Methodenartikel

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen In vitro Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

DOI:

10.3791/51506

⸱

31 augustus 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HIV-1-pathogenese wordt bepaald door zowel virale kenmerken als genetische factoren van de gastheer. Hier beschrijven we een robuuste methode die reproduceerbare metingen mogelijk maakt om de impact van de gag gensequentieverschil op de in vitro replicatiecapaciteit van het virus te beoordelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschermende effect van veel HLA klasse I-allelen op HIV-1 pathogenese en ziekteprogressie wordt, gedeeltelijk, toegeschreven aan hun vermogen om geconserveerde delen van het HIV-1 genoom te targeten die moeilijk ontsnappen. Sequentie-veranderingen die worden toegeschreven aan cellulaire immuundruk ontstaan over het hele genoom tijdens infectie en, indien gevonden binnen geconserveerde gebieden van het genoom zoals Gag, kunnen de vermogen van het virus om zich te repliceren in vitro beïnvloeden. Transmissie van HLA-gelinkte polymorfismen in Gag naar HLA-onverenigbare ontvangers is geassocieerd met verlaagde set point virale belastingen. We veronderstelden dat dit te wijten kan zijn aan een verminderde replicatievermogen van het virus. Hier presenteren we een nieuwe methode voor het beoordelen van de in vitro replicatie van HIV-1 zoals beïnvloed door het gag gen geïsoleerd van acute tijdstippen van subtype C geïnfecteerde Zambianen. Deze methode gebruikt restrictie-enzym-gebaseerde klonering om het gag gen in een gewone subtype C HIV-1 provirale ruggengraat, MJ4, in te voegen. Dit maakt het geschikter voor de studie van subtype C sequenties dan eerdere op recombinatie gebaseerde methoden die de in vitro replicatie van chronisch afkomstige gag-pro sequenties hebben beoordeeld. Niettemin kan het protocol gemakkelijk worden aangepast voor studies van virussen van andere subtypen. Bovendien beschrijft dit protocol een robuuste en reproduceerbare methode voor het beoordelen van de replicatievermogen van de Gag-MJ4 chimere virussen op een CEM-gebaseerde T-cel lijn. Deze methode werd gebruikt voor de studie van Gag-MJ4 chimere virussen afkomstig van 149 subtype C acuut geïnfecteerde Zambianen en heeft de identificatie van residuen in Gag die de replicatie beïnvloeden, mogelijk gemaakt. Belangrijker nog, de implementatie van deze techniek heeft een dieper begrip mogelijk gemaakt van hoe virale replicatie parameters van vroege HIV-1 pathogenese zoals set point virale lading en longitudinale CD4+ T-cel afname bepaalt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om zowel de gastheer en virale kenmerken die invloed HIV-1 pathogenese en progressie van het grootste belang voor rationeel vaccinontwerp. De cellulaire immuunreactie is een belangrijk onderdeel van de menselijke immune reactie op HIV-1 infectie. Cytotoxische T lymfocyten (CTL) zijn nodig voor de eerste controle van acute viremie en laat de host een steady state (set point) viral load 1,2 vestigen. Experimentele depletie van deze effectorcellen leidt tot verlies van virale controle 3,4. Ondanks dit, ontsnappen mutaties ontstaan ​​binnen het virale genoom dat CTL erkenning van viraal geïnfecteerde cellen 5-9 ondermijnen.

Bepaalde HLA allelen zijn geassocieerd met lagere virale lading en tragere progressie van de ziekte zoals B * 57 B * 27 B * 81 en 10-15. Een deel van het beschermende voordeel van HLA klasse I allelen kan worden toegeschreven aan het feit dat ze gericht functioneel beperkte gebieden van het genoom, zoals Gagen selecteren op ontsnappingsmutaties dat het vermogen van het virus om te repliceren in vitro 16-21 verminderen. Hoewel ontsnapping van het cellulaire immuunsysteem is gunstig voor het virus in de context van de selectie HLA klasse I allel, kan het effect van deze mutaties differentiële gevolgen voor de ontvangende upon overbrenging moet een HLA-mismatch individuele 22,23. Daarom is het begrijpen van de effecten van de verzonden-HLA geassocieerd escape mutaties op de virale replicatie capaciteit zal belangrijk zijn om ons begrip van vroege HIV-1 pathogenese bevorderen.

Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij de fitness gebreken van afzonderlijke escape mutaties geassocieerd met specifieke HLA klasse I allelen 24-29 te identificeren en te karakteriseren, natuurlijk voorkomende HIV-1 isolaten zijn unieke en complexe voetafdrukken van HLA-geassocieerde polymorfismen, waarschijnlijk als gevolg van het HLA gemedieerde immuun druk van verschillende immunogenetische achtergronden 30. In apet bestaan ​​analyse Goepfert et al. blijkt dat een accumulatie van HLA-geassocieerde mutaties in het uitgezonden Gag sequenties afgeleid van 88 acuut geïnfecteerde Zambians werd geassocieerd met een vermindering instelling viral load 31. Dit suggereerde dat de overdracht van schadelijke ontsnappingsmutaties, specifiek Gag, HLA-mismatch ontvangers verschaft een klinisch voordeel en kan het gevolg zijn van virale replicatie verzwakt. Moving forward, is het noodzakelijk om te bestuderen hoe complexe combinaties van Gag polymorfismen binnen natuurlijk voorkomende isolaten werken in overleg met de kenmerken van de uitgezonden virus zoals replicatie capaciteit, en hoe vroeg replicatie kunnen op hun beurt van invloed op HIV-1 klinische parameters en de late-fase definiëren pathogenese.

Brockman et al. Eerst een verband tussen de replicatie capaciteit van gag-pro sequenties geïsoleerd tijdens de chronische fase infectie en virale lading in zowel subtype C en B-infecties aangetoond32-35. De experimentele benadering gepresenteerd in deze studies, hoewel geschikt voor de behandeling van in vitro replicatie aantal sequenties, verkregen uit chronisch geïnfecteerde individuen, heeft verschillende technische restricties en beperkingen maken het bestuderen van HIV-1 replicatie capaciteit subtype C acuut geïnfecteerde individuen moeilijk. Deze werkwijze berust op de recombinatie van populatiegebaseerde PCR-geamplificeerde sequenties in de subtype B NL4-3 provirus, dat gedeeltelijk afgeleid van LAV, een laboratorium aangepaste virus stock 36. Virusproductie werd bewerkstelligd door co-transfectie van een CEM-gebaseerde T-cellijn 37 met PCR amplicons en gedigereerd delta gag-pro NL4-3 DNA. Deze methode vereist de uitgroei van virus gedurende weken tot maanden, eventueel vertekening de aard van het teruggewonnen virus stock betrekking tot de virale quasispecies in vivo, en derhalve het veranderen van de meting van replicatie capaciteit in vitro. Deze methode is meer geschikt voor het bestuderen van chronisch geïnfecteerde individuen, waar het effectief kiest voor virus met de hoogste replicatieve capaciteit, en wanneer kloneren tal verschillende virale varianten van een groot aantal chronisch geïnfecteerde individuen is vrij arbeidsintensief en derhalve nog niet. Echter, in een acuut geïnfecteerde individu er doorgaans 01:59 varianten aanwezig, en zo het risico van vertekening de aard van het teruggewonnen virus stock elimineren, door in vitro selectie drukken, zorgt voor een nauwkeurigere bepaling van de in vitro replicatie capaciteit. Tweede methode vereist recombineren subtype C gag-pro-sequenties in een subtype B afgeleide ruggengraat en kan backbone onverenigbaarheid biases in de analyse introduceren. Vanwege deze beperkingen moeten grote aantallen sequenties worden geanalyseerd om mogelijke vertekeningen ingevoerd overwinnen.

Hier beschrijven we een alternatieve experimentele voorkomendach geschikt voor het bestuderen van sequenties afgeleid van subtype C acuut geïnfecteerde individuen. We gebruiken een restrictie-enzym gebaseerde klonering strategie het gag gen afgeleid van acute infectie tijdstippen van HIV-1 subtype C geïnfecteerde individuen in het subtype C provirale backbone, MJ4 voeren. Het gebruik van MJ4 als gemeenschappelijke backbone waarin gag genen kloneren cruciaal voor de analyse van het subtype C afgeleide sequenties. MJ4 is afgeleid van een primair isolaat 38, en zou dus minder waarschijnlijk vertekening door subtype incompatibiliteit tussen de hoofdketen en gag gen. Bovendien is de benadering van het gebruik van restrictie-enzymen gebaseerde klonering maakt de provirale constructen rechtstreeks in 293T-cellen worden getransfecteerd, en voor het herstel van een klonale virus stock identiek aan de gekloneerde sequentie gag.

De methode hieronder weergegeven is een high throughput methode voor het beoordelen van de replicatie capaciteit van subtype C afgeleid Gag-MJ4chimère virussen. Transfectie in 293T-cellen is eenvoudig en terugwinning van virus duurt slechts drie dagen. In vitro replicatie capaciteit getest op dezelfde CEM-CCR5 gebaseerde T-cellijn door Brockman e.a.. 37, maar met belangrijke protocol aanpassingen noodzakelijk voor een succesvolle replicatie subtype C MJ4 chimere virussen. Het gebruik van een geschikte T-cellijn plaats PBMC maakt grote aantallen subtype C MJ4-chimere virussen te testen met hoge assay reproduceerbaarheid. Ten slotte, wordt een radioactief reverse transcriptase assay voor het kwantificeren van virus in het supernatant kosteneffectiever dan met commercieel verkrijgbare p24 ELISA kits. Het geeft ook een hoger dynamisch bereik, die belangrijk zijn voor het detecteren zowel slecht en zeer replicerende virussen binnen dezelfde assay en voor het detecteren van subtiele verschillen in replicatie tussen isolaten.

De conclusie is dat de hier gepresenteerde methode toegestaan ​​voorde grondige studie van de replicatie capaciteit van gag sequenties afgeleid van HIV-1 subtype C acuut geïnfecteerde individuen uit Zambia, en zoals geschreven, kan ook worden uitgebreid naar andere subtype C geïnfecteerde populatie te bestuderen. Een hoge mate van variatie in replicatie capaciteit tussen verschillende Gag isolaten waargenomen. Daarnaast konden we een statistisch verband tussen de replicatie capaciteit van het verzonden Gag en setpoint viral load als met CD4 + daling vertonen gedurende een periode van drie jaar 39. Dergelijke resultaten benadrukken het belang van het bestuderen van hoe doorgelaten virale kenmerken, zoals replicatie capaciteit, interactie met de gastheer immuunsysteem pathogenese beïnvloeden tijdens de vroege infectie en integraal voor het ontwikkelen van effectieve interventies vaccin evenals de behandeling zal zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Versterking van de HIV-1 gag Gene uit Infected, Frozen Plasma

  1. Uittreksel viraal RNA in 140 gl ontdooid HIV-1 geïnfecteerde plasma middels een extractie kit.
    1. Indien haalbaar, onmiddellijk overgaan tot cDNA-synthese na RNA-extractie als onbevroren viraal RNA levert de beste versterking resultaten. Indien mogelijk ingesteld PCR Master Mix voor de eerste ronde van DNA amplificatie en bewaar bij 4 ° C voordat viraal RNA extractie.
  2. Reverse transcriptie-cDNA uit RNA en amplificeren eerste ronde DNA producten middels reverse-transcriptase en een thermostabiel DNA polymerase in een eenstaps RT-PCR.
    1. Neem RNA van -80 ° C vriezer (als bevriezing nodig was) en even ontdooien bij kamertemperatuur en breng vervolgens in koud blok. Breng 5 ul van RNA aan elke PCR buis die 45 gl master mix tot een eindvolume van 50 pi geven. Onmiddellijk plaatst resterende RNA monsters in -80 ° C vriezer.
    2. Na enzym eenT OEGEVOEGDE de eerste ronde PCR Master Mix (tabel 1A), 45 pi aliquot in elk dunwandige PCR amplificatie buis voor het aantal gewenste reacties. Zorg ervoor dat PCR-buisjes met individuele caps te gebruiken en niet te strippen caps minimale kruisbesmetting tussen de monsters te garanderen. Plaats PCR buizen in een koud blok naar de temperatuurgevoelige RT enzym RNA template beschermen. Opmerking: De monsters moeten worden uitgevoerd in drievoud om adequaat te proeven van de virale quasispecies. Het is ook belangrijk om een ​​product met een high fidelity DNA polymerase-enzym te gebruiken om PCR geïntroduceerd verkeerde incorporatie minimaliseren. Verwijzen wij u naar de lijst met reagentia voor het aanbevolen product.
    3. Na RNA template is toegevoegd aan alle reageerbuizen, transfer PCR buizen een thermocycler voor amplificatie met het cyclusprogramma in Tabel 1B beschreven. Opmerking: Het product van de amplificatie wordt gebruikt in een tweede ronde geneste PCR.
  3. Voer een geneste second-round PCR amplificatie met 1 pl van de eerste ronde PCR-amplificatie (1.2) als DNA-matrijs.
    1. Aliquot 49 ul van tweede-ronde-PCR master mix (tabel 2A) aan elke dunwandige PCR-buis voor het aantal reacties gewenst. Breng 1 pl van de eerste ronde PCR amplificatie aan elke reactiebuis een eindvolume van 50 pi geven. Opmerking: Dit zal als template DNA te dienen voor de tweede-ronde versterking. Het is ook belangrijk om een ​​DNA polymerase met een zeer hoge betrouwbaarheid en proeflezen mogelijkheden benutten om PCR geïntroduceerd verkeerde incorporatie minimaliseren. Verwijzen wij u naar de lijst met reagentia voor het aanbevolen product.
    2. Transfer tweede ronde PCR-mix te thermocyclusinrichting en run-programma in Tabel 2B beschreven. Opmerking: Na voltooiing van het programma, de producten van deze reactie worden uitgevoerd op een agarose gel om de productie van het product te bevestigen.
  4. Voeg 3 ul 5x loading dye 5 & #181, l 50 gl tweede ronde reactievolume en draaien met 120 V op een 1% agarose TAE-gel bevattende een UV-fluorescerende DNA vlek tot banden worden opgelost. Visualiseer 1,6 kb banden op een blauw licht verlichting (zie figuur 1A).
  5. Voer de resterende 45 pl reactievolume op een 1% agarose TAE-gel die een DNA vlek en uitsnijden passende banden met een schoon scheermesje.
    1. Extraheer DNA uit de gel slice met een gel zuiveringskit, elueren in nuclease-vrij water, combineer drie positieve reacties per individu en product invriezen bij -20 ° C voor later gebruik.

2 Voorbereiding gag Amplicons voor Klonen door invoeren van de nodige beperking Sites

  1. Versterken de Long Terminal Repeat (LTR) / 5 'UTR gedeelte van de MJ4 plasmide (zie tabel 3).
  2. Visualiseer 1,3 kb PCR-producten op verlichting, accijnzen positieve amplicons, gel zuiveren en zoals eerder bevriezenbeschreven (1.4,1.5 zie figuur 1B).
  3. Maak gesmolten MJ4 LTR- gag ampliconen via "splice-overlap-extensie" PCR (zie tabel 4).
  4. Visualiseren, accijnzen, te zuiveren, en vries het 3,2 kb ampliconen als in 1.4,1.5 (zie figuur 1C).

3 Klonen Amplified gag Genen in de MJ4, Subtype C, Infectious Molecular Clone

  1. Digest 1.5 ug MJ4 plasmide en 1,5 ug gezuiverd LTR- gag PCR product met BclI (methylering gevoelige) restrictie-endonuclease gedurende 1,5 uur bij 50 ° C (zie Tabel 5A).
  2. Voeg 1 ul van NgoMIV de digestie reactie en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  3. Voeg 5x loading kleurstof restrictiedigestie reacties en langzaam Electrophorèse het totale volume op een 1% agarose TAE-gel die een DNA gel kleuring voor 1-2 uur bij 100 V. zichtbaar, accijns en zuiveren deze banden voor klonering zoals eerder described (zie figuur 2).
  4. Bereid ligatiereacties met gezuiverd LTR- gag insert en MJ4 vector-DNA bij een 3: 1 insert naar vector verhouding. Ligatiereacties Incubeer overnacht bij 4 ° C (zie Tabel 5B).
  5. Transformeren JM109 chemisch competente bacteriën ligatieproducten en uitgespreid op LB agar platen met 100 ug / ml ampicilline en groei bij 30 ° C voor 22 + uur.
    1. Dooi JM109 competente cellen op ijs gedurende 15 minuten. Label 1.5 ml microcentrifugebuizen en chill op ijs.
    2. Aliquot 50-100 ul van JM109 cellen pre-gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuizen. Voeg 2,5-5 pi ligatie reactie op JM109 cellen, flicking buis licht te mengen en onmiddellijk terug te keren naar het ijs. Incubeer competente cellen met ligatieproduct op ijs gedurende 30 minuten.
    3. Heat shock 1,5 ml microcentrifuge buisjes die JM109 competente cellen en ligatie reactie in een 42 ° C warmteblok gedurende 45 seconden en terugkeren naar ijs gedurende ten minste 3 minuten.
    4. Voeg 50 pl SOC media aan elke microcentrifugebuis en plaat het gehele transformatie reactiemengsel op kamertemperatuur LB-agarplaten gesupplementeerd met 100 ug / ml ampicilline.
    5. Overdrachtsplaten tot een 30 ° C incubator gedurende 20 uur, of totdat kolonies duidelijk gevormd.
  6. Extra geïsoleerde kolonies en groeien in 4 ml LB met 100 ug / ml ampicilline bij 30 ° C voor 22 + uur.
  7. Spin down kweken bij 3200 xg gedurende 15 min, giet bouillon, en plasmide-DNA te extraheren.
  8. Om te bevestigen klonen trouw miniprep DNA geknipt met HpaI en NgoMIV restrictie-enzymen in een dubbel digest bij 37 ° C gedurende 2 uur. Analyseer op 1% agarose-TAE gel (zie tabel 5C).
  9. Type de LTR-gag insertgebied van elk plasmide met de volgende primers: GagInnerF1, GagF2, Rev1, Rev3 en GagR6 (Tabel 6) sequentie identiteit te bevestigen.
  10. Vergelijk de gekloonde sequenties die zijn verkregen met de bevolking sequenties derived van de eerste gezuiverde amplicon van 1.5.1. Opmerking: Het is belangrijk de replicatie capaciteit van twee onafhankelijke klonen om uiteindelijk na te zorgen dat de in vitro replicatie fenotypes niet door backbone fouten die tijdens het klonen.

4 Generatie en titering replicatiecompetent Gag-MJ4 Chimeric Virussen

  1. Genereer replicatie competent virus door transfecteren 1,5 ug van het chimere plasmide MJ4 miniprep DNA in 293T-cellen met een 4: 1 verhouding van Fugene HD zoals beschreven door Prince c.s. 39.
  2. Titer geoogst virusvoorraden op TZM-bl cellen zoals beschreven hieronder en in Prins et al 39.
    1. Plate TZM-bl cellen 24 uur vóór infectie met virus om een ​​30-40% confluente monolayer van cellen op de volgende dag. Dit kan gewoonlijk worden bereikt door toevoeging van 5 x 10 4 cellen in een totaal volume van 800 ul per putje in een 24-well plaat.
    2. Na het toevoegen van cellen om het goed, beweeg de 24-well plaat naar voren en weer terug, dan van links naar rechts om de cellen efficiënt te distribueren. Nooit swirl - dit zal resulteren in cellen ophopen in het midden van de plaat.
    3. De volgende dag, bereid 1% FBS in DMEM; deze wordt gebruikt om verdunnen DEAE-dextraan en virusvoorraden verdunnen. De DEAE-Dextran is 10 mg / ml of 125x, en een uiteindelijke concentratie van 80 ug / ml of 1x gewenst.
    4. Neem virus voorraad te testen van -80 ° C vriezer en plaats op shaker te ontdooien op kamertemperatuur.
    5. Met behulp van een multichannel pipet, serieel verdund virus voorraden in een ronde bodem weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes met deksel. Dit is een 3-voudige verdunning protocol. Zie tabel 7 voor de verdunning regeling.
    6. Verwijder het afdrukmateriaal uit gezaaid TZM-bl 24-well platen met behulp van een vacuüm aspirator zorg ervoor celmonolaag niet te verstoren. Verwijder het medium Slechts van een 24-well plaat op een moment, zodat cellenniet uitdrogen.
    7. Voeg 150 ul van 1 x DEAE-Dextran + 1% FBS in DMEM mengsel aan elk putje met een 1.000 III pipet. Gebruik geen herhaling pipet als dit verstoort de monolaag.
    8. Voeg 150 pi van elke virusverdunning de juiste goed. Virus In het midden van het putje en schud zachtjes gelijkmatig verdelen virus in de cel monolaag. Incubeer geïnfecteerde cellen gedurende 2 uur in een weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
    9. Na 2 uur incubatie wordt 0,5 ml 10% FBS in DMEM aan elk putje en platen incubator keren nog eens 48 uur.
    10. Na 48 uur moeten de cellen 100% confluent zijn. Omdat MJ4 is een replicatie competent virus, zal er enige celdood, maar dit is te verwachten.
    11. Verwijder het afdrukmateriaal uit elk putje en voeg 400 ul / putje van de vaststelling oplossing (zie tabel 8A voor recept). Fix slechts een plaat tegelijk. Voeg fixeeroplossing met een 1.000 ul pipet en laat zitten voor 5 min bijkamertemperatuur.
    12. Verwijder fixeeroplossing en was 3x met PBS met Ca 2 + / Mg 2 +. Gebruik een spuitfles voorzichtig toevoegen PBS aan de zijkant van de put te verstoren de monolaag. Na de derde wasbeurt, vlek plaat droog op absorberend papier.
    13. Voeg 400 ul / putje kleuroplossing (zie Tabel 8B voor recept) aan elk putje van de 24-well plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 2 uur. Langere incubatietijd tijden zijn aanvaardbaar, maar incubatietijd moeten consistent tussen titering experimenten worden gehouden.
    14. Was 2x met PBS met Ca 2 + / Mg 2 + en scoren voor infectie, of voeg PBS en bewaar bij 4 ° C voor het scoren later. Platen kunnen bij 4 ° C bewaard tot vier dagen, zolang de monolaag gehydrateerd blijft.
    15. Om te scoren voor de infectie, gebruik maken van een permanent marker op putjes van de 24-well plaat verdelen in kwadranten. Tel alle blauwe cellen binnen een gezichtsveld, met een totale vergroting van 200X, eenmaal inelk van de vier kwadranten van een goed.
    16. Bereken infectieuze eenheden per ul als volgt: [(# blauwe cellen / 4) x 67] / (pi virus toegevoegd) = IE / ul. Zie Tabel 8C voor volume gl virus toegevoegd aan elk putje. Gemiddeld aantal putjes tezamen; de getallen moet betrekkelijk Vertaald een nauwkeurige titratie.

5 Voorbereiding van Cultuur Media en Voortplanting van GXR25 Cellen voor in vitro replicatie Assay

  1. Bereid compleet RPMI (cRPMI) voor de vermeerdering van GXR25 cellen. LET OP: Het is uiterst belangrijk om de cultuur GXR25 cellen ten minste 4 maanden voorafgaand aan de geplande replicatie-experimenten (zie tabel 9).
  2. Split cellen 1:10 twee keer per week en onderhouden celdichtheid van 1 x 05-2 oktober x 10 6 cellen / ml.

6 In vitro replicatie van Gag-MJ4 Hersenschimmen in GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Cellen

  1. De dag voor de infection, splitsen cellen om een concentratie van 2-3 x 10 5 cellen / ml, zodat zij in logaritmische groei op de dag van de infectie.
  2. Op de dag van infectie te verwijderen virus voorraden van -80 ° C vriezer en ontdooien. Bereken de hoeveelheid virus die nodig is van elke stock volgens de IU / ul titer van TZM-bl cell assay om 5 x 10 5 GXR25 cellen te infecteren bij een multipliciteit van infectie van 0,05 met de volgende formule:
    Volume van het virus voor infectie (pi) = 1 pi / X IE x 0,05 x 500.000
    OPMERKING: We kiezen een MOI van 0,05 en resulteert in een logaritmische groeifase voor alle virussen die we hebben getest. Het is belangrijk initiële experimenten om de optimale MOI bepalen logaritmische groei vangen van het virus te testen.
  3. Verdun virus in cRPMI tot een volume van 100 ul (om een ​​0,05 MOI te bereiken) en voeg in een putje van een V-bodem weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes. Opmerking: Omvat zowel een positive (MJ4 WT geïnfecteerde) en een negatieve (mock geïnfecteerde cellen) controle in elke set replicatie experimenten. Het opzetten van de plaat zodanig dat elke andere kolom is leeg om kruisbesmetting tussen de putten te beperken. De positieve controle is noodzakelijk, zoals later als een standaard worden gebruikt om de replicatie hellingen, die een maat is voor de replicatie snelheid van experimentele herhalingen zijn normaliseren.
  4. Telling GXR25 cellen middels een geautomatiseerde celtelinrichting. Bereken het aantal cellen nodig totaal voor alle virussen (5 x 10 5 x # infecties). Aliquot het gewenste volume in een 50 ml conische buis en gecentrifugeerd om cellen te pelleteren. Bereken altijd voor 25% meer infecties dan nodig is.
  5. Zuig media zorgvuldig en resuspendeer in cRPMI bij een concentratie van 5 x 10 5 cellen / 100 ul.
  6. Pipet cellen in een steriele bak en meng. Een multi-kanaal pipet 100 ul cellen in elk putje van de 96-well plaat met de verdunde virus. Mix grondig.
  7. Voeg 2 pl van 5 mg / ml (100x) oplossing van polybreen aan elke well en meng grondig cellen.
  8. Incubeer bij 37 ° C in weefselkweek incubator met 5% CO2 gedurende 3 uur.
  9. Om geïnfecteerde cellen te wassen, centrifuge 96-well V-bodemplaat cellen neer. Dan verwijder voorzichtig 150 pi van het medium en te vervangen door verse 150 ul van cRPMI zonder verstoring van de cel pellet. Herhaal 2 keer (inclusief centrifugatie) cellen voldoende wassen.
  10. Na de laatste centrifugatie en toevoeging van 150 ul cRPMI, resuspendeer de celpellet met een multichannel pipet en voeg de gehele cel / virus mengsel (ongeveer 200 pl) van elk putje afzonderlijk 800 gl cRPMI in een putje van een 24-well tissue kweekplaat.
  11. Place plaat in 5% CO 2 weefselkweek incubator bij 37 ° C.
  12. Elke twee dagen, verwijder 100 ul supernatant van buitenzijde kweekputje en overbrengen naar een 96-well U-Bottom plaat en opslag bevroren bij -80 ° C tot actief virus kwantificering assay. OPMERKING: Zorgvuldige regeling van supernatanten in 96-well platen zal voor multi-channel pipet overdracht van kweeksupernatanten tijdens virion kwantificering via een radioactief reverse transcriptase (RT) assay. Elke plaat moeten monsters uit een infectie standaard bevatten om inter-plaat variatie normaliseren in de RT-assay uitlezing.
  13. Na het verwijderen van elk 100 pl monster, split cellen 1: 2 grondig resuspenderen cellen en verwijderen helft van de resterende volume (450 pl). Herstel oorspronkelijke volume (1 ml) door toevoeging van 550 pl vers cRPMI aan elk putje.

7 Analyse van Reverse Transcriptase (RT) in celkweeksupernatanten

Protocol aangepast van Ostrowski et al 40.

  1. Opgezet biologische veiligheid kap in een BSL-3-faciliteit voor gebruik met radioactieve stoffen.
    1. Leg absorberend papier in hood en vervang aspirator voor aspirator aangewezen voor radioactieve gebruik. Opmerking: Alle radioactief afval moet goed worden afgevoerd met het volgens de veiligheidsvoorschriften.
  2. Voeg 1-2 ul van 10 mCi / ml [α- 33P] dTTP en 4 ui van 1 M dithiothreitol (DTT) aan elke 1 ml van RT master mix (zie tabel 10 en Ostrowski et al. 40).
  3. Meng zorgvuldig elk 1,5 ml microcentrifugebuisje van RT master mix, DTT, en [α- 33P] dTTP met een 1.000 ul pipet overgebracht in een steriele trog.
  4. Breng 25 pl gelabelde RT mengen in elke well van 96-well dunwandige PCR plaat. Opmerking: Inclusief ruimte voor een positieve controle (MJ4 WT infectie) en negatieve controle (Mock-infectie).
  5. Voeg 5 ul van elk supernatant van de PCR-plaat met de RT master mix.
  6. Verbinding PCR plaat met zelfklevende folie deksel en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in een thermocycler. Om veiligheidsredenen, rinse pipet tips met Amphyl en gooi tips in kleine container met Amphyl afval, die later zal worden vernietigd radioactief afval.
  7. Na incubatie kleine gaatjes in het folie deksel met een 200 ul multichannel pipet. Opmerking: Als pipetuiteinden raken vloeistof in goed, vervang tips voordat u naar de volgende kolom of rij.
  8. Mix monsters 5x en overdracht 5 ul van elk monster voor de DE-81 papier. Lucht drogen 10 minuten.
  9. Was blots 5x met 1x SSC (natriumchloride, natriumcitraat), en vervolgens 2x met 90% ethanol bij 5 min per wasbeurt. Laat drogen.
    1. Plaats elke vlek in een aparte container wassen, zoals een sandwich opbergdoos, voeg voldoende wasbuffer (1 x SSC en 90% EtOH) ter dekking blot en schud 5 minuten.
    2. Giet wasbuffer in aparte container en herhaal. Opmerking: De eerste 3 wast zijn radioactief beschouwd en moeten worden afgevoerd. De laatste 2 wasbeurten kan worden afgevoerd regelmatig.
  10. Eenmaal droog, autoefully wikkel blot in Saran wrap en blootstellen aan een phosphoscreen in een goed afgesloten cassette nacht bij kamertemperatuur geroerd.
  11. Analyseer phosphoscreens met een fosforimager en kwantificeren radioactieve transcripties.
  12. Teken een cirkel rond elke radioactieve signaal met behulp Optiquant software. De grafiek van de Digital Light Unit (EBA) waarden tot replicatie curves genereren.
  13. Om replicatiecapaciteit scores genereren DLU-waarden log 10 getransformeerde en hellingen werden berekend met het dag 2, 4 en 6 tijdstippen. Replicatie hellingen worden vervolgens gedeeld door de helling van de WT MJ4 om genereren replicatiecapaciteit scores. Het is belangrijk te normaliseren op basis van de MJ4 WT waarden verkregen uit dezelfde RT plaat intra-assay variatie verminderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om dit protocol, dat een proviraal plasmide in staat is het monteren van een volledig functionele, besmettelijke Gag-MJ4 hersenschimmen creëert goed uit te voeren, moet grote zorg worden genomen om de geschikte PCR amplicons genereren. Bepalen of de PCR de juiste maat gag amplicon heeft gegenereerd is cruciaal. Producten moeten binnen 100 basenparen (bp) van de ongeveer 1.700 bp amplicon weergegeven in figuur 1A. De exacte lengte van dit fragment is afhankelijk van het gag-gen onder st...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door de lengte en de technische aard van dit protocol, zijn er verschillende stappen die kritiek zijn voor zowel de succesvolle constructie van chimere Gag-MJ4 plasmiden en voor kwantificering van virale replicatie capaciteit zijn. Hoewel het restrictie-enzym gebaseerde klonen strategie voor de invoering van buitenlandse gag genen in MJ4 beschreven in dit protocol heeft tal van voordelen ten opzichte van eerder gebruikte recombinatie gebaseerde methoden, kan het protocol technisch uitdagend zijn als kritische s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De onderzoekers danken alle vrijwilligers in Zambia die aan dit onderzoek hebben deelgenomen en al het personeel van het Zambia Emory HIV Research Project in Lusaka die dit onderzoek mogelijk hebben gemaakt. De onderzoekers willen Jon Allen, Smita Chavan en Mackenzie Hurlston bedanken voor hun technische assistentie en beheer van monsters. We willen ook Dr. Mark Brockman bedanken voor zijn discussies en genereuze donatie van de GXR25 cellen.

Dit onderzoek werd gefinancierd door R01 AI64060 en R37 AI51231 (EH) en de International AIDS Vaccine Initiative. Dit werk werd gedeeltelijk mogelijk gemaakt door de genereuze steun van het Amerikaanse volk via de United States Agency for International Development (USAID). De inhoud is de verantwoordelijkheid van de auteurs van het onderzoek en geeft niet noodzakelijkerwijs de opvattingen weer van USAID of de Amerikaanse overheid. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door de Virology Core bij het Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC en JP werden gedeeltelijk ondersteund door Action Cycling Fellowships. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Yerkes National Primate Research Center basissubsidie (2P51RR000165-51). Dit project werd ook gedeeltelijk gefinancierd door het National Center for Research Resources P51RR165 en wordt momenteel ondersteund door het Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PCR Reagents
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Nuclease free waterFisherSH30538FSManufactured by Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 Strip Tubes, Blue (Flat Cap)DaiggerEF3647BX
SuperScript III one-step RT-PCR systemLife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II DNA polymeraseFisherF-549L
PCR Nucleotide MixRoche4638956001
Agarose, high gel strengthFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb DNA ladderFisherPRG5711Manufactured by Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPromegaA9282
Razor blades, single-edgedFisher12-640Manufactured by Surgical Design
Thermocycler, PTC-200MJ Research
Microbiology & Cloning Reagents
LB Agar, MillerFisherBP1425-2
LB Broth, LennoxFisherBP1427-2
Sterile 100 x 15 mm polystyrene Petri dishesFisher08-757-12
Ampicillin sodium saltSigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml Polypropylene round-bottom tubesBD Biosciences352059
NgoMIV restriction endonucleaseNew England BioLabsR0564L
BclI restriction endonucleaseNew England BioLabsR0160L
HpaI restriction endonucleaseNew England BioLabsR0105L
T4 DNA Ligase, 5 U/μlRoche10799009001
JM109 competent cells, >108 cfu/μgPromegaL2001
PureYield plasmid miniprep systemPromegaA1222
Safe Imager 2.0 Blue Light TransilluminatorInvitrogenG6600
Microfuge 18 centrifugeBeckman Coulter367160
Cell Culture Reagents
Amphyl cleaner/disinfectantFisher22-030-394
Fugene HD, 1 mlVWRPAE2311Manufactured by Promega
Hexadimethrine bromide (Polybrene)Sigma-AldrichH9268-5G
Costar Plates, 6-well, flatFisher07-200-83Manufactured by Corning Life
Costar Plates, 24-well, flatFisher07-200-84Manufactured by Corning Life
Costar Plates, 96-well, roundFisher07-200-95Manufactured by Corning Life
Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2Fisher10-126-37
Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm2Fisher10-126-34Manufactured by Corning Life
Conical Tubes, 50 ml, blue capFisher14-432-22Manufactured by BD Biosciences
Conical Tubes, 15 ml, blue capFisher14-959-70CManufactured by BD Biosciences
Trypsin-EDTAFisherMT25052CIManufactured by Mediatech
RPMI, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
Penicillin/Streptomycin/Glutamine, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS with magnesium and calcium, 500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 68, 6103-6110 (1994).
  2. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology. 68, 4650-4655 (1994).
  3. Jin, X., et al. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. The Journal of experimental medicine. 189, 991-998 (1999).
  4. Schmitz, J. E., et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science. 283, 857-860 (1999).
  5. Brumme, Z. L., et al. Marked epitope- and allele-specific differences in rates of mutation in human immunodeficiency type 1 (HIV-1) Gag, Pol, and Nef cytotoxic T-lymphocyte epitopes in acute/early HIV-1 infection. Journal of virology. 82, 9216-9227 (2008).
  6. Leslie, A. J., et al. HIV evolution: CTL escape mutation and reversion after transmission. Nature medicine. 10, 282-289 (2004).
  7. Phillips, R. E., et al. Human immunodeficiency virus genetic variation that can escape cytotoxic T cell recognition. Nature. 354, 453-459 (1991).
  8. Price, D. A., et al. Positive selection of HIV-1 cytotoxic T lymphocyte escape variants during primary infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 1890-1895 (1997).
  9. Goulder, P. J., et al. Late escape from an immunodominant cytotoxic T-lymphocyte response associated with progression to AIDS. Nature. 3, 212-217 (1997).
  10. Tang, J., et al. Favorable and unfavorable HLA class I alleles and haplotypes in Zambians predominantly infected with clade C human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 76, 8276-8284 (2002).
  11. Prentice, H. A., et al. HLA-B*57 versus HLA-B*81 in HIV-1 infection: slow and steady wins the race. Journal of virology. 87, 4043-4051 (2013).
  12. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 2709-2714 (2000).
  13. Leslie, A., et al. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection. Journal of virology. 84, 9879-9888 (2010).
  14. Kaslow, R. A., et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nature medicine. 2, 405-411 (1996).
  15. Altfeld, M., et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS. 17, 2581-2591 (2003).
  16. Kiepiela, P., et al. CD8+ T-cell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load. Nature medicine. 13, 46-53 (2007).
  17. Mothe, B., et al. Definition of the viral targets of protective HIV-1-specific T cell responses. Journal of translational medicine. 9, 208(2011).
  18. Peyerl, F. W., Barouch, D. H., Letvin, N. L. Structural constraints on viral escape from HIV- and SIV-specific cytotoxic T-lymphocytes. Viral immunology. 17, 144-151 (2004).
  19. Rolland, M., et al. Broad and Gag-biased HIV-1 epitope repertoires are associated with lower viral loads. PloS one. 3, e1424(2008).
  20. Wagner, R., et al. Molecular and functional analysis of a conserved CTL epitope in HIV-1 p24 recognized from a long-term nonprogressor: constraints on immune escape associated with targeting a sequence essential for viral replication. J Immunol. 162, 3727-3734 (1999).
  21. Wang, Y. E., et al. Protective HLA class I alleles that restrict acute-phase CD8+ T-cell responses are associated with viral escape mutations located in highly conserved regions of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 83, 1845-1855 (2009).
  22. Chopera, D. R., et al. Transmission of HIV-1 CTL escape variants provides HLA-mismatched recipients with a survival advantage. PLoS pathogens. 4, e1000033(2008).
  23. Crawford, H., et al. Evolution of HLA-B*5703 HIV-1 escape mutations in HLA-B*5703-positive individuals and their transmission recipients. The Journal of experimental medicine. 206, 909-921 (2009).
  24. Boutwell, C. L., et al. Frequent and variable cytotoxic-T-lymphocyte escape-associated fitness costs in the human immunodeficiency virus type 1 subtype B Gag proteins. Journal of virology. 87, 3952-3965 (2013).
  25. Brockman, M. A., et al. Escape and compensation from early HLA-B57-mediated cytotoxic T-lymphocyte pressure on human immunodeficiency virus type 1 Gag alter capsid interactions with cyclophilin A. Journal of virology. 81, 12608-12618 (2007).
  26. Crawford, H., et al. Compensatory mutation partially restores fitness and delays reversion of escape mutation within the immunodominant HLA-B*5703-restricted Gag epitope in chronic human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 81, 8346-8351 (2007).
  27. Martinez-Picado, J., et al. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 80, 3617-3623 (2006).
  28. Schneidewind, A., et al. Escape from the dominant HLA-B27-restricted cytotoxic T-lymphocyte response in Gag is associated with a dramatic reduction in human immunodeficiency virus type 1 replication. Journal of virology. 81, 12382-12393 (2007).
  29. Wright, J. K., et al. Impact of HLA-B*81-associated mutations in HIV-1 Gag on viral replication capacity. Journal of virology. 86, 3193-3199 (2012).
  30. Kawashima, Y., et al. Adaptation of HIV-1 to human leukocyte antigen class I. Nature. 458, 641-645 (2009).
  31. Goepfert, P. A., et al. Transmission of HIV-1 Gag immune escape mutations is associated with reduced viral load in linked recipients. The Journal of experimental medicine. 205, 1009-1017 (2008).
  32. Brockman, M. A., et al. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication capacity that may be largely compensated for in chronic infection. Journal of virology. 84, 11937-11949 (2010).
  33. Huang, K. H., et al. Progression to AIDS in South Africa is associated with both reverting and compensatory viral mutations. PloS one. 6, e19018(2011).
  34. Wright, J. K., et al. Gag-protease-mediated replication capacity in HIV-1 subtype C chronic infection: associations with HLA type and clinical parameters. Journal of virology. 84, 10820-10831 (2010).
  35. Wright, J. K., et al. Influence of Gag-protease-mediated replication capacity on disease progression in individuals recently infected with HIV-1 subtype. C. Journal of virology. 85, 3996-4006 (2011).
  36. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. Journal of virology. 59, 284-291 (1986).
  37. Brockman, M. A., Tanzi, G. O., Walker, B. D., Allen, T. M. Use of a novel GFP reporter cell line to examine replication capacity of CXCR4- and CCR5-tropic HIV-1 by flow cytometry. Journal of virology. 131, 134-142 (2006).
  38. Ndung'u, T., Renjifo, B., Essex, M. Construction and analysis of an infectious human Immunodeficiency virus type 1 subtype C molecular clone. Journal of virology. 75, 4964-4972 (2001).
  39. Prince, J. L., et al. Role of transmitted Gag CTL polymorphisms in defining replicative capacity and early HIV-1 pathogenesis. PLoS pathogens. 8, e1003041(2012).
  40. Ostrowski, M. A., Chun, T. W., Cheseboro, B., Stanley, S. K., Tremblay, M., et al. Detection assays for HIV proteins. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al.]. 12 (Unit 12 15), Forthcoming.
  41. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  42. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
  43. Bichara, M., Pinet, I., Schumacher, S., Fuchs, R. P. Mechanisms of dinucleotide repeat instability in Escherichia coli. Genetics. 154, 533-542 (2000).
  44. Ackerson, B., Rey, O., Canon, J., Krogstad, P. Cells with high cyclophilin A content support replication of human immunodeficiency virus type 1 Gag mutants with decreased ability to incorporate cyclophilin A. Journal of virology. 72, 303-308 (1998).
  45. Dudley, D. M., et al. A novel yeast-based recombination method to clone and propagate diverse HIV-1 isolates. BioTechniques. 46, 458-467 (2009).
  46. Ganser-Pornillos, B. K., von Schwedler, U. K., Stray, K. M., Aiken, C., Sundquist, W. I. Assembly properties of the human immunodeficiency virus type 1 CA protein. Journal of virology. 78, 2545-2552 (2004).
  47. Forshey, B. M., von Schwedler, U., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. Journal of virology. 76, 5667-5677 (2002).
  48. Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G., Haseltine, W. A. Effect of mutations affecting the p6 gag protein on human immunodeficiency virus particle release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 3195-3199 (1991).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HIV 1 Replication CapacityRestriction Enzyme CloningSubtype C HIV 1CEM Based T Cell LineRadio Labeled Reverse Transcriptase AssayViral Stock TiteringNested RT PCR AmplificationBCL One Restriction DigestionGXR25 Cell Infection

Gerelateerde artikelen