Gemodificeerd<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Assay naar de mogelijke rol van hormonen, cytokines en / of groeifactoren in Bemiddelen Cancer Cell Invasion Bepaal

Samenvatting

Dit videoartikel beschrijft een gewijzigde in vitro methode om de rol van hormonen, cytokinen en/of groeifactoren bij het aanjagen van kankercelinvasie te onderzoeken.

Samenvatting

Bloedserum dient als een chemoattractant richting die kankercellen migreren en binnen te vallen, hun intravasation faciliteren in haarvaten. De werkelijke moleculen waarnaar het migreren blijven ongrijpbaar. Deze gewijzigde invasie assay ontwikkeld om doelstellingen die celmigratie en invasie drijven identificeren. Deze techniek vergelijkt de invasie index onder drie voorwaarden te bepalen of een specifiek hormoon, groeifactor of cytokine speelt een rol in het mediëren van het invasieve potentieel van een kankercel. Deze omvatten i) normaal foetaal runderserum (FBS), ii) houtskool gestript FBS (CS-FBS), die hormonen, groeifactoren en cytokinen en iii) CS-FBS + molecule verwijderd (aangeduid als "X"). Een significante wijziging invasie CS-FBS vergeleken met FBS, geeft de betrokkenheid van hormonen, cytokinen of groeifactoren de regulering van de verandering. Individuele moleculen kunnen vervolgens weer worden toegevoegd aan CS-FBS hun vermogen om opnieuw te testenvers of redden van de invasie fenotype. Verder kunnen twee of meer elementen worden gecombineerd om de additieve of synergetische effecten van meerdere moleculen in besturen of remmen invasie evalueren. Kortom, deze werkwijze kan de onderzoeker bepalen of hormonen, cytokinen en / of groeifactoren spelen een rol bij invasie door als chemoattractanten en remmers van inval voor een bepaald type kankercel of een bepaalde mutant. Door het identificeren van specifieke chemoattractants en remmers, kan deze gewijzigde invasie assay helpen verhelderen signaalwegen die kankercel invasie sturen.

Inleiding

Een nieuw invasie assay is ontwikkeld met het doel van het identificeren van de betrokkenheid van specifieke hormonen, cytokinen en / of groeifactoren zoals chemoattractanten in kankercel invasie. Het vermogen van tumorcellen binnen te dringen door de extracellulaire matrix (ECM) is een kenmerk van het metastatische fenotype ^1-3. Invasion kamers zijn uitgebreid gebruikt als in vitro instrumenten kankercel invasie en migratie bestuderen en kunnen kennis verschaffen over de mechanismen van in vivo tumor invasie en metastase. De kamers bestaan ​​uit cilindrische celkweek inserts genest binnen de putten van celkweek platen. De bodems van de inzetstukken halfdoorlatende polycarbonaat of polystyreen membranen van gedefinieerde poriegrootte.

In de standaard invasie assay worden cellen gezaaid op het inzetstuk membraan met serumvrij medium en geplaatst in celcultuur putjes die zijn gevuld met serum of serum-achtige chemoattractanten te set een chemoattractive kracht. Deze kracht drives cellen om door de semi-permeabele membraan (migratie) of door een coating van extracellulaire matrix (invasie), die vervolgens kunnen worden gekleurd met conventionele kleurstoffen detecteren en kwantificeren van het aantal cellen. Het aantal cellen wordt vervolgens genormaliseerd naar de mate van migratie en invasie in een invasieve cellijn. Met deze methode kan een onderzoeker om de invasieve potentieel van de verschillende celtypen onder verschillende omstandigheden, met inbegrip van genetische manipulaties evalueren.

Hormonen, cytokinen en groeifactoren zijn kritische componenten van serum en worden steeds vaker blijken geassocieerd te zijn met het drijven het invasieve fenotype ^4. Echter, de aard, de rol en de specificiteit van deze chemoattractive serum moleculen in het bemiddelen invasie nog steeds ongrijpbaar. De uitdaging blijft om te bepalen welke specifieke factoren in het serum of serum-achtige chemoattractants verantwoordelijk voor het rijden bentkankercel invasie evenals wat moleculen de invasie proces kan remmen. In dit verslag beschrijven we een methode om de mogelijke betrokkenheid van hormonen, cytokinen en / of groeifactoren die in serum evalueren, zoals moleculen drijven de chemoattractie en invasie van kankercellen.

In deze voorgestelde gewijzigde protocol, wordt houtskool strippen gebruikt hormonen, cytokinen en groeifactoren van 2% foetaal runderserum (FBS) verwijderen tot 2% houtskool gestript FBS (CS-FBS) genereren. Beide 2% FBS en 2% CS-FBS worden gebruikt als middelen om de chemoattractive kracht kankercel invasie drijven. Met 2% CS-FBS als chemoattractive middel in vergelijking met normale 2% FBS biedt verscheidene voordelen waaronder eerste en meest prominent, de mogelijkheid om de kankerinvasie fenotype in de gereduceerde / relatieve afwezigheid van hormonen, cytokinen en groeifactoren te bestuderen. Het maakt het ook mogelijk de onderzoeker om te beoordelen of de collectieve verwijdering van hormonen, groeifactoren, en cytokines veroorzaakt een toename of afname van de invasieve index. De assay wordt vervolgens bepaald of de toevoeging van een individuele component, aangeduid als "X" kan remmen, verlagen, verhogen of herstellen de invasieve index op zijn oorspronkelijke waarde (zie figuren 2 en 3). Hoewel deze methode is specifiek voor het bereiken van fysiologische niveaus van de component die wordt verwijderd uit het serum tijdens houtskool strippen, moet worden opgemerkt dat houtskool strippen kunnen worden beïnvloed signaaltransductiewegen. Bijvoorbeeld is gerapporteerd dat houtskool strippen de alkalische fosfatase activiteit van osteoprogenitor cellen kan afnemen en induceren adipogenese door verlaging van MAPK activatoren ^5. Houtskool gestript media zijn commercieel verkrijgbaar en zijn gebaseerd op het beschreven protocol dat houtskool gecombineerd met dextran en geïncubeerd met foetaal runderserum O / N ^6.

Deze test werd ontwikkeld in RespoNSE een resultaat gerapporteerd door Zucker et al. ⁷ De auteurs toonden dat een mutant fenotype die gap junction communicatie toonden een verhoging van de invasie index bij het ​​migreren naar media met normale 2% FBS. Deze stijging werd geëlimineerd met de vervanging van houtskool gestript serum. Uit deze resultaten concludeerden de auteurs dat deze mutant beïnvloed migratie naar een lipofiel molecuul (specifieker, een hormoon, groeifactor of cytokine) ^7. Het is bekend dat hormonen, groeifactoren en cytokinen signaaltransductiewegen betrokken bij tumorontwikkeling en invasie ^4. Het is dus belangrijk dat wetenschappelijke onderzoekers bepalen welke factor (en) drijven de tumor invasie van hun specifieke kankercellen of mutanten onder studie. De test is ontworpen om de rol van individuele componenten richten op de fysiologische concentratie zoals bepaald overeenkomstig het verschil tussen de concentratie van de component &# 8220, X "normale FBS en de CS-FBS. Door de ontwikkeling van deze test, kunnen de onderzoekers meer inzicht in de specifieke invasieve route voor hun systeem te krijgen.

Hormonen, groeifactoren en cytokinen zijn vaak ingedeeld als tumor promotoren ^8. Sommige van deze factoren zoals EGF worden gebruikt als directe bron voor chemoattractanten invasie kamers ^9. Derhalve lijkt het waarschijnlijk dat deze vormen de belangrijkste onderdelen van het serum die directe tumorinvasie. Dit protocol stelt een eenvoudige, maar significante, wijziging van de gebruikelijke in vitro invasie assay waarmee een onderzoeker om de betrokkenheid van hormonen, groeifactoren en cytokines beoordelen mediëren het invasieve potentieel van kankercellen. Echter, de test om de onderzoeker met een antwoord over de vraag of de procedure effectief voor de studie zullen in een eerste stap in de analyse, zodat geen kostbare tijd en r gebruikenIDDELEN als overbodig beschouwd. Deze methode maakt gebruik van CS-FBS en vertrouwt op de onderzoekers beoordelingsmarge met betrekking tot welke moleculen na te streven als lead kandidaten die mogelijk bemiddelen kankercel invasie. De resultaten van deze analyses blijken bruikbaar te zijn om te bepalen welke serum bestanddelen dienen als chemoattractanten en remmers voor de bepaalde cellijn of mutant bestudeerd. Daarnaast kan deze aanpak helpt de onderzoeker bepalen wat de belangrijkste signaalwegen ofwel bevorderen of remmen kankercel invasie; Zo regisseren toekomst drug design.

Protocol

1. Bereid de verschillende media en de extra componenten

1. Voorafgaand aan experimenteren bereiden media bestaande uit DMEM of andere genoemde media met de toevoeging van ofwel normale FBS, houtskool gestript FBS of houtskool gestript FBS plus de component te testen. Merk op dat meerdere componenten kunnen worden getest in elk experiment.
2. Weeg en verdun de hormonen, groeifactoren, of cytokines adequate wijze te worden opgelost in de houtskool gestript serum op de fysiologische concentratie.

2. Bereid de Collageen Matrix on Ice

1. Bereid 2 ml collageen I matrix bij 2,2 mg / ml door toevoeging van de volgende steriel gefilterde componenten op ijs: 200 pl 10x PBS (pH 7,4), 5,4 pl 1 N NaOH, 600 ui dubbel gedestilleerd _H2O en 1,2 ml collageen I (bij 3.63 mg / ml).
2. Houd collageen I oplossing op ijs pas klaar voor de plaat.

3. Bereid Migratie / Invasion Platen voor Assay

1. Voor elke cellijn te testen Gebruik een 24-well plaat ruimte waarin 12 putjes bevatten inserts. Gebruik de extra 12 putten die niet inserts bevatten voor het toevoegen van de chemoattractant media en de overdracht van de inserts voor de experimentele set-up.
   OPMERKING: Een collageen matrix op platen met een polyethyleentereftalaat (PET) membraan en 8 urn poriegrootte is optimaal voor de cellijnen hier. Echter, een Matrigel matrix voorbeklede platen ook gesubstitueerd met poriegrootte verminderd in overeenstemming met de cellijn onderzocht.
2. Duidelijk label de plaat, met behulp van 3 putten per aandoening die wordt geanalyseerd (FBS migratie, CS-FBS migratie, FBS invasie, en CS-FBS invasie evenals FBS-migratie voor een controle, niet-invasieve cellijn). Assay migratie beweging door poriën in een PET membraan en assay invasie door verplaatsing door een collageen of Matrigel matrix en vervolgens door poriën in het membraan. Gebruik verschillende kleuren markers voor elke cel voorwaarde om eenid in de plating proces.

4. Verdeel de invasie Matrix

1. Zorgvuldig Pipetteer 75 ul van de collageen matrix oplossing in de inzetstukken te gebruiken voor invasie assays. Wees voorzichtig om luchtbellen te vermijden. Verspreiden luchtbellen door het aanbrengen van een omgekeerde pipettip naar de oppervlakte.
2. Breng de plaat met de met collageen beklede inserts aan een 37 ° C en 5% _CO2 incubator gedurende 30 min naar het gel kunnen stollen.

5. Plaat de cellen op het membraan of Invasion Matrix

1. Ondertussen trypsinize cellen en media aan 10% FBS. Spin-cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten op een tafelblad centrifuge en spoel 3x in serumvrij medium.
2. Resuspendeer in serum vrije media. Tellen cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde dia teller. Voeg serumvrij medium tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 ⁴ cellen / ml.
3. Wanneer het collageen matrix (na 30 min) is gestold, voeg 700 ul van media met ofwel2% FBS gedefinieerd of houtskool-gestript FBS aan elk putje. Van de 12 inserts per plaat:
   • 3 inserts hebben collageen en putten met media + 2% FBS
   • 3 inserts hebben collageen en putten met media + 2% CS-FBS
   • 3 inserts hebben geen collageen en putten met media + 2% FBS
   • 3 inserts hebben geen collageen en putten met media + 2% CS-FBS
   1. Gebruik extra platen afhankelijk van het aantal factoren getest en een zonder collageen controle overeenkomstig elke conditie.
4. Voeg celsuspensie aan de inserts op 5 x 10 ⁴ cellen / ml, plating 500 ul cellen per insert in alle migratie en invasie inserts.
5. Incubeer de cellen gedurende 22 uur bij 37 ° C.

6. kwantificeren aantal migrerende en binnenvallen Cellen

1. Stel kleuring putjes met methanol fixatief, eosine en hemotoxyline, in afzonderlijke putjes.
2. Gebruik wattenstaafjes om cellen en matrix uit elk putje te verwijderen.Rrepeat met tweede wattenstaafje aanvraag in voor elk goed.
3. Met forceps, dompel elke insert 5 maal gedurende 1 seconde in elk van de 3 oplossingen elkaar.
4. Laat inserts drogen O / N.
5. Ofwel i) Verwijder filters met een scalpel snijden voorzichtig rond de randen en monteren op een dia met dekglaasje en immersie olie of ii) kan de inzetstukken drogen O / N omgekeerd en gebruik de inzetstukken direct voor microscopie.
6. De volgende dag, bekijken dia's of inzetstukken onder een microscoop met een 20X objectief en neem 5 beelden uit verschillende regio's van het filter. Om de samenhang te verbeteren, neem 4 buitenste velden en één centrum.
7. Tellen cellen voor alle omstandigheden met behulp van ImageJ software en gelden voor de onderstaande formules.
8. Bepaal het percentage invasie als volgt:
   Bedoel # cellen binnenvallen door collageen Ik steek = een
   Bedoel # cellen migreren via besturingssokkel = b
   % Invasion = (a / b) x 100
9. Bepaal de invasie Index in 2% FBS als volgt:
   % Invasie van cellen worden getest (in 2% FBS) = c
   % Invasie van controle invasieve cellen in (2% FBS) = d
   Invasion index (FBS) = (c / d)
10. Bepaal de invasie Index in 2% CS-FBS als volgt:
    % Invasie van cellen worden getest (in 2% CS-FBS) = e
    % Invasie van controle invasieve cellen in (2% CS-FBS) = f
    Invasie Index (CS-FBS) = (e / f)

7. Herhaal Experimenteel protocol Vergelijking Charcoal-gestript FBS Charcoal-gestript FBS + X _n met meerdere factoren samen

1. Herhaal deze procedure meerdere malen als nodig met verschillende onderdelen van "X" of een combinatie van componenten.
2. Breng de berekening van de bijdrage van elke factor "X" op de migratie en invasie effecten bepalen.

Resultaten

De invasie index wordt berekend voor elke conditie volgens normalisatie een invasieve cellijn. Voor onze experimenten gebruiken we de 1205Lu melanoma cellijn en gevestigde variant stabiele cellijnen onze invasieve lijnen en de premaligne invasieve variant WM793 waaruit de 1205Lu cellen werden afgeleid ¹⁰ dat dient als logische controle. Wij gebruiken ook collageen I als de invasie matrix, want dat is de belangrijkste component van de dermis. Dit is in overeenstemming met een eerdere studie waarbij de optimale...

Discussie

Tumormetastase is een meerstaps proces. De cellen moeten breken door de basaalmembraan, intravasate in ofwel het lymfestelsel of bloed microvaatjes, waarin zij worden getransporteerd naar afgelegen plaatsen. De tumorcellen vervolgens extravasatie en koloniseren een macrometastasis ^12. Progressie door de epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), tumor invasie en metastase is verbeterd door steroïde hormonen ^13,14, groeifactoren ^15-18 en cytokinen ^19-21. Deze moleculen zijn...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BioCoat Control Inserts met 8,0 µm PET-membraan	Corning	354578	12 in elk van twee 24-well platen. PET = polyethyleentereftalaat
Collageen I, rattenstaart	Corning	354236	Bron = rattenstaartpees, zuiverheid = 90%
Fixeermiddel; Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	Methanol-gebaseerd fixeermiddel, hematoxylline/eosine
Fétaal bovien serum	Life Technologies	16000	Aangeduid als FBS
Charcoal gestreept fétaal bovien serum	Life Technologies	12676	Aangeduid als CS-FBS
Fétaal bovien serum	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	Aangeduid als FBS
Charcoal gestreept fétaal bovien serum	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	Aangeduid als CS-FBS