Methodenartikel

Meten Spinal Presynaptische Remming in muizen door dorsale wortel Potentiële Recording

13.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51473

⸱

29 maart 2014

 , 
1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital, Jena, Germany, 2Integrated Research and Treatment Center, Center for Sepsis Control and Care (CSCC), Jena University Hospital, Jena, Germany

In dit artikel

Samenvatting

GABAergic presynaptische remming is een krachtig remmend mechanisme op het ruggenmerg belangrijk motorische en sensorische signalen integratie in ruggenmerg netwerken. Onderliggende primaire afferente depolarisatie kan worden gemeten door registratie van de dorsale wortel potentialen (DRP). Hier laten we een methode van in vivo opname van DRP in muizen.

Samenvatting

Presynaptische remming is een van de meest krachtige remmende mechanismen in de ruggenmerg. De onderliggende fysiologische mechanisme is een depolarisatie van primaire afferente vezels gemedieerd door GABAergic axo-axonale synapsen (primair afferente depolarisatie). De sterkte van de primaire afferente depolarisatie kan worden gemeten door registratie van volumes uitgevoerd potentialen op de dorsale wortel (dorsale wortel potentialen, DRP). Pathologische veranderingen van presynaptische inhibitie zijn cruciaal in de abnormale centrale verwerking van bepaalde pijn omstandigheden en in sommige aandoeningen van de motor hyperexcitatie. Hier beschrijven we een werkwijze voor opname DRP in vivo in muizen. De voorbereiding van het ruggenmerg dorsale wortels in het verdoofde dier en de opname procedure met behulp van zuig-elektroden worden toegelicht. Deze methode maakt het meten GABAergische DRP en daardoor het schatten van spinale presynaptische remming in de levende muis. In combinatie met transgene muismodellen, kan DRP opname serve als een krachtig instrument om ziekte-geassocieerde spinale pathofysiologie onderzoeken. In vivo opname heeft een aantal voordelen ten opzichte van ex vivo geïsoleerde ruggenmerg voorbereidingen, zoals de mogelijkheid van gelijktijdige opname of manipulatie van supraspinale netwerken en inductie van DRP door stimulatie van perifere zenuwen.

Inleiding

Presynaptische remming is een van de meest krachtige remmende mechanismen in de ruggenmerg. Het remt prikkelende postsynaptische potentialen (EPSPs) in monosynaptically opgewonden motoneuronen zonder de postsynaptische membraan potentieel en de prikkelbaarheid van de motoneuronen 1-3. Primaire afferente depolarisatie (PAD) geïnduceerd door GABAergic axo-axonale synapsen op zintuiglijke presynaptische vezels is het onderliggende mechanisme 4-7 (zie ook Figure1A). Deze synapsen bevatten GABA A-en GABA B-receptoren (GABA A R en R GABA B). GABAA-R activiteit leidt tot een toename van chloride conductantie waarin PAD opwekt wegens lokaal ionenverdeling. Dit depolarisatie blokkeert de propagatie van actiepotentialen in de axon terminals en vermindert de kracht leidt tot een verminderde Ca2 +-influx en een vermindering van de afgifte van transmitter. Activering van GABA B-receptoren zich ert bijdragen aan PAD, maar leidt tot een vermindering van Ca 2 +-influx en zodoende het presynaptische remming. Terwijl de activering van GABA A R lijkt betrokken te zijn bij korte termijn remming, worden GABA B R betrokken bij langdurige modulatie 8-10. Naast GABA, die goed is voor het grootste deel van PAD en presynaptische remming kan andere zenders systemen ook moduleren en bijdragen mechanisme 11,12.

Pathologische veranderingen in presynaptische remming lijkt cruciaal te zijn in verschillende ziektetoestanden bijvoorbeeld perifere ontsteking en neuropathische pijn 13,14, alsook abnormale centrale pijn verwerking 15, ruggenmergletsel 16 en CNS ziekte met motorische hyperexcitatie gemedieerd door defecte GABA-erge transmissie 17, 18. Aldus schatten presynaptische remming nuttig experimentele pathologische condities te bestuderen op het ruggenmerg niveau vivo . PAD leidt tot volume uitgevoerd potentialen die een directe maat van de presynaptische remming in het ruggenmerg. Die mogelijkheden zijn dorsale wortel potentials (DRP) genoemd en kan worden gemeten uit het ruggenmerg dorsale wortels na stimulatie van aangrenzende dorsale wortels 7.

Eerste metingen van DRP zijn gemeld bij katten en kikkers 19 en werden intensief bestudeerd bij katten door Eccles, Schmidt en anderen in de vroege jaren 1970 3,4,20,21. Terwijl in vivo opnames van DRP bij katten 22 en 23 ratten zijn op grote schaal gebruikt, metingen in muizen zijn bijna uitsluitend uitgevoerd in ex vivo geïsoleerde ruggenmerg voorbereidingen 15,24. Hier beschrijven we een methode om DRP nemen in verdoofde muizen in vivo waardoor een directe meting van presynaptische remming in het intacte organisme.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle in het volgende protocol genoemde experimentele procedures werden goedgekeurd door de Thüringer overheidsinstanties (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).

1. Voorbereidingen voor Experiment

  1. Fabricage van zuigkracht elektroden
    1. Trek een micropipet met een standaard borosilicaatglas capillair met een micropipet trekker, bijvoorbeeld een standaard patch elektrode.
    2. Rem de elektrode diameter van 0,5-1 mm (iets groter dan de diameter van de dorsale wortel) spuitkop en een diamantvijl.
    3. Warmte polish de punt, zodat het de dorsale wortel niet schadelijk wanneer het wordt aangezogen Een standaard lab fakkel zal geschikt zijn.
    4. Monteer het glas gloeidraad op een elektrodehouder verbonden met een injectiespuit waardoor negatieve druk kan worden toegepast.
  2. Bereiding van oplossingen
    1. Injectie anesthesie voor muizen: Meng 0,75 ml ketamine 10%, 0,24 ml xylazine 2% eennd 5 ml 0.9% zoutoplossing. 10 ul / g lichaamsgewicht (BW) van de oplossing intraperitoneaal geïnjecteerd (ip).
    2. Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF): Verdun met tweemaal gedestilleerd water de volgende zouten (in mM): NaCl 134, KCl 3, KH 2PO 4 1,25; MgSO4 • H 2 O 2, NaHCO3 25, CaCl2 2, D- glucose 10. H 2 O 2 Naar een eindconcentratie van 0,003%. Gebruik altijd vers bereide oplossing.
  3. Bereiding van de opname opstelling (figuur 2)
    1. Sluit de versterker aan op een PC-interface voor het digitaliseren van gegevens.
    2. Gebruik een PC-gebaseerd programma of een analoge timer om een ​​vierkante puls stimulator en data-acquisitie op de pc de harde schijf veroorzaken.
    3. Gebruik gechloreerd silverwires verbonden met standaard glas elektrode houders als voor stimulatie en opnemen.
    4. Monteer drie manipulatoren voor stimulatie, registratie en referentie-elektrode respectievelijk rond een stereotactic frame voor muizen, zodat alle elektroden toegang tot de bereide ruggenmerg later.
    5. Sluit slangen en spuiten om de elektrode houders appel aan negatieve druk toe te passen.

2. Algemene opmerkingen voor Dierproeven en Animal Voorbereiding voor Opnameprocedure

  1. Voer alle experimenten met muizen volgens de richtlijnen van de respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comite. Voer alle operaties en opnames onder diepe narcose verzekeren dat dierenleed wordt geminimaliseerd.
  2. Verdoven het dier door ip injectie van ketamine / xylazine (125 mg en 8 mg per g BW van ketamine en xylazine, respectievelijk 10 gl / g BW van de bereide oplossing zoals hierboven beschreven). Indien nodig tijdens langdurige opnames, kan extra injecties worden gemaakt ip of im
    Opmerking: Herhaalde im injecties van 0,05-0,1 ml ketamine / xylazine oplossing in de bovenbenen hebben bewezen geschikt te zijnhet dier in diepe anesthesie houden tot 3 uur.
  3. Gebruik dierenarts zalf op de ogen tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.
  4. Bevestig de kop van het dier in een stereotactische frame en gebruiken een verwarmingselement met rectale sonde en reflex lus om de lichaamstemperatuur van het dier te controleren tijdens het experiment. Fixatie van het ruggenmerg in een stereotaxisch frame is niet noodzakelijk.
  5. Voordat u begint met de voorbereiding Controleer de diepte van de narcose door eyeblink reflex en trillen tussen de tenen van de muizen. Reflexen moet worden afgeschaft.
  6. Open de huid langs de middellijn boven het ruggenmerg van de bovenste thoracale niveau lumbale gebieden te verlagen tot een duidelijke operationele veld krijgen met behulp van een scalpel. Gebruik geen schaar om incisies te maken. Los van de huid van het onderliggende weefsel zorgvuldig. Tijdens houden vervolgstappen de wond bevochtigd met 0,9% zoutoplossing.
  7. Knip pezen en bindweefsel aan beide zijden van de lumbale wervels naar thoracale niveaus met scalpel en schaar.
  8. Verwijder de doornuitsteeksels en de rest van het bindweefsel rond de wervels met een kleine tang.
  9. Crack zorgvuldig wervels met de nipper vanaf lumbale niveaus (L4/L5) onder een dissectie microscoop. Duw de punt van de tang in de ruimte tussen de wervels en het ruggenmerg en til botdelen uit elkaar. Niet schadelijk voor de dura en het ruggenmerg te voorkomen druk. Beide zijn essentieel voor succes. Houd het ruggenmerg bevochtigd tijdens de hele procedure. Overgaan tot midden van de thoracale niveaus.

3. Scheiden van Dorsale Wortels en DRP Recording (figuur 2)

  1. Open de dura mater voorzichtig met een dunne naald (30 G) met een gebogen tip. Gebruik aCSF voor het bevochtigen van nu af aan.
  2. Scheid de dorsale wortels zover mogelijk met de meter en snijd twee aangrenzende wortels zo distaal mogelijk. Krachtige trekken aan de wortels tijdens scheiding beïnvloedt het succes van het experiment.
  3. Verlaag de zuig-elektrode tot aan de dorsal wortels. Voeg zoveel aCSF het ruggenmerg mogelijk omdat vloeistof helpt bij de dorsale wortels te zuigen.
  4. Zuig het afgesneden uiteinde van een dorsale wortel in een glazen pipetten door het toepassen van negatieve druk door middel van een injectiespuit. Desgewenst kunt u de dorsale wortel voor de elektrode opening met een fijne naald.
  5. Als de dorsale wortel ligt droog binnen de zuig-elektrode, voeg wat aCSF aan de punt, terwijl voorzichtig zuigen totdat de pipet voldoende met aCSF is gevuld.
  6. Na de dorsale wortel wordt aangezogen, verhogen de elektrode tip van het ruggenmerg. Zorg dat er geen "water brug" tussen de pipet en het ruggenmerg kortsluiting de opname / stimulatie-elektrode.
  7. Herhaal de stappen 3,3-3,6 voor een ipsilaterale aangrenzende wortel.
  8. Plaats de referentie-elektrode zo dicht mogelijk bij de dorsale wortels en houden bevochtigd door toepassing aCSF.
  9. Door de oprichting van de opname setup, is een wortel al gekozen voor stimulatie, deandere voor opname. Verhoog de spanning stapsgewijs tijdens het opnemen van de tweede dorsale wortel gebeurt in stroomtang modus. Men kan een korte neerwaartse afbuiging die wordt gevolgd door een langzame, langdurige opwaartse afbuiging die de DRP merken.
  10. Stel de prikkel spanning naar niveaus supramaximale en opnemen meerdere sweeps (minstens 20-30 sweeps / dorsale wortel bij 0,1 Hz, filter tussen 0,3 Hz-3 kHz).
  11. Neem korte treinen van drie stimuli (100 Hz) om informatie over de tijdsafhankelijke optelling van de DRP krijgen.
  12. Schakel opname en stimulatie plaats voor extra contralaterale opnamen.
  13. Dieren zijn niet bedoeld om de procedure te overleven. Offeren dieren na laatste opname door onthoofding terwijl nog onder diepe narcose (ketamine / xylazine, zie boven, stap 2.2).

4. Data Analysis

  1. Gegevens naar analyseprogramma (bv. Sigma Plot, Igor Pro, of MATLAB).
  2. Bereken gemiddelde sporen frOM 20-30 sweeps.
  3. Neem de maximale amplitude van de spanning vervorming (bij basislijn, DRP piek amplitude) voor verdere analyse (Figuur 3).
  4. Bereken de verhouding van de DRP piekamplitude na drie pulsen en enkele puls een maat voor de tijdsafhankelijke som van latere mogelijkheden krijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Typische DRP sporen zijn weergegeven in figuur 3. De prominente stimulatie artefact wordt meestal gevolgd door een korte neerwaartse afbuiging. Daarna wordt een langzame, langdurige opwaartse afbuiging, die de DRP is duidelijk te onderscheiden. In een subset van opnamen, dorsale wortel reflexen zichtbaar kleine pieken boven de DRP. In normale wild-type muizen, dorsale wortel reflexen verschijnen meestal wanneer stimulatie spanning te groot is. Aangezien de dorsale wortel reflexen niet kan worden opgewek...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Extra-en intracellulaire elektrofysiologische opnames van neuronale activiteit en synaptische potentialen in vivo zijn state of the art technieken in onderzoek CNS neuronale functies en pathofysiologie. Spinal integratie is van cruciaal belang voor de motoriek, zoals beweging van de ledematen en voor multimodale zintuiglijke waarneming. Presynaptische remming is een cruciaal mechanisme in deze computationele proces zorgen voor een passende reacties op zintuiglijke input. GABAergic synapsen op Ia affere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Wij danken Manfred Heckmann voor nuttige discussies tijdens vaststelling van de methode. Verder bedanken we Claudia Sommer voor technische bijstand en Frank Schubert voor ondersteuning produceren van de video. Het werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), Duitsland, FKZ: 01EO1002 en het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van Jena University Hospital.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm)Science Products (Hofheim, Germany)GB200F-10Andere glazen buisjes kunnen ook geschikt zijn
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl)Braun Melsungen AG3570350
Rompun 2% (Xylazine)Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
Ketamine 10%Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)KETAMIN 10%
30 G Microneedle/ StericanBraun Melsungen AG4656300
Salts for aCSFSigma-AldrichDiverse
S88 Dual Output Square PulseGrass Technologies (Warwick, USA)S88X
SIU5 RF Transformer Isolation UnitGrass Technologies (Warwick, USA)SIU-V
InstruTECH LIH 8+8HEKA (Lambrecht, Deutschland)LIH 8+8 + Patchmaster software
Universal amplifierNPI (Tamm, Deutschland)ELC-03X
Micropipette pullerSutter Instruments (Novato, USA)P-1000
Dissecting microscopeOlympus (Tokyo, Japan)
MicromanipulatorSutter Instruments (Novato, USA)MPC-200/MPC-325Mechanische micromanipulatoren ook mogelijk
Homeothermic Blanket SystemStoelting (Wood Dale, USA)50300V
Intra-/extracellular recording electrode holderHarvard Apparatus (Holliston, USA)641227

Referenties

  1. Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys. J. Physiol. 159, 147-166 (1961).
  2. Levy, R. A. The role of gaba in primary afferent depolarization. Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).
  3. Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle. J. Physiol. 160, 62-93 (1962).
  4. Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition. J. Physiol. 168, 500-530 (1963).
  5. Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord. Brain Res. 288, 297-301 (1983).
  6. Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord. Brain Res. 141, 35-55 (1978).
  7. Wall, P. D., Lidierth, M. Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn. J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).
  8. Rudomin, P. In search of lost presynaptic inhibition. Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).
  9. Rudomin, P., Schmidt, R. F. Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited. Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).
  10. Kullmann, D. M., et al. Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why? Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).
  11. Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).
  12. Thompson, S. W., Wall, P. D. The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials. Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).
  13. Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush. Brain Res. 1027, 179-187 (2004).
  14. Wall, P. D., Devor, M. The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord. Brain Res. 209, 95-111 (1981).
  15. Witschi, R., et al. Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control. J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).
  16. Calancie, B., et al. Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in. 89, 177-186 (1993).
  17. Geis, C., et al. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
  18. Geis, C., et al. Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer. J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).
  19. Barron, D. H., Matthews, B. H. The interpretation of potential changes in the spinal cord. J. Physiol. 92, 276-321 (1938).
  20. Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents. Nature. 212, 522-523 (1966).
  21. Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway. J. Physiol. 161, 282-297 (1962).
  22. Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat. J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).
  23. Geis, C., et al. Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats. PLoS One. 6, e16775(2011).
  24. Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ruggenmergin vivo registratiezuigelektrodenGABAerge synapsenprimaire afferente depolarisatiemuismodelketamineanesthesiepreparaat van de dorsale wortel

Gerelateerde artikelen