Een methode voor het genereren van Pulmonale neutrofilie behulp Aerosolized Lipopolysaccharide

Samenvatting

We beschrijven een werkwijze voor het induceren neutrofiele longontsteking door uitdaging om vernevelde lipopolysacharide door verneveling, te modelleren acute longbeschadiging. Daarnaast worden fundamentele chirurgische technieken long isolatie, tracheale intubatie en bronchoalveolaire lavage beschreven.

Samenvatting

Acute lung injury (ALI) is een ernstige ziekte die wordt gekenmerkt door alveolaire neutrofilie, met beperkte behandelingsmogelijkheden en een hoge mortaliteit. Experimentele modellen van ALI zijn sleutel in het verbeteren van ons begrip van de pathogenese van de ziekte. Lipopolysaccharide (LPS) afkomstig van grampositieve bacteriën induceert neutrofiele ontsteking in de luchtwegen en longen parenchym muizen. Efficiënte pulmonaire afgifte van verbindingen zoals LPS is echter moeilijk te realiseren. In de hier beschreven aanpak wordt pulmonaire toediening bij muizen bereikt door uitdaging om vernevelde Pseudomonas aeruginosa LPS. Opgelost LPS werd verstoven door een vernevelaar aangesloten op perslucht. Muizen werden blootgesteld aan een continue stroom van LPS aerosol in een plexiglas doos gedurende 10 minuten, gevolgd door 2 minuten conditioneren nadat de aerosol werd beëindigd. Tracheale intubatie en daaropvolgende bronchoalveolaire lavage, gevolgd door formaline perfusie werd vervolgens uitgevoerd, die het mogelijk maakt karakterisering van de steriele pulmonary ontsteking. Aerosolized LPS genereert een longontsteking gekenmerkt door alveolaire neutrofilie, gedetecteerd in bronchoalveolaire lavage en door histologische evaluatie. Deze techniek kan worden ingesteld tegen een kleine prijs met weinig apparatuur, en vereist een minimale training en expertise. Het belichtingssysteem kan dus routinematig worden uitgevoerd bij elk laboratorium, met het potentieel om ons begrip van longpathologie verbeteren.

Inleiding

Lipopolysaccharide (LPS) is een celwand component van Gram-negatieve bacteriën ^1. Uitdaging aan LPS is een goed gedocumenteerde model van acute longbeschadiging, een syndroom gekenmerkt door acute neutrofiele ontsteking en oedeem ^2. Bovendien, pulmonaire neutrofiel is een kenmerk van chronische obstructieve longziekte (COPD) ³ en LPS uitdaging bij mensen werd gebruikt om het model COPD exacerbaties ^4. Zo, experimentele modellen van LPS blootstelling zijn klinisch relevante en waardevolle instrumenten voor de menselijke pathologie te begrijpen.

Doel van de pulmonaire toediening van aërosol LPS hier beschreven om een ​​neutrofiele ontstekingsreactie in de geleidende en luchtwegen, zonder systemische betrokkenheid genereren. Verscheidene technieken van LPS uitdaging zijn eerder beschreven. Intra-veneuze injectie van LPS is de meest gebruikte toedieningsweg. Hoewel deze techniek is gemakkelijk te bereiken, tHij primaire schade aan het endotheel, met secundaire vernietiging van de longepitheel volgende neutrofiel migratie naar de longen. Intra-veneuze toediening induceert ook systemische inflammatie ^2, waarbij het ​​ziektebeeld bemoeilijken in diermodellen. Systemische ontsteking in tegenstelling niet waargenomen met intratracheale toediening. Deze techniek is echter arbeidsintensief en vereist anesthetica en aanzienlijke training ^{5, 6.} Bovendien pulmonaire depositie door deze wijze van toediening is afhankelijk van de ademhaling ^7. Aldus wordt pulmonaire depositie beïnvloed door de diepte van anesthesie nodig voor de intra- tracheale toediening en differentiële depositie in de luchtwegen kan worden waargenomen. Daarentegen pulmonaire toediening met aërosol LPS vereist minimale training, en kan gemakkelijk worden bereikt op een groot aantal dieren met weinig of geen variatie tussen individuen ^{5, 8.}Een recente studie bevestigt dat aerosolafgifte superieur is aan de intratracheaal inzake depositie die relevanter doses LPS induceren neutrofiele ontsteking met dit model ^8.

Eerdere studies hebben aangetoond dat uitdaging aërosol Pseudomonas aeruginosa LPS genereert een sterke ontstekingsreactie in de luchtwegen lumen longparenchym, waaronder de alveolaire ruimten ^{9, 10.} De ontsteking wordt gekenmerkt door een overwegend neutrofielen en aanwezigheid van longoedeem, en kan dus worden gebruikt om pathogenese van acute longbeschadiging te pakken en krijgen verdere kennis van de mechanismen die bijdragen aan ziekte pathologie.

Protocol

Het dier studies werden goedgekeurd door de Noordelijke Stockholm dierenwelzijn ethische commissie. De experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Zweedse wetgeving.

1. Het genereren van een LPS Aerosol

1. Los 0,5 g gezuiverd P. aeruginosa LPS in 50 ml steriele zoutoplossing onder zacht schudden en controleer of ontbinding. Verdun 1 ml LPS opgelost in 9 ml steriele zoutoplossing tot een eindconcentratie van 1 mg / ml. Beschermen tegen licht met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C.
2. Ontdooi oplosbaar LPS in het donker bij kamertemperatuur en direct goed mengen voor gebruik.
3. In een geventileerde niveau II biohazard kap, plaatst u een rode inlaat in een vernevelaar, en sluit de vernevelaar aan onder druk staande lucht in de ruimte via de slang van de fabrikant (beoordeling regeling presentatie van de experimentele apparaten in figuur 1).
   LET OP: geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een half gezicht stuk herbruikbare respiratof met roetfilters, bril, handschoenen en beschermende kleding moet worden gebruikt in de loop van de blootstelling.

Figuur 1:. Schematische weergave van de experimentele toestellen voor het opwekken van een aërosol De inlaat van de vernevelaar aangesloten op een luchttoevoer. De uitlaat van de vernevelaar wordt eerst verbonden met een stromingsmeter via een 15,9 mm buis en een luchtfilter en luchttoevoer wordt op 5,0 l / m bij 2 kbar druk. De uitlaat is verbonden naast een plexiglas doos voorzien van dekseltjes en 5 mm gaten om drukopbouw te voorkomen.

4. Verbind de uitlaat van de vernevelaar met een massa debietmeter via een luchtfilter. Sluit de massa flowmeter op een elektrische voeding.
5. Stel de luchttoevoer naar 5 l / min, met de druk nog op een 1,0-2,0 bar.
6. Verwijder de massa flowmeter enKoppel de luchttoevoer.
7. Verbind de uitlaat van de vernevelaar een 15.9 mm buis, die vertakt en verbindt twee plexiglas dozen met de afmetingen: 150 x 163 x 205 mm, voorzien van afneembare deksels. Elke doos zou een 5 mm gat in de zijde tegenover de inlaat, om drukopbouw te voorkomen.
8. Plaats maximaal 5 muizen in elke plexiglas doos en sluit de deksels.
9. Open de vernevelaar en vul de insert met minstens 4 ml LPS opgelost in steriele zoutoplossing of voertuig alleen (steriele zoutoplossing; het volume mag niet groter zijn dan 8 ml). Opnieuw Sluit de inlaat van de luchttoevoer.
10. Laat de aerosol te stromen in de gesloten plexiglas dozen voor 10 min. Permanent toezicht op de dieren. Zorg ervoor dat de luchttoevoer blijft stevig op de inlaat van de vernevelaar.
11. Koppel de luchttoevoer. Bij gesloten deksel, laat de dieren in de plexiglas dozen gedurende 2 min.
12. Open de deksels en zorgen voor de aerosol te verspreiden, en de terugkeer van de dieren naar thij kooien. Als de dieren lijken nat, leg de kooien op een verwarming pad ingesteld op laag vuur, om onderkoeling te voorkomen.
13. Toezicht houden op de dieren onafgebroken gedurende de eerste 30 minuten, en daarna om de 2 uur voor de eerste 6 uur. De dieren moeten normale ademhalingspatroon en activiteit vertonen tijdens en na de verneveling procedure.

2. Bronchoalveolaire lavage (BAL)

1. Aan de experimentele eindpunt, diep verdoven van de dieren met isofluraan van kracht, zoals aanbevolen door het veterinaire personeel van uw instelling. Knijp de achterpoot te controleren op een terugtrekking reflex om voldoende diepte van de anesthesie te garanderen aan een grote operatie uit te voeren. Spray beneden de vacht van de dieren met 70% ethanol.
2. Open de buik met een schaar en verbreken de aorta aan het dier exsanguinate. Leg een stukje weefsel over de buik om te genieten van het bloed.
3. Follwing euthanasie, gebruik dan een enkele anterior-posterior snit van de schaar omde thorax bloot. Til de ribbenkast van de voorste punt van het borstbeen en het gebruik van de schaar om het membraan op de meest ventrale punt doorboren, zonder te snijden in een long kwab. Open de ribbenkast door het maken van twee sneden in de anterior-posterior richting (vergadering onder de kaak).
4. Trek voorzichtig uit elkaar de ribbenkast behulp van een tang, en snijd de luchtpijp onder het strottenhoofd.
5. Til de luchtpijp met de tang en verwijder de longen door het snijden van de ligamenten aansluiten van de lobben van de borstholte, en zachtjes te trekken door de vet- en hartweefsel.
6. Plaats een polyethyleen buis (inwendige diameter: 0,58 mm; buitendiameter: 0,965 mm) in de luchtpijp en zet de buis met een koord van zijden draad.
7. Bind de multilobe (de vier lobben van de rechter long) met zijden draad.
8. Plaats een 23 gauge naald in de polyethyleen buis en injecteer langzaam 250 ul van ijskoude steriele PBS in de enkele kwab met een spuit van 1 ml.
9. Tikt u voorzichtig de longen30 keer en het verzamelen van de vloeistof door de spuit. Herhaal de procedure met 200 ul PBS (ongeveer 300 ul PBS zal worden verhaald op de enkele kwab van de totale geïnjecteerde volume van 450 pi).
10. Houd de bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF) op ijs, of sommen de BAL cellen onmiddellijk. Tel de cellen met een heamocytometer, met Turk oplossing om de cellen ¹¹ te kleuren. Bereken het totale aantal cellen door het aantal cellen te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor van de kleuroplossing en het volume binnen de getelde gebied van de heamocytometer.
11. Bereid differentiële cel tellingen van cytocentrifuged cellen zoals elders ¹¹ beschreven.

3. formalinefixatie van longweefsel voor histologische Assessment

1. Verwijder de multilobe en snap-vries op droog ijs. Bewaren bij -80 ° C.
2. Monteer een 60 ml spuit met de zuiger verwijderd op een metalen statief. Vul de spuit met 10% formaline voorde hoogte van 20 cm boven het laboratorium bankje, wat neerkomt op 20 cm van de constante druk.
3. Sluit de 23 gauge naald bevestigd aan de luchtpijp naar de injectiespuit 60 ml via een kunststof buis met een klep om de stroom van formaline regelen.
4. Insufflate de long kwab met formaline gedurende 5 min. Koppel de naald en verwijder deze samen met de polyethyleen buis van de luchtpijp, terwijl trekken aan de zijden draad aan de luchtpijp te sluiten en te behouden de druk in de longen.
5. Dompel de long kwab in formaline en vast te stellen voor 24 uur bij 4 ° C.
6. Was de vaste weefsel driemaal gedurende tenminste 20 minuten met 70% ethanol en drogen xyleen door de volgende behandeling (1 uur elk):
   • 3x 70% ethanol
   • 3x 95% ethanol
   • 3x 100% ethanol
   • 3x xyleen
   • 1x (vloeibare) paraffine
7. Insluiten uitgedroogd weefsel in paraffine, snijd in 4-5 micrometer secties, en vlek met hematoxyline en eosine om voor histologische evaluatie.

Resultaten

Uitdaging om vernevelde P. aeruginosa LPS levert meestal een duidelijke ontstekingsreactie lumen van de luchtwegen en alveolaire ruimte, gekenmerkt door een overwegend neutrofielen zowel vroege als late tijdstippen.

Aerosolized LPS induceert pulmonale neutrofilie

C57BL / 6BY en BALB / c-muizen werden blootgesteld aan vernevelde P. aeruginosa LPS of voertuig alleen en neutrofielen werden in BALF opgesomd. Het totale celaantal in BALF van C57BL / 6BY...

Discussie

Aerosolized LPS genereert een ontstekingsreactie in de luchtwegen, gekenmerkt door neutrofielen in epitheel submucosa, ruimten rond de geleidende luchtwegen, alsmede de alveolaire ruimten. Dit, samen met de verhoogde totale eiwitgehalte in BALF, indicatief plasmalekkage, vertegenwoordiger van de pathologie van acute longbeschadiging. Als LPS induceert een steriele ontsteking, de reactie is onafhankelijk van de adaptieve immuunrespons, en er zijn beperkingen voor de relevantie voor bacteriële infecties. De techniek kan e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gepuurd Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Schadelijk. Aanbevolen zuivering. LPS gezuiverd uit andere bacteriën mag worden gebruikt.
Pari LC sprint star vernevelaar	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternatief product van leverancier mag worden gebruikt.
Saint-Gobain 15,9 mm Tygon-buis	Sigma-Aldrich	Z685704	Aanbevolen merk.
Plexiglas dozen met afneembare deksels	Op maat gemaakt	N/A	150 x 163 x 205 mm (een 2 mm gat aan de zijkant).
3M Half Facepiece Herbruikbare Ademhalingsbescherming	3M	7503	Aanbevolen merk.
3M Geavanceerde Partikelfilters (P100)	3M	2291	Aanbevolen merk.
Schaar	VWR	233-1104	Voorkeursschaar mag worden gebruikt.
Pincet	VWR	232-1313	Voorkeurspincet mag worden gebruikt.
Intramedic PE50 polyethyleenbuis	BD	427411	Aanbevolen merk.
Ethicon 2-0 Perma-hand zijdedraad	VWR	95056-992	Aanbevolen merk.
26 ½ gauge naald			Alternatieve leveranciers bestaan.
1 ml BD slip-tip spuit, niet-sterieel	BD	301205	Alternatieve leveranciers bestaan.
60 ml BD Luer-Lok spuit, niet-sterieel, polypropyleen	BD	301035	Alternatieve leveranciers bestaan.
Fluka Hematoxyline-Eosine	Sigma-Aldrich	3972	Alternatieve leveranciers bestaan.
Türk's oplossing	Merck Millipore	109277
Centrifuge voor op tafel			Er bestaan alternatieve fabrikanten.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternatieve centrifuge kan worden gebruikt.
HEMA-3 stat pakket	Fisher Scientific	23-123-869	Er bestaan alternatieve kleuringssets.
Formaline-oplossing, neutraal gebufferd, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternatieve leveranciers bestaan.