-software door te klikken op het pictogram. Stel het pad voor het opslaan van gegevens op een geschikte data-map.
   7. Om de hardware te initialiseren, ga naar het menu Hardware, kies Hardware en klik op de knop Herstart Hardware. Sluit het venster.
   8. Start de softWoRx software.Turn op de voor de experimenten lasers (488 nm).
   9. Zet de sleutelschakelaar voor de laser veiligheidsvergrendeling.
   10. Zorgen voor de juiste dichroic filter lade onder het objectief geplaatst. Voor GFP is de standaard (of vaste) lade.
   11. In OMX SF, ga naar het menu Bestand, kies Instellingen en selecteer de Vaste lade uit de lade dropdown menu. Sluit het venster.
   12. Het volgende doen vanuit het hoofdscherm van de software, in de sectie Light Parameters:
       1. Activeer de juiste camera voor de excitatie laser-en emissie-filter (FITC) camera uit het Kanaal selectie.
       2. Controleer het beeld is ingesteld op Sequential.
       3. Controleer het lichtpad is ingesteld op SI.
       4. Controleer of de modus is ingesteld op 95 MHz.
       5. Controleer de 488 laser is geselecteerd in de opwinding.
       6. Zet de Maat 512 x 512 voor het raam grootte en Binning tot 1 x 1.
   13. In het tabblad Experiment, zorgen Type is ingesteld op SI uit het dropdown menu.
   14. Zorgen Sectioning is geactiveerd en dat de optische sectie afstand is ingesteld op 0.125.
   15. Zorgen scherpstelpunt als een scan begint is midden.

3 Image Acquisition

1. Breng een druppel olie op de top van de doelstelling. Bij 37 ° C, de aanbevolen uitgangsolie een brekingsindex van 1,518 te passen aan de brekingsindex van het gelkussen gebruikt om de bacteriële cellen zet bij 37 ° C (zie stap 1.1.3).
2. Het monster petrischaal met de geprepareerde cellen in de fase inzet en bedek met de cirkelvormige verwarming deksel. Verlaag het podium tot de olie raakt de onderkant vanhet monster petrischaal.
3. Laat de schaal warmte-evenwicht gedurende 15 min in fase. Met behulp van een lage belichting instelling van 5 msec of minder (zich in het Licht Parameters), richten zich op het monster met behulp van de nano-positionering podium controles (DZ, zich in het Nano Positioning). Focus en neer door het monster te bepalen of het licht gelijkmatig verspreid boven en onder het monster focal plane. Als de puntspreidingsfunctie is zelfs (sferische aberratie) Reinig de bodem van de schaal voor monsters en het doel met chloroform. Vervang de olie en herhaal deze stap totdat er een geschikte match wordt gevonden tussen de olie en het monster brekingsindex om sferische aberratie te minimaliseren.
4. Met behulp van 0,5 micrometer dZ stap maten, markeer de boven-en onderkant van het beeld stack. Terug naar het midden van het monster. Klik op de knop Get Dikte in het tabblad Experiment om het monster te verkrijgen dikte in te stellen. Keep de stapelhoogte tot een minimum beperkt, terwijl voorzichtig om niet afgesneden van de boven-en onderkant van de Z-ringen. Typische diktes voor B. subtilis monsters 2-3 micrometer.
5. Bepaal de maximale intensiteit waarde (Max) van het beeld van het monster met de huidige belichting en% T-instellingen. Deze waarde wordt onder de afbeelding venster gevonden. Voor time-lapse imaging, pas de belichting en% T om een maximale intensiteit van 1.100-1.400 boven de achtergrond voor het beeld te verkrijgen. Een minimale lichtsterkte van 1000 boven de achtergrond is nodig om het reconstructie te verkrijgen. Voor het een eenmalige, verhoging van de maximale intensiteit naar 4000-5000.
6. Activeer de Time-lapse sectie op het tabblad Experiment. Stel de gewenste frame rate en de totale tijd. In Data File, voer een juiste bestandsnaam. Klik op de knop Uitvoeren om het beeld acquisitie beginnen.
   Let op: Afbeelding overname is voltooid wanneer de green voortgangsbalk is afgewerkt en een log-bestand wordt weergegeven voor het instellen van de juiste data map data.

4 Controle van Data Quality

1. Aan het begin van het beeld acquisitie, let op de maximale intensiteit waarde van het beeld aan het begin van het beeld acquisitie voor het eerste frame van de tijdreeks. Aan het einde van de verkrijging van het eerste raster, controleer dat er niet meer dan een 10% afname in signaalintensiteit via de z-stack voor dit eerste beeld is. Als er meer is dan dit niveau van fotobleken in het eerste tijdstip, worden de gegevens via de tijdreeksen van onvoldoende kwaliteit zijn voor analyse en de tijdreeksen overname kan worden gestopt.
2. Aan het einde van de overname van de tijdreeks, opent u de resulterende ruwe beeldbestand met .dv achtervoegsel en zich vergewissen van de afname van de maximale intensiteit van het signaal van het begin van de tijdreeks tot het uiteindelijke beeld. Gooi alle tijdstippen waar er heeft been meer dan 30% fotobleking.

5 Reconstructie 3D-SIM-beelden

1. Vanuit het menu Proces, activeer het venster SI Wederopbouw. Gebruik maken van de reeds bestaande instellingen voor alle parameters.
2. Activeer de optie Channel Specifieke OTF knop, en ingesteld op de standaard filter set. Activeer de optie Channel Specifieke KO hoeken drukken en ingesteld op de standaard filter set.
3. Sleep de ruwe (.dv) bestand in de Input-bestand ruimte. Klik op Doe het. De output bestand zal dezelfde naam hebben als het input-bestand met _SI toegevoegd aan het einde.
   Opmerking: Dit proces van wederopbouw kan worden uitgevoerd als een taak met de functie Task Builder in het menu Proces als er meerdere bestanden worden verwerkt.

6 Gegevens exporteren en Analyse

1. Gebruik Imaris om 3D-beelden te visualiseren in overtreffen modus en export beeldgegevens als tiff (300 dpi) of avi-bestanden (geen compressie). Grootte metingen in Imaris kan worden uitgevoerd met behulp van de metingen instrument overtreffen modus.
2. Het genereren van 3D-intensiteit percelen van de Z-ring van 3D-SIM beeldgegevens:
   1. Onderzoekt de distributie van FtsZ om de Z-ring en 3D intensiteit plots creëren
      1. Open een 3D-beeld-bestand op de individuele z-schijfjes te bekijken. Gebruik de volume kijker hulpmiddel onder het tabblad weergave menu om een ​​regio van belang te snijden.
      2. Voer het venster nummer voor dit beeld 3D in het invoervenster en voer een nieuwe en ongebruikte venster nummer in de output venster. De selecte regio knop komt beschikbaar aan een individu Z ring van belang bijsnijden van de originele 40 × 40 micrometer gezichtsveld.
      3. Stel de gewenste as en de mate van rotatie in het tabblad rotatie. Klik op de Do It-knop. Blader door het volume op het gewenste perspectief van de Z-ring te verkrijgen.
      4. Gebruik de gegevens inspecteur gereedschap en pas tHij kolom / rij dimensies naar een nieuwe regio van belang te creëren rond een individu Z ring. Klik op het midden van het beeld aan dit nieuwe gebied van belang positioneren. Het beeld tekstgegevens een automatisch gegenereerde tabel die de fluorescentie-intensiteit van elk pixel in het gebied van belang weergeeft.
      5. Klik op de 3D-grafiek knop om de intensiteit plot aanvankelijk bekijken.
      6. U kunt ook tekst in het plaatje gegevens kunnen worden geëxporteerd door te klikken op het redden tabelgegevens knop in het menu bestand.
      7. Kopieer de beeldgegevens van het opgeslagen tekstbestand in een nieuwe spreadsheet. Selecteer alle cellen in de spreadsheet en een nieuwe 3D-Surface grafiek. Formatteer de 3D intensiteit plot grafiek voor publicatie.
   2. Voor time-lapse gegevens herhaal stap 6.2.1.1 - 6.2.1.7 op elk van de verschillende tijdstippen van het 3D-beeld-bestand.
3. Tracking Gemiddeld Fluorescentie intensiteit over Tijd
   1. Gebruik de afbeelding tekst gegevens naar de fluorescen volgence intensiteit in de tijd in een van belang.
   2. Selecteer de cellen die overeenkomen met het gebied van belang.
   3. Bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteit op elk tijdstip voor deze streek plaats.
   4. Gebruik de gemiddelde fluorescentie-intensiteitswaarden een aparte lijngrafiek genereren.

Resultaten

In deze studie gevisualiseerd we de bacteriële celdeling eiwit FtsZ, uitgedrukt in levende cellen als FtsZ-GFP-fusie, de krachtige voordelen van F3D-SIM illustreren opzichte van conventionele fluorescentiemicroscopie voor het bestuderen bacteriële eiwit lokalisatie en dynamiek. FtsZ is een tubuline-achtige cytoskelet eiwit dat polymeriseert in een dynamische ringstructuur rond de omtrek van de cel. De Z-ring heeft een belangrijke functie bij de celdeling: de assemblage markeert de toekomstige locatie van sector, het werft allemaal celdelingeiwitten deze site, en Z ring vernauwing lijkt de kracht te bieden aan binnenwaartse beweging van de celwand toe tijdens cytokinese ^{17 , 18.}

Wanneer gevisualiseerd door gebruikelijke wide-field fluorescentie microscopie, wordt de Z ring als een transversale band van fluorescentie in staafvormige bacteriën, waaronder de meest bestudeerde organismen zoals B. subtilis (Figuur 2A), E. coli en C. crescentus. Belangrijker lijkt de fluorescentie-intensiteit in deze band min of meer uniform zijn, en de lokalisatie patroon biedt zeer weinig inzicht in de structurele organisatie en de verdeling van FtsZ polymeren binnen de Z ring. Wanneer dezelfde cellen onderzocht met de F3D-SIM hier beschreven (figuur 2B), maar de voordelen van deze techniek onmiddellijk duidelijk. Ten eerste rotatie van de 3D-SIM beeld om de z-as maakt visualisatie van de Z ring als een echte ringstructuur in de driedimensionale ruimte (Figuren 2C en 3A). Samen met de toename van de resolutie, het blijkt dat de verdeling van FtsZ in de Z ring is in feite zeer heterogeen (figuur 3). De verbetering van de resolutie stelt ons ook tot Z ringen die zijn begonnen met het proces van vernauwing om een ​​divisie septum (aangegeven door de invaginatie van de celmembraan in vormen te zien figuur 2C en 2D).

Bijkomende voorbeelden van B. subtilis Z rings gevisualiseerd door deze techniek worden getoond in Figuur 3BI - 3Biv en illustreren hoe de fluorescentie-intensiteit rond de Z ring nooit hetzelfde. Bovendien zijn gebieden zeer lage fluorescentie-intensiteit vaak waargenomen. We verwijzen naar deze regio's als hiaten (witte pijlpunten). We nemen deze gaten in 15% van alle Z ringen onderzocht (n = 84) en overwegend Z ringen met een diameter van 800 - 900 nm (93%). Om deze waarnemingen te kwantificeren, werden 3D intensiteit plots gemaakt van de Z-ring en worden getoond in Figuur 3CI en 3Cii met de Z ringen getoond in figuren 3Biii en 3Biv. De intensiteit plots tonen dat gewoonlijk de hoeveelheid fluorescentie in de Z ring kan tot 3 variëren - 4 vouw in verschillende gebieden van het B. subtilis Z ring. Verder is de 3D plots intensiteit blijkt dat de gaps van fluorescentie in de Z-ring bijna lezen uitgangswaarden van achtergrond fluorescentie (zwarte pijl in figuur 3CI). De bovenstaande voorbeelden geven goede reconstructies van de Z-ring en zijn afhankelijk voldoende licht wordt geëmitteerd vanuit het monster zonder significante fotobleken. Dit wordt bereikt door de helderheid van het GFP gefuseerd aan FtsZ fluorofoor en de overvloed in de cel onder deze omstandigheden (hoge signaal-ruisverhouding). In andere cellen waarin de signaal-ruisverhouding laag is de reconstructie van het beeld is slecht. Om dit te voorkomen met FtsZ-GFP, het bedrag van de emissie signaal opgevangen vanuit de B. simuleren subtilis cellen werd verminderd door verlaging van de excitatie-energie. Zoals getoond in figuur 3D een 100-voudige verlaging van excitatie energie resulteert in een afbeelding van de Z-ring die significante artefacten heeft. Dit gebeurt als gevolg van onvoldoende lokaal contrast tussen de FtsZ GFP-signaal en de achtergrond die tot poor reconstructie van het beeld.

Interessant B. subtilis Z ringen toonde duidelijker leemten en heterogeniteit in de bovenste en onderste gebieden van de ring, maar niet in de zijkanten van de ring (Figuur 3B). Dit komt door het verschil in resolutie bij deze variant van 3D-SIM in het laterale vlak tegenover het axiale vlak. Dit resulteert in de bovenste en onderste gebieden van de Z ring (zijvlak) wordt afgebeeld met optimale resolutie. De gaten in de Z-ring te klein te detecteren in de zijkanten van de Z ring zoals gevisualiseerd in het axiale vlak, waarvan ongeveer de helft van de resolutie van het laterale vlak heeft. Bacteriën die een coccoïde morfologie, zoals S. aureus, een Z-ringen die zijn gepositioneerd in alle gebieden. Dus de beeldvorming van de Z-ring wanneer het ligt in het zijdelingse vlak (of dicht bij het) biedt de mogelijkheid om de afbeelding alle regio's van de ring met een optimale resolutie. Gebruikmakend van deze, onderzochten we de structuur vande Z-ring in levende S. aureus cellen, onder toepassing van een stam die een plasmide-dragende een ftsZ-GFP-fusie bevat. Productie van deze fusie onder de regeling van een P _spac induceerbare promoter (zie stap 1.2.1). Bij afgebeeld met in axiale vlak, S. aureus Z ringen identiek bleek B. subtilis Z ringen die zich in hetzelfde vlak (figuur 4ai) zijn. Echter, imaging Z ringen in het zijdelingse vlak bevestigd dat de hele Z-ring verscheen zowel kraal-achtige en heterogeen. Ongeveer 26% van deze ringen vertoonden heb een zichtbare "gap" van fluorescentie (figuur 4Aii, 4B). Vergelijkbaar met B. subtilis FtsZ, fluorescentie-intensiteit plots tonen dat de fluorescentie-intensiteit in de Z ring varieert zoveel 4-6 vouw in verschillende gebieden van de S. aureus Z ring (Figuur 4C).

De lengte en breedte van de korrels kan worden gemeten (zie schema in figuur 4D). Hieruit bleek dat 80% van de Z ringen (n = 43) die werden onderzocht hadden een kraal lengte van 200 nm, met een maximum lengte van 400 nm. De breedte kralen, anderzijds, gemeten tot 200 nm. Er was gemiddeld 12 ± 2 (SEM) FtsZ kralen per Z-ring. Vergelijkbare lokalisatiegegevens werd waargenomen wanneer inheemse FtsZ niet werd gevisualiseerd met deze methoden met behulp van immunofluorescentie microscopie (IFM) waaruit blijkt dat deze heterogene en kraal-achtige lokalisatie patroon was oprecht en niet een artefact veroorzaakt door expressie van ftsZ-GFP naast inheemse FtsZ (data getoond). Deze vooruitgang van de 3D-SIM is in staat aan te tonen dat de Z-ring verschijnt als een heterogene structuur en is misschien wel discontinu in de natuur.

Om de vraag hoe deze heterogene Z-ringstructuur ondergaat vernauwing en vergemakkelijkt celdeling pakken, kan een time-lapse analyse van Z ring dynamiek uitgevoerd. Een van de belangrijkste uitdagingen metfluorescentie microscopie time-lapse studies is in het minimaliseren van het monster fotobleken en fototoxiciteit tijdens de beeldvorming. 3D-SIM vereist een groot aantal ruwe beelden te verkrijgen waardoor fotobleken van een monster in de tijd leidt tot een slechte signaal-ruisverhouding leidt tot onvoldoende signaal dat beelden reconstructies mogelijk. De toepassing van de nieuwe technologie minimaliseert de hoeveelheid excitatie energie voor elke opname en derhalve een verlaging van de energie die in de levende cellen. Het doet dit door een combinatie van lichtbundel interferometrie de gestructureerde patroon op het monster en het gebruik van wetenschappelijke CMOS camera's die gevoeligheid en quantum efficiëntie creëren. Deze combinatie resulteert in z-stack verwerving van 1 micrometer per seconde (512 × 512 pixels x 8 z-schijfjes) tegenover 1 urn per 5-8 sec (512 x 512 pixels x 8 z-schijfjes) verkregen met onze vorige iteratie van 3D-SIM (in Riglar e.a.. ²⁶ beschreven).Het verlagen van de afbeelding overname tijd en belichting kan ook helpen bij het minimaliseren fototoxiciteit van levende cellen, die met name relevant in time-lapse studies. De nieuwe technologie hier gepresenteerde lost ook een ander probleem in de live-cell imaging waar wij naar verwijzen als 'motion blur', die in deze context verwijst naar de lokalisatie van eiwitten veranderen tijdens beeldopname. Door het verlagen van het beeld acquisitie tijd het bedrag van 'motion blur' geminimaliseerd waardoor een meer accurate afbeelding reconstructie.

Eerdere studies die zijn gericht hoe FtsZ is georganiseerd binnen de Z-ring niet hebben kunnen laten zien hoe Z ringstructuur veranderingen in de tijd geweest. Om dit aspect te onderzoeken voerden we time-lapse met F3D-SIM. Dit stelde overname een 3D-SIM beeld van de Z-ring in B. van subtilis elke 5-10 sec gedurende 50 sec, die eerder niet mogelijk was deze tijdschaal. Weergegeven in figuur 5A is een example van de snelle veranderingen in FtsZ distributie binnen de Z-ring in de tijd (met een diameter van 890 nm). Andere Z ringen die zichtbaar in het proces van beklemming waren bleken ook soortgelijke dynamiek die de verdeling van FtsZ om de Z-ring betrokken zijn (niet getoond). 3D intensiteit plots kunnen worden gegenereerd voor elk van de tijdstippen te kwantificeren en waarderen de continue fluorescentie-intensiteit verandert, zodat de relatieve abundantie van FtsZ in verschillende gebieden van de Z ring op een tijdschaal van seconden (Figuur 5B). Regio's van belang kan worden geïdentificeerd uit deze intensiteit percelen aan de schommelingen van de fluorescentie-intensiteit (figuur 5C) volgen. Het volgen van deze veranderingen in de Z ringstructuur onder deze omstandigheden zou nagenoeg onmogelijk zijn zonder de geavanceerde F3D SIM-technologie. Bovendien, dit werk onthulde dat S. aureus de dynamische beweging van FtsZ is vergelijkbaar met die waargenomen in B. subtilis. S. aureus RN4220 pr cellenoducing FtsZ-GFP werden afgebeeld 50 sec bij 10 sec tijdsintervallen. Wijzigingen in de heterogeniteit van de Z ring in S. aureus met F3D-SIM waren ook gelijkwaardig aan B. subtilis (zie pijlpunten en pijlen in figuur 6). Deze time lapse studies ondersteunen een model van de Z-ring vernauwing (de iteratieve knijpen model) die werd voorspeld door onderzoek van vaste C. crescentus cellen, maar kon niet worden aangetoond vanwege de noodzaak Z-ring dynamiek in levende cellen te ²⁷ onderzoeken.

Figuur 1 Schematische voorstelling van de optische configuratie van de F3D-SIM gebruikt in deze studie. Laserlicht uit de laser tabel wordt via een SIM vezel een collimatorlens en raspen vastgesteld dan in de fase regeleenheid dat zowel de golflengte specifieke creëert optimale afstand of de ± 1 ^e orde balken van de nulde orde centrale balk en de fase stappen voor de SIM-collectie. De balken en voer vervolgens de hoek controle module waar de stralen worden gereflecteerd op de 3 verschillende clusters om de 3 lichtinvals- creëren. De balken en voer vervolgens de microscoop en lichtpad zoals afgebeeld (Gewijzigd met toestemming van Paul Goodwin, API).

Figuur 2 Vergelijking van conventionele wide-field fluorescentie en 3D-SIM beeldvorming van B. subtilis cellen die ftsZ GFP. (A) Conventionele breedveld fluorescentie beeldvorming van B. subtilis cellen die ftsZ-GFP (SU570; groen) als een enkel exemplaar werden ook gekleurd met het membraan kleurstof FM4-64 (rood). Schaal bar = 5 urn. Het beeld werd verkregen met behulp van een rechtop fluorescentiemicroscoop.(B) 3D-SIM beeldvorming van dezelfde B. subtilis stam die ftsZ-GFP, gekleurd met FM4-64. Gebieden van belang uit het beeld kan worden geselecteerd (gestippelde kader) om in te zoomen. Het beeld kan ook worden geroteerd rond de z-as naar 3D FtsZ ringen te bekijken in het axiale vlak. (C, D) Het verwijderen van de out-of- focus light en verbeterde resolutie afbeelding geleverd door 3D-SIM maakt duidelijke visualisatie van Z ringen (inclusief diegene die bij vernauwen) en de binnenste celmembraan tijdens divisie (aangegeven met witte pijlen). Merk op dat het protocol tekst beschrijft de visualisatie van een enkele fluorofoor. Echter, kan de procedure worden aangepast voor het verkrijgen van maximaal vier verschillende golflengten tegelijk. Dit cijfer is herdrukt van Strauss et al ^16.

Figuur 3. Representatieve beelden van de Z-ring in levende staafvormige bacteriële cellen (B. subtilis) uiten FtsZ-GFP met behulp van 3D-SIM. (Ai) De Z ring wordt waargenomen als een band van fluorescentie loodrecht op de lengteas van de cel die in het xy vlak. (Aii) Het beeld wordt geroteerd rond de z-as met Imaris 3D visualisatie software (zie protocol stap 6.1), zodat men op zoek is via de ringstructuur om duidelijk te zien hoe FtsZ wordt verdeeld binnen de Z-ring. Het beeld nu in het zx vlak toont dat de ring een ongelijkmatige verdeling van FtsZ met regio's die geen of zeer weinig fluorescentie (witte pijlen). De afbeelding moet worden gedraaid om deze 'gap' regio's van fluorescentie te observeren. Bi-Biv tonen verdere voorbeelden van gedraaide Z ringen die nu in de zx vlak liggen. Z ringen (Bi-iii) een diameter van ~ 0.9 pm. (BIV) toont een Z ring met een diameter van ONLy 0,65 urn ondergaan vernauwing. (Ci) Deze typische 3D intensiteitprofiel illustreert de fluorescentie-intensiteit (bijvoorbeeld concentratie) verschillen FtsZ-GFP om de Z-ring met een diameter van 0,85 urn (zie protocol stappen 6.1-6.3). De mate van fluorescentie in deze spleten laag en zal de achtergrond fluorescentie niveaus (zwarte pijl). (CII) Een vergelijkbaar 3D intensiteitprofiel van Z ring in het proces van beklemming. FtsZ GFP-concentratie is ook niet uniform; diameter, 0,65 urn. Panelen A, hebben B, CI en Cii herdrukt van Strauss et al ^16.

Figuur 4 Vertegenwoordiger 3D-SIM beelden van S. aureus cellen produceren FtsZ-GFP. Omdat deze cellen zijn rond (kokken), zal de Z-ring have verschillende oriëntaties. Cellen die een band van fluorescentie in de normale stand voor weergave tonen (dat wil zeggen, in het xy vlak) zoals in (Ai), lijken erg op die van staafvormige cellen bij rotatie rond de Z-as als bij figuur 1ai. In (Aii) de Z-ring is al in het xy-vlak; laterale oriëntatie en resolutie is maximaal de gehele ring die nu geeft een kraal structuur (B). (C) Een 3D intensiteit grafiek van de relatieve abundantie van FtsZ-GFP in de Z ring. (D) Schematische weergave van de S . aureus Z ring. Rode pijlen geven kraal lengte en breedte afmetingen (zie protocol stap 6.1). Dit cijfer is gewijzigd van Strauss ea ^16.

Figuur 5 F3D-SIM maakt een snelle analyse van FtsZ lokalisatie na verloop van tijd in 3D-SIM. (A) Veranderingen in FtsZ-GFP distributie binnen de Z-ring in staafvormige B. subtilis cellen kunnen worden gevisualiseerd aan de dynamiek van de ring aangeven. (Sec) is aangegeven op de linkerbovenhoek van elke afbeelding. (B) 3D-fluorescentie-intensiteit plots tonen de niet-uniforme en dynamische verdeling van FtsZ in de Z-ring. (C) FtsZ dynamiek (FtsZ-GFP-fluorescentie veranderingen in de ring) kan ook nader worden onderzocht door het kwantificeren van fluorescentie-intensiteit in de tijd in twee gebieden plaats. Dit cijfer is herdrukt van Strauss et al ^16.

Figuur 6 F3D-SIM time-lapse beelden tonen de veranderingen in FtsZ lokalisatie binnen de ring na verloop van tijd in S. eenureus. Een witte pijl duidt een opening wanneer het eerst wordt gedetecteerd in de Z-ring. Het verschijnen en verdwijnen van gaten op dezelfde positie (zoals aangegeven door de witte pijl) in de tijd illustreert hoe FtsZ herverdeeld om de Z-ring. Witte pijlen geven de vorming van gaten in de Z ring op latere tijdstippen. (Sec) wordt weergegeven op de bovenste linkerkant van de foto. Dit cijfer is gewijzigd van Strauss ea ^16.

Discussie

Fluorescente live-cell imaging is een krachtig hulpmiddel dat de observatie van de dynamische veranderingen in de cellen na verloop van tijd mogelijk maakt. Levende beeldvorming van bacteriële celbiologie is uitdagend vanwege de kleine celgrootte en verminderd vermogen van de bacteriecellen op herhaalde blootstelling aan excitatielicht weerstaan. F3D-SIM heeft de tools die beschikbaar zijn voor alle celbiologie ondervragen uitgebreid, maar is het noodzakelijk om zorgvuldig uit te voeren deze techniek als artefacten kunnen worden ingevoerd als slecht geïmplementeerd. Er zijn een aantal belangrijke overwegingen voor het succesvolle gebruik van deze techniek. Omdat het een wide-field fluorescentie imaging methode die berust op het gebruik van de puntspreidingsfunctie van het uitgestraalde licht, brekingsindex mismatch en sferische aberratie van het uitgezonden licht moet worden vermeden om accurate beeldreconstructie inschakelen. Het gebruik van dekglaasjes van 0,17 mm dikte een hoge kwaliteit variatie van signaalintensiteit voorkomen door glasdikte variabiliteit in de dekkinglip wordt sterk aanbevolen. Het is uiterst belangrijk om de sferische afwijking van het uitgestraalde licht zorgvuldig beoordelen tijdens de eerste stadia van alle experimenten en pas de immersie olie brekingsindex indien nodig. Dit kan variëren van dag tot dag als het afhankelijk is van zowel de temperatuur als de fixeermiddelen / substraat van het monster. Het gebruik van de onjuiste olie leidt tot inferieure reconstructie van de beelden met artefacten zoals halo en echosignalen.

Aan het einde van het beeldreconstructie proces voor elke fase een maat voor de kwaliteit van de reconstructie kan worden verkregen door de "best fit Ko angle" voor elke fase / hoek van de verlichting. Als deze waarde onder 1 voor elke hoek dan de kwaliteit van de gereconstrueerde zal zeer waarschijnlijk hoog. Als deze waarde dan 6, is het waarschijnlijk dat het gereconstrueerde beeld artefacten bevatten. Voorkomende artefacten omvatten i) het verschijnen van strepen in het beeld dat overeenkomteen van de hoeken van het raster. Dit kan het gevolg zijn van lagere signaal van dat rooster hoek; ii) haloing rond structuren. Dit kan van zeer ongelijke niveaus van signaal van heldere structuren vergeleken met omringende elementen een mismatch van de brekingsindex van de olie en het monster of kan het gevolg zijn van de structuur van het beeld al te amorfe en bevatten weinig "structuur" te erkend door het algoritme; iii) "grindnesten 'ten gevolge van een lage signaal-ruisverhouding in het beeld, gewoonlijk door hoge achtergrondsignaal; iv) structuren die zijn uitgerekt / langwerpige in xy waarin gevolg kan zijn brekingsindex mismatch olie en sample. Dit artefact is moeilijk te onderscheiden van een onervaren gebruiker. Het wordt aanbevolen om nieuwe gebruikers te raadplegen een ervaren SIM-onderzoeker voor advies over image interpretatie en analyse bij het starten van deze techniek te gebruiken.

Zoals met alle fluorescente live-cell imaging experimenten, het is important zorgvuldig evenwicht de excitatie energietoevoer teneinde de mate van fotobleken en fototoxiciteit van de cellen met voldoende emissiesignaal nodig om beelden te reconstrueren met minimale artefact minimaliseren. Overmatige fotobleken (meer dan 30% in een enkele z-stack overname) zal leiden tot een striping patroon in het gereconstrueerde beeld. Met het gebruik van scmos camera's, kan super-resolutie beelden met succes worden gereconstrueerd op basis van RAW-afbeeldingen met emissie-signaal zo laag als 1.000 tellingen boven de achtergrond. Dit kan zorgen voor zeer korte belichtingstijden waardoor photobleaching verminderen en het mogelijk maken snel vastleggen voor elk frame. Het verhoogt ook de hoeveelheid tijd tussen de frames voor cellen om te herstellen van de excitatie energietoevoer. Bovendien, aangezien de opnametijd voor elke lijst zeer kort kan zijn, de mate artefacten geïntroduceerd door "motion blur" tijdens een individueel opname wordt gereduceerd met gebruik van deze methode.

Deze variatie van 3D-SIM biedt een aantal andere voordelen ten opzichte van andere beschikbare super en hoge-resolutie imaging technologieën voor live-imaging door bacteriële cel biologen. De 2 voudige toename in resolutie 3-dimensioneel en de mogelijkheid om beeld tot 30 urn in een monster mogelijk maakt beeldvorming van hele bacteriën (en zoogdieren) cellen tijdens een experiment. Technieken zoals single-molecule lokalisatie die vaak worden uitgevoerd in de uitdovende golf kan de diepte van de penetratie niet bereiken in een monster en geen informatie over hele cellen niet bieden. Recente ontwikkelingen die hogere sampling diepten voor deze techniek toe kan resulteren in een betere axiale resolutie van hele cellen. Daarnaast single-molecule lokalisatie technieken die duizenden ruwe beelden te verwerven zijn ook beperkt in de framesnelheid die kunnen worden vastgelegd en kunnen compromis tussen capture framesnelheid en de uiteindelijke bereikte ruimtelijke resolutie vereisen, als de ruimtelijke resolutie nodig is afhankelijk van de aantal evegen opgenomen binnen een bepaalde ruimte. Vermindering van het aantal gemaakte opnamen zal resulteren in een lagere ruimtelijke resolutie, maar volstaan ​​om de temporele resolutie die voor het biologisch proces plaats bereiken. De hoeveelheid hersteltijd tussen frames mogelijk ook worden verhoogd tot fototoxiciteit in levende cellen waardoor de duur en frequentie waarmee tijdreeksen can be obtained beperkend minimaliseren. Hoge resolutie technieken zoals elektronenmicroscopie (EM) of elektronen cryotomography (ECT) bieden hogere resolutie dan 3D-SIM-kaart (en andere super-resolutie optische microscopie technieken), maar moet worden uitgevoerd op vaste monsters. De vaststelling en de verwerking kan artefacten introduceren en het ontbreken van etikettering kan de interpretatie bemoeilijken. Labelvrije ECT slecht contrast en kan sample indringdiepte van ongeveer 500-200 nm ²⁴ bereiken, dus zelfs als het eiwit van belang kan worden geïdentificeerd, kan de structuur van het eiwit in een volledige bacteriële cel kunnen worden waargenomen.Zelfs wanneer labeling kan worden gebruikt in EM, zoals bij immunogold, wordt de beeldvorming alleen plaats in 2D. 3D is alleen haalbaar met slijpplaatonderzoek en computationele reconstructie van de secties. De slijpplaatonderzoek vereist een ervaren technicus, maar kan problematisch zijn en leiden tot een artefact. Bij levende of gefixeerde cellen, ofwel 3D-SIM niet te worden ingebed in een specifieke wijze en cellen snel worden bereid voor beeldvorming in een bijna natieve toestand.

Deze werkwijze is relatief eenvoudig te implementeren door onderzoekers minimale ervaring in fluorescentiemicroscopie. Experimenten worden uitgevoerd in media die gezonde cel functie ondersteunen zolang het niet fluoresceert of genereren overmatige achtergrondsignaal. Voor bacteriële cellen, kan deze het gebruik van veel soorten complexe en minimaal medium of het gebruik van vaste of half-vaste media bacteriële celmotiliteit mogelijk. Veel biologen die al fluorescent proteïne (FP) fusies en de functionaliteit van de getestedeze fusies kan snel maken van deze technologie zonder verdere engineering en validatie van nieuwe fotoactiveerbare FP fusies. We vonden, als een algemene opmerking, dat S. aureus was gevoeliger voor fotobleking tijdens beeldvorming met FP fusies dan B. subtilis. Met behulp van onze oorspronkelijke 3D-SIM-methoden, waarbij het ​​rasterpatroon werd gegenereerd door een fysieke raspen, we waren niet in staat om live cell imaging uitvoeren met een aantal van S. aureus FP fusies. Echter, met deze geavanceerde F3D-SIM-methode, waren we in staat om deze afbeelding FP fusies en voeren korte tijdreeksen om de dynamiek van deze gelabelde eiwitten vast te leggen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de verminderde belichtingstijd nodig voor beeldvorming en meer tijd tussen frames voor celherstel.

OMX Blaze 3D-SIM is een commercieel beschikbare technologie die relatief eenvoudig kan worden geïmplementeerd in een laboratorium of een kern beeldvormende faciliteit. Zorg moet worden genomen om de techniek uit te voeren om te voorkomen artifeiten als gevolg van slechte monstervoorbereiding of slechte beeld vast te leggen. Zodra de techniek beheerst kan studies van eiwitstructuur en dynamica in kleine organismen zoals bacteriën worden uitgevoerd in enkele of meerdere kleuren fluorescentie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose I (Biotecnology grade)	AMRESCO	0710-500G	Gebruikt voor het maken van 2% agarose pads. Gebruik een magnetron om agarose in groeimedia op te lossen.
N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64)	Life Technologies	T-13320	Lipofiele kleurstof gebruikt voor het kleuren van celmembranen.
1.5 ml microtube, graduated Natural	Scientific specialties Inc.	1210-00	Gemaakt van Homopolymeer polypropyleen, gebruikt voor het verzamelen van bacteriële cellen voordat ze op agarose pads worden geplaatst voor visualisatie.
Luria bouillon basis, Miller	BD	241420	Bereid volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 2% agarose toe na het autoclaveren.
BBL Antibiotic assay broth, Antibioticum medium 3	BD	210932	Bereid volgens de instructies van de fabrikant.
Adhesive frame	Thermo-Fisher Scientific	ABGAB-0577	Bij dit bedrijf bekend als Gene Frame. Gebruikt voor het bereiden van 2% agarose pads (Afmetingen: 15 x 16 mm).
Microscope cover glass	Thermo-Fisher Scientific	111512-9	22 x 22 No. 1 Dikte
35 mm diameter Petri schotel met een glazen dekglasbodem	World precision instruments	FD35-100	Bij dit bedrijf bekend als FluoroDish. Schaal: Ø35 mm, Glas: Ø 23 mm, Glasdikte: 0,17 mm, niet pyrogeen
Chloramfenicol	Sigma-Aldrich	C0378-25G	Maak een 10 mg/ml voorraad in 95% ethanol.
Lincomycine hydrochloride	Sigma	L6004-5MU	Maak een 25 mg/ml voorraad in 50% ethanol.
Erytromycine	Boehringer Mannheim GmbH	12390120-14	Maak een 10 mg/ml voorraad in 95% ethanol.
Gecombineerde orbitale/lineaire schudwaterbad	Grant scientific Instruments	OLS-200	Schudsnelheid gebruikt voor culturen: 215 rpm
UV zichtbaar spectrofotometer	Shimadzu	UV-1601	600 nm golflengte werd gebruikt voor het meten van de optische dichtheid van bacterieculturen.
Centrifuge	Eppendorf	5415R	Pellets van bacteriecultuur werden verkregen door mid exponentieel groeiende culturen 30 seconden lang bij 8.000 rpm te centrifugeren.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Sigma	15502-10G	Bereid 1 M voorraad en filter steriliseer voor gebruik.
softWoRx software	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company	versie 5.0
Imaris data analyse software	Bitplane Scientific Software, Bitplane AG	versie 7.0.0	Matlab XTensions inbegrepen
DeltaVision OMX 3D-SIM beeldvormingssysteem voorzien van een Blaze module.	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company		Blaze module geplaatst op OMX V3
Staande fluorescentiemicroscoop	Zeiss Axioplan 2