Een Microfluïdische Techniek om Cell Vervormbaarheid Probe

Summary

We demonstreren een-microfluidics gebaseerde test om de termijn voor de cellen om de doorvoer te meten door middel van een opeenvolging van micron-schaal vernauwingen.

Abstract

Hier hebben gedetailleerd ontwerp, fabricage en het gebruik van een microfluïdische apparaat om de vervormbaarheid van een groot aantal afzonderlijke cellen te evalueren op een efficiënte wijze. Meestal kan gegevens ~ 10 ² cellen verkregen bij een experiment 1 uur. Een geautomatiseerde beeldanalyse programma maakt efficiënte post-experiment analyse van beeldgegevens, zodat verwerking voltooid binnen enkele uren is. De geometrie inrichting is uniek in die cellen moeten vervormen door een reeks van micron-schaal vernauwingen, waardoor het mogelijk de initiële vervorming en tijd-afhankelijke relaxatie van individuele cellen te testen. De toepasbaarheid van deze methode op menselijke promyelocytische leukemie (HL-60) cellen aangetoond. Rijden cellen vervormen door micronschaal vernauwingen behulp drukgedreven flow, zien we dat de mens promyelocytaire (HL-60) cellen tijdelijk af te sluiten de eerste vernauwing voor een mediane tijd van 9,3 msec voordat sneller passage door de daaropvolgende vernauwenionen met een mediane transittijd van 4,0 msec per vernauwing. Daarentegen, all-trans retinoic zuur behandelde (neutrofiel-type) HL-60 cellen occluderen de eerste vernauwing slechts 4,3 msec voor passage door de daaropvolgende vernauwingen met een gemiddelde looptijd van 3,3 msec. Deze methode kan inzicht verschaffen in de visco-elastische aard van de cellen, en uiteindelijk onthullen de moleculaire oorsprong van dit gedrag.

Introduction

Veranderingen in de cel vorm zijn van cruciaal belang in tal van biologische contexten. Bijvoorbeeld, erytrocyten en leukocyten vervormen door capillairen die kleiner zijn dan hun eigen diameter ^1. In metastase, moeten kankercellen vervormen door smalle spleten interstitiële alsook kronkelige vaten en lymfatische netwerken om zaad op secundaire locaties ^2. Om het fysieke gedrag van individuele cellen te onderzoeken, microfluïdische apparaten presenteren een ideaal platform dat kan worden aangepast aan een reeks van cel gedrag met inbegrip van hun vermogen om te migreren door smalle openingen ³ en passief vervormen door micronschaal vernauwingen ^{3 9} bestuderen. Polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische apparaten zijn optisch transparant, waardoor cel vervormingen worden gevisualiseerd met behulp van een lichtmicroscoop en het gebruik van de basisfuncties voor beeldbewerking gereedschap geanalyseerd. Bovendien kunnen reeksen van vernauwingen nauwkeurig worden ingesteld, zodat de analyse van meerdere cellen tegelijk metthroughput dat veel bestaande technieken ^10,11 overschrijdt.

Hier presenteren we een gedetailleerde experimentele protocol voor het sonderen cel vervormbaarheid met behulp van de 'Cell Deformer' PDMS microfluïdische apparaat. De inrichting is zo ontworpen dat cellen passage door opeenvolgende vernauwingen; deze geometrie is gebruikelijk in fysiologische context, zoals de pulmonaire capillaire bed ^12. Naar cel vervormbaarheid peilen, transittijd biedt een handige metric die gemakkelijk wordt gemeten als de tijd die nodig is voor een individuele cel voor doorvoer door een enkele vernauwing ^4,6. Om een ​​constante drukval over de vernauwde kanalen tijdens cel doorgang te behouden, maken we gebruik van drukgedreven flow. Onze protocol bevat gedetailleerde instructies apparaat ontwerp en fabricage, werking van het apparaat door druk aangedreven stroming, voorbereiding en beeldvorming van cellen, alsook beeldverwerking van de tijd gedurende cellen vervormen door een reeks insnoeringen meten. Wij zijn onder anderezowel apparaat ontwerpen en visie gegevensverwerking code als aanvullende bestanden. Als representatieve steekproef van gegevens, tonen wij cel reistijd door een reeks insnoeringen in functie van het aantal vernauwingen gepasseerd. Analyse van de tijdschaal cellen voor doorvoer hoewel smalle vernauwingen van een microfluïdische inrichting kan verschillen in vervormbaarheid van verschillende celtypen ^4,5,13 onthullen. Het apparaat hier gedemonstreerd unieke enquêtes cel doorvoer door een reeks van micron-schaal vernauwingen; dit ontwerp emuleert het kronkelige pad dat cellen ervaren in circulatie en maakt ook vervolma fysieke kenmerken van de cellen zoals relaxatietijd.

Protocol

1 Microfluïdische Device Ontwerp

NB: Het ontwerp apparaat heeft vier fundamentele functionele gebieden: toegangspoort, cel filter, vernauwing array, en exit-poort (figuur 1). De inrichting kan worden toegepast op een breed scala aan celtypen, met kleine aanpassingen afmetingen. Hier zijn een paar eenvoudige ontwerp aanbevelingen samen met device parameters die effectief zijn voor een selectie van zowel primaire als onsterfelijke cellen zijn.

1. Selecteer de breedte van beklemming matrix kanalen (Figuur 1B) ongeveer 30-50% van de gemiddelde cel diameter zijn; Deze vernauwing naar celgrootte verhouding resulteert in aanzienlijke celvervorming maar minimale verstopping. Gegeven een celtype dat niet eerder is getest, is het verstandig om een ​​scala van beklemming breedtes ontwerpen van ~ 30-50% van de cel diameter om de optimale breedte te vinden. Zoals met vele soorten van microfluïdische apparaten, kan meer dan 120 apparaatrecords mallen worden patroon op een zondegle 4 inch siliciumwafel, waardoor een reeks verschillende ontwerpen inrichting wordt vervaardigd in een enkel fabricageproces.
2. Selecteer de goothoogte ten minste 50% van de cel diameter zijn; Dit zorgt ervoor dat de cel beperkt in 2 dimensies. Om kanaal instorting tijdens bonding te voorkomen, ervoor zorgen dat het kanaal beeldverhouding is niet minder dan 1:10 (hoogte: breedte) in het hele apparaat. Voor kanalen die dit aspect ratio moet groter zijn dan, voeg steunpalen instorting te voorkomen. Space standpijpen op een afstand die ten minste tweemaal de diameter cel naar cel stroom niet belemmeren.
3. Onder andere een filter aan de ingang poorten om puin cel clusters (figuur 1B) te verwijderen en uit elkaar getrokken. De grootte en afstand van de filter posten zodat de afstand tussen de staanders is ongeveer gelijk aan een cel diameter.
   OPMERKING: De ondergrens van feature size wordt door de resolutie waarmee de lithografie masker dient te worden afgedrukt. Ervoor te zorgen dat alle functies zijn binnen de resolution termijn die het masker leverancier.

2 Supplies en voorbereiding

LET OP: Voordat u begint met de proef moeten de volgende punten worden voorbereid. Een schema van de gehele installatie is gegeven in figuur 1.

1. Vervaardig de apparaatrecords toepassing van standaardtechnieken voor lithografische micromachining ^14,15. Controleer de hoogte van het patroon functies met behulp van een profilometer.
   Opmerking: hoewel masters gemakkelijk kan worden vervaardigd in een cleanroom faciliteit hebben sommige laboratoria goedkope lithografische werkwijzen ontwikkeld voor gebruik in een semi-schoon milieu ^16,17.
2. De lucht bron voor te bereiden op drukgedreven stroom, met behulp van een tank van perslucht en de volgorde van de lucht regelgevers en fittingen (figuur 1A).
   1. Opzetten van een luchttoevoer tank en handmatige regelaar.
      OPMERKING: Een samenstelling van 5% _CO2 in lucht zorgt voor een soortgelijke omgeving als een typische celkweek incubator, maar andere gasmengsels kunnen ook worden gebruikt.
   2. Opzetten van een elektronisch gestuurde drukregelaar in lijn met de handmatige regelaar. Met een elektro-pneumatische omzetter te reguleren en een stabiele drukval over de kanalen bijhouden die drukschommelingen van minder dan 2 kPa. Gebruik de eenvoudige code geschreven in LabVIEW (aanvullende informatie) voor het invoeren van de gewenste druk.
      OPMERKING: De elektro-pneumatische omvormer gebruikt een interne terugkoppeling aan de klep uitlaatdruk naar de opgegeven druk over de microfluïdische apparaat overeenkomen passen.
   3. Stel een drukkamer om stroming van de celsuspensie drijven. Monteer een celsuspensie kamer van een standaard stroomcytometer buis en een bewerkte cap die een druk-afdichting op de buis ontstaat.
      OPMERKING: De drukkamer dop bevat twee openingen: een inham die verbinding maakt met de perslucht tank, en een uitlaat waardoor cellen vloeien voort uit de onder druk staande kamer in het apparaat (Figure 2).
3. Stel een omgekeerde microscoop uitgerust met een camera die een opnamesnelheid van ten minste 100 beelden per seconde om beelden van de cellen stroomt door de vernauwing matrix vangen heeft. De interface van de camera met een video capture-kaart en een computer.
4. Bereid een voorraad oplossing van oppervlakteactieve stof van 10% g / g Pluronic F-127 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) het toevoegen van een kleine hoeveelheid F127 het celmedium oplossing helpt om celadhesie aan de PDMS wanden minimaliseren. De F127 oplossing, vortex en warmte bereiden voorzichtig bij 37 ° C om de F127 lossen. Voor gebruik laat de oplossing door een 0,2 urn spuitfilter en bewaren bij kamertemperatuur. Bereid de oppervlakte-actieve oplossing van tevoren als vortexen en filtering zal bellen die zal blijven bestaan ​​voor meer dan 24 uur te genereren.

3 Microfluïdische Device Fabrication

1. Fabriceren PDMS blok met microfluïdische kanalen.
   1. Mix PDMS grondig eenta verhouding van 1:10 (w / w) curing agent base.
   2. Giet het mengsel over het apparaat master (Stap 2.1). Degas in een glazen stolp met toegepaste vacuüm totdat de ingesloten luchtbellen verdwijnen, of voor ongeveer 10-20 minuten.
      OPMERKING: Na deze tijd, kunnen er nog steeds bubbels in de lucht-PDMS-interface, wat normaal is; Deze zal kenmerkend elimineren tijdens het bakken. Het is zeer cruciaal om te waarborgen dat er geen resterende luchtbellen aangrenzend aan de kanalen.
   3. Bak de ontgaste apparaat bij 65 ° C gedurende 4 uur. Kanalen voorkomen instorten, bak het apparaat gedurende de nacht verder verknopen de PDMS voor een inrichting met een hogere elasticiteitsmodulus die meer resistent kanaal instorten. Merk echter op dat het bakken uitgebreid bros ook de PDMS en kan leiden tot scheurtjes als het ponsen van gaten (Stap 3.3).
2. Verwijder microfluïdische apparaten van de meester mal. Snijd individuele microfluïdische apparaten uit de PDMS blok met een scheermesje en haal het apparaat uit de masteh. Begin met voorzichtig til een hoek van de inrichting; langzaam en zacht peeling, in tegenstelling tot het opheffen van de PDMS blok recht omhoog, vermindert de belasting van zowel de PDMS en de master.
3. Punch gaten in het PDMS apparaat aansluitingen te creëren voor toegang tussen slangen en microkanalen. Maak gaten met een biopsie punch en punch uit het kanaal zijkant door de buitenzijde van de inrichting.
   OPMERKING: Een biopsie punch met een 0,75 mm binnendiameter creëert openingen die interface perfect bij polyetheretherketone (PEEK) buis (buitendiameter = 1/32 "of 0,79 mm) of polyethyleen buis (PE-20, buitendiameter = 0,043" of 1,09 mm ). Gebruik een ring licht te helpen gaten in apparaten visualiseren met ondiepe kanalen ^18. Zorg ervoor dat de biopsie punch is scherp; Na herhaald gebruik het snijvlak stompt en de biopsie punch moet worden weggegooid en vervangen.
4. Spoel de PDMS apparaat met isopropanol (HPLC-kwaliteit) om stof en ingediende stukken PDMS verwijderen. Zorg ervoor dat degeponste gaten zijn door het richten van een gestage stroom van zuiver isopropanol uit een knijpfles door de gaten vrij van afval. Föhnen met gefilterde lucht. Na het reinigen, plaats PDMS blokken met kanalen naar boven in een schone petrischaal netheid apparaat te onderhouden. Indien nodig, op te slaan apparaten in deze vorm tot binding.
5. Reinig de glazen substraat door spoelen met methanol (HPLC-kwaliteit), föhnen met gefilterde lucht, en te plaatsen op een 200 ° C kookplaat gedurende 5-10 minuten om ervoor te zorgen het glas is volledig schoon en droog zijn voor plasma behandeling.
   OPMERKING: De glazen substraat vormt de bodem van elk kanaal. Typisch een glasplaatje voldoende, aangezien een 10X of 20X objectief is ideaal voor het afbeelden van meerdere kanalen in parallel. Voor hogere resolutie imaging, bond het apparaat op een dekglaasje (# 1.5 dikte).
6. Bond het PDMS apparaat het glassubstraat.
   1. Zuurstofplasma behandeling van het kanaal van het PDMS blok en 1 kant van een glasplaatje.
      OPMERKING: Wet een draagbare ontlader, gebruikt een behandelingstijd van 1 min, maar optimale behandeling in elk zuurstofplasma inrichting.
   2. Plaats het kanaal van het PDMS bovenop de behandelde zijde van het glas direct na de behandeling.
   3. Houd met lichte druk gedurende ~ 10 seconden om binding te bevorderen. Bak de gehele inrichting bij een verhoogde temperatuur (60-80 ° C) gedurende ten minste 15 min hechting verbeteren.

4 Vervormingspi Cellen door vernauwde Channels

1. Inspecteer de microfluïdische apparaat onder een microscoop. Zorg ervoor dat de kanalen niet zijn ingestort of gebroken en dat zowel de inlaat en uitlaat gaten sluit rechtstreeks in het apparaat kanalen met behulp van een low-power doelstelling (10X). Aanwijzen defecte apparaten door het scoren van het oppervlak van het PDMS met een scheermesje en daar geen gebruik van te proeven.
2. Bereid de celkweek monsters te testen. Kweekcellen met standaardomstandigheden.
   1. Fof bijvoorbeeld cultuur HL-60 cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 1% penicilline-streptomycine-oplossing en 10% foetaal runderserum in 5% _CO2 incubator bij 37 ° C.
   2. Voor hechtende cellen, oogsten ze door behandeling met trypsine en resuspendeer in vers groeimedium. Gebruik een standaard behandeling met trypsine-protocol; bijvoorbeeld, voeg ~ 0,5 ml trypsine in een kolf met 25 cm ² cultuur gebied, en mengen in ~ 30 ml vers medium. Onderscheid HL-60 cellen in neutrofiel-achtige cellen door all-trans retinoic (ATRA) in een uiteindelijke concentratie van 5 uM per 1 x 10 ⁵ cellen / ml zoals eerder beschreven ^19,20.
   3. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 3 minuten voorzichtig zuig het supernatant en resuspendeer cellen om de juiste uiteindelijke dichtheid in vers kweekmedium met 0,1% v / v F-127.
3. Tel de cellen met behulp van een Coulter teller, hemacytometer of flowcytometer. Stel de celsuspensie tot een dichtheid van 1 x ^06-5 oktober x 10 ^{6 cellen / ml. Wanneer de opschorting dichtheid is ingesteld, aan te vullen met ongeveer 0,1% v / v F-127.
   OPMERKING: De celdichtheid en surfactant concentratie moet worden aangepast afhankelijk van de bepaalde celsystemen, Tabel 1 geeft een overzicht van eerder gebruikte concentraties van cellen en F-127 voor verschillende celtypen.}
4. Plaats celsuspensie in een doorstroomcytometer buis en verbinding maken met de druk cap. Alvorens de slang op het microfluïdische apparaat, stel de druk tot ongeveer 14-21 kPa en spoelen totdat de celsuspensie Uit het uiteinde van de buis. Dit zal helpen om luchtbellen in de slang en het apparaat te minimaliseren.
5. Steek de punt van de catheter met de celsuspensie in de inrichting inlaat. Als het apparaat is verbonden met een dekglaasje, plaats het apparaat op een vlakke, stevige ondergrond, zoals de microscoop stadium vóór het aansluiten van de slang; het dekglaasje is kwetsbaar en kan anders breken.
6. Plaats een stuk slang into de uitlaatopening en route deze in een lege buis voor afvalinzameling zoals een lege Falcon buis plakband aan de kant van de microscoop podium. Om consistent in de totale vloeibare weerstand van de inrichting tussen experimenten zorgen dat de inlaat en uitlaat slang van dezelfde diameter en ongeveer dezelfde lengte voor elk experiment.
7. Voorzichtig opvoeren van de druk tot ongeveer 28 kPa of totdat de cellen stromen door de kanalen. Plaats het toestel zodat meerdere kanalen in het gezichtsveld en loodrecht op de bodem van het scherm. Als de camera wordt beperkt door gegevensgrootte verwerven meerdere video een voldoende aantal onafhankelijke gegevenspunten genereren. Stel de framesnelheid die voor de gewenste data output. Om veranderingen in cel vorm vast te leggen, maken gebruik van hoge snelheid beeldvorming bij 300 frames per seconde (fps); om transittijden van cellen te meten, gebruiken framerates van ongeveer 100 fps.

5 Data Analysis

1. Open het bestand Master_script.m (Downloadable Aanvullende File) en start het programma.
2. Selecteer de eerste video worden geanalyseerd vanuit de Windows Verkenner-venster dat verschijnt. Geef de frame rate van de geselecteerde video en druk op enter.
   OPMERKING: Een cijfer verschijnt dat vraagt ​​de gebruiker om een ​​rechthoekig bijsnijden venster voor de eerste video te selecteren.
3. Selecteer een venster dat alle kanalen van links naar rechts omvat en snijdt de kanalen boven de eerste lamp van de reeks kanalen boven en onder (figuur 3).
4. Selecteer de vernauwing regio's van de bijgesneden afbeelding. Besteed speciale aandacht aan een vaste pixel afstand tussen de boven-en onderkant raam grens voor elke video geselecteerde behouden.
   OPMERKING: Het bovenste venster rand geeft de bovenste vernauwing en onderste venster rand geeft de onderste vernauwing (figuur 4); intermediaire vernauwingen worden benaderd vanuit deze input van de gebruiker. Vervolgens het algoritme toont de segmentation van cellen voor de eerste 50 frames van elke video (Figuur 5).
5. Controleer het linker beeld (figuur 5A) dicht te bepalen of het algoritme nauwkeurig lokaliseren cellen; een gebinariseerd beeld wordt gesuperponeerd op de bronvideo om de locatie van de geïdentificeerde cellen vertonen.
   LET OP: De verschillende vensters, (figuren 5B-5D) zijn voor code diagnose en tonen de videobeelden na specifieke beeldverwerking operaties.
6. Selecteer de volgende video van het venster van Windows Verkenner te verwerken.
   OPMERKING: Het algoritme zal herhalen de stappen 5,2-5,5 voor elke video geselecteerd.
7. Selecteren annuleren zodra alle gewenste video's zijn toegevoegd via het venster van Windows Verkenner naar de functie die de video lijst compleet te instrueren.
   OPMERKING: Het algoritme zal de resterende bewerkingen uitvoeren zonder tussenkomst van de gebruiker. Dit zal ongeveer 1-2 uur duren, afhankelijk van het aantal verwerkte video en computer performance. Na voltooiing zal het algoritme een histogram van de transittijd gegevens te produceren en de gegevens op te slaan in de map als een MATLAB .mat bestand en een Microsoft Excel xls-bestand.

Results

Om de vervormbaarheid van verschillende celtypes, humane myeloïde leukemiecellen (HL-60), gedifferentieerde neutrofiele cellen, muis lymfocyt cellen en menselijke eierstokkanker cellijnen (OVCAR8, HEYA8) onderzoeken worden beoordeeld volgens het "Cell Deformer 'microfluïdische techniek. Representatieve resultaten voor de transittijd van de HL-60 en neutrofielen type HL-60 cellen laten zien van de termijn voor een enkele cel tot doorvoer door een reeks van vernauwingen, zoals weergegeven in figuur 6.

Discussion

Hier bieden we een uitgebreide experimentele procedure voor het analyseren van de vervorming van de cellen op doorreis in ingesnoerd microfluïdische kanalen met behulp van druk-driven flow. Een MATLAB script maakt geautomatiseerde gegevensverwerking (Aanvullend materiaal); een bijgewerkte versie van de code wordt gehandhaafd ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Meer algemeen kan de hier gepresenteerde technieken worden aangepast in vele cellen gebaseerde assa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant	Fisher Scientific	8409400	Geproduceerd door BASF, ook verkrijgbaar via Sigma
PDMS base en crosslinker	Essex Brownell	DC-184-1.1	Product vaak genoemd Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma ontlaadapparaat	Enercon	Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Fingertight Ferrule, 1/32"	Upchurch Scientific	UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32	Upchurch Scientific	UP-F-300X
Polyetheretherketon (PEEK) buis, buitendiameter = 1/32"of 0.79 mm	Valco	TPK.515-25M
Polyethyleen (PE-20) buis, 0.043"of 1.09 mm	Becton Dickinson	427406
Drukregelaar	Airgas of Praxair
Polyurethaan buis, 5/32” OD	McMaster Carr	5648K284
Push-to-connect fittingen	McMaster Carr	5111K91
Voltage naar Druk (E/P) Elektropneumatische Converter	Omega	IP413-020
16-bit, 250 kS/S, 80 Analoge Inputs Multifunctioneel DAQ	National Instruments	NI PCI 6225-779295-01
Analoge Connector Block-Schroefklemmen	National Instruments	SCB-68-776844-01
LabView Systeem Ontwerp Software	National Instruments
MATLAB Software	The MathWorks, Inc.	MATLAB R2012a	Code vereist de Image Processing Toolbox
Afgeschermde Kabel	National Instruments	SHC68-68