Methodenartikel

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

DOI:

10.3791/51510

⸱

21 februari 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, Institute for Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin, 4Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, 5Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bottom-up synthetische biologie biedt een nieuwe benadering voor het onderzoeken en reconstitueren biochemische systemen en mogelijk minimale organismen. Dit nieuwe terrein bezig ingenieurs, chemici, biologen en natuurkundigen te ontwerpen en assembleren fundamentele biologische componenten in complexe, goed functionerende systemen van beneden naar boven. Dergelijke bottom-up systemen kan leiden tot de ontwikkeling van kunstmatige cellen voor fundamenteel biologisch onderzoek en innovatieve therapieën 1,2. Giant unilamellaire blaasjes (GUVs) kan dienen als model platform voor synthetische biologie vanwege hun cel-achtige membraan structuur en omvang. Microfluïdische jetting of microjetting, is een techniek die het mogelijk maakt voor het genereren van GUVs met gecontroleerde grootte, membraansamenstelling, transmembraan eiwit incorporatie en inkapseling 3. Het basisprincipe van deze werkwijze is het gebruik van meerdere, hoogfrequente fluïdum pulsen gegenereerd door een piëzo-inkjet-inrichting een gesuspendeerde l vervormenIPID dubbellaag in een GUV. Het proces is te vergelijken met het blazen zeepbellen uit een soap film. Door het variëren van de samenstelling van de gespoten oplossing, de samenstelling van de oplossing omvat, en / of de componenten van de bilaag, kunnen onderzoekers deze techniek toegepast om aangepaste blaasjes maken. Dit document beschrijft de procedure voor eenvoudige blaasjes genereren uit een druppel-interface dubbellaag door microjetting.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is steeds duidelijker geworden dat de celbiologie is een multi-schaal probleem dat impliceert het integreren van ons begrip van moleculen tot cellen. Bijgevolg weten precies hoe moleculen werken individueel is niet voldoende om complexe cellulaire gedrag te begrijpen. Dit is deels te wijten aan het bestaan ​​van de inzichten in het gedrag van multi-component systemen, zoals wordt geïllustreerd door de reconstructie van actine netwerk interactie met lipidedubbellaag blaasjes 4, mitotische spoel assemblage in Xenopus extraheren 5 en ruimtelijke dynamiek van bacteriële celdeling machines 6. Een manier om de reductionistische de aanpak van het ontleden van de moleculaire processen van levende systemen een aanvulling is op de tegenovergestelde benadering voor de reconstructie van cellulaire gedrag met behulp van een minimale set van biologische componenten te nemen. Een belangrijk onderdeel van deze benadering betrouwbare inkapseling van biomoleculen in een afgesloten volume, een belangrijk kenmerk van een cel.

e_content "> Verschillende strategieën bestaan ​​voor het inkapselen van biomoleculen te bestuderen biomimetic systemen. De meest biologisch relevante systeem is lipidedubbellaag membranen, die de biochemische en fysische beperkingen opgelegd door de cel plasmamembraan Vorming van reusachtige unilamellaire blaasjes (GUVs) door electroformation 7 na te bootsen., een van de meest gebruikte technieken GUV generatie 14, typisch een slechte inkapseling opbrengst vanwege de onverenigbaarheid met hoge zout buffer 8. Electroformation vereist ook grote monstervolumes (> 100 ui), die een probleem zijn voor het werken met gezuiverde eiwitten en inefficiënt bevat grote moleculen wegens moeilijkheid diffusie tussen dicht bij elkaar gelegen lipide lagen. microfluïdische verschillende benaderingen voor het genereren van lipide vesicles ontwikkeld. De dubbele emulsie methoden die componenten passeren twee grensvlakken tussen lagen water-olie-water (W / O / W), gebaseerd op de verdamping van een volatile oplosmiddel lipide bilaag vorming 9 rijden. Anderen hebben een microfluïdisch assemblagelijn dat een continue stroom van lipidendubbellaag blaasjes 10 of in twee onafhankelijke stappen 11 produceert gebruikt. We hebben een alternatieve techniek die gebaseerd is op snel toepassen van vloeistof pulsen tegen een druppel-interface bilayer 12 tot GUVs van gecontroleerde omvang, samenstelling, en inkapseling produceren. Onze benadering, bekend als microfluïdische jetting, biedt de gecombineerde voordelen van verscheidene bestaande blaasje generatie technieken verschaffen een aanpak voor het maken van functionele biomoleculaire systemen voor het onderzoeken van verschillende biologische problemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Infinity Kamer Fabrication

  1. Ontwerp de infinity kamer (genoemd naar zijn vorm) met behulp van een computer-assisted design (CAD)-software, en sla het bestand, zodat het compatibel is met een laser cutter. Om deze vorm, aparte twee cirkels met een diameter van 0.183 creëren door een hart-op-hart afstand van 0,15 inch Snijd de kamer van 1/8- 3/16 in helder acryl met de laser cutter. De infinity vorm vergemakkelijkt druppel-interface dubbellaagsformatie en stabiliteit.
  2. Boor een 1/16 in gat door de rand van de acryl-kamer naar de infinity-vormige goed. Herhaal aan de andere kant. Snijd een kleine rechthoek van een 0,2 mm acrylplaat met een schaar of een lasersnijmachine om te dienen als bodem aan de putjes.
  3. Een dunne maar volledige laag sneldrogende lijm aan een zijde van de 0,2 mm acrylaat en lijm aan de bodem van de kamer. Houd de 0,2 mm acrylaat goed stevig op de bodem van de kamer en afziende lijm op het grensvlak zodat de lijm om een ​​afdichting te maken maar vermijd die het weergavegebied. Zorg ervoor dat de acryl af te stemmen, zodat de rand gelijk ligt met de rand van de kamerwand en deze goed aansluit op de oneindigheid kamer uitsparing. Dit zal zorgen voor voldoende jet penetratie en lekkage van de put te voorkomen.
  4. Snij twee kleine stukjes van natuurlijke rubber om de geboorde gaten te dekken. Solliciteer sneldrogende lijm rond het gat. Plaats de rubber over de opening en druk op alle gebieden met een pincet te beveiligen. Herhaal dit voor beide boorgaten. Zorg ervoor dat alle lijmverbindingen zijn compleet afdichtingen om lekkage te voorkomen.
  5. Met behulp van een 23G, 1 in naald, prik een gat in de natuurlijke rubber aan beide zijden van de kamer om het inbrengen van de piëzo-elektrische inkjet tip vergemakkelijken.

2. Experimentele Voorbereiding

Fokvee lipide in chloroform in een -20 ° C vriezer. Voor dit onderzoek, hetzij 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPhPC) of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) gebruikt. 2 ml 25 mg / ml lipideoplossing wordt typisch bereid in dit protocol en zal twee maanden indien bewaard bij -20 ° C.

  1. Aan de lipide opnieuw in suspensie in n-decaan, eerst overbrengen van een voorraad flesje om een kleine glazen pot, en zachtjes droog onder argon of stikstof. Houd de pot schuin tijdens het drogen meer oppervlak blootstellen aan het gas, waardoor de lipide sneller te drogen.
  2. Met de dop van de fles slechts licht opgeschroefd, zodat de gedroogde oplossing te zitten onder vacuüm in een exsiccator voor 1-2 uur. Voeg dan n-decaan aan de lipide resolubilize 25 mg / ml. Vortex de lipide oplossing kort en ultrasone trillingen in een badsonicator gedurende 15 minuten. Bewaar de gereconstitueerde lipide in n-decaan bij -20 ° C.
  3. Bereid een voorraad sucrose-oplossing. In een 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 900 ul van 300 mM sucrose en 100 plvan 1% methylcellulose (MC). Methylcellulose wordt toegevoegd om de viscositeit van de oplossing, die helpt bij jetting verhogen. Optionele stap: Voeg een optionele 1 pl van donker gekleurde voedsel kleurstof of fluorescerende kralen om meer contrast of fluorescentie respectievelijk lenen in de beeldvorming,. Deze oplossing is een 300 mOsm sucrose oplossing die is ontworpen om cellulaire osmolariteit passen en het contrast te bieden tijdens microjetting.
  4. Zuig de oplossing in een 1 ml plastic wegwerp spuit. Houd de spuit met de punt naar boven, flick de as herhaaldelijk om eventuele luchtbellen in de richting van de punt te verdrijven, en duw de zuiger om de opgesloten lucht te werpen. Zorg ervoor dat alle lucht uit de spuit voordat u verder gaat, want het zal interfereren met de juiste piëzo krimp verantwoordelijk voor het spuiten.
  5. Installeer een 0,22 urn filter op het uiteinde van de spuit. Om te voorkomen dat de lucht wordt gevangen in het filter, houd de spuit verticaal en duw de zuiger totdat een druppel boven de punt wordt gevormd. Opmerking: Een33 mm spuitfilter eenheid bleek het beste te werken, maar andere filters zo klein als 3 mm spuitfilter kan worden gebruikt om dode volume te verminderen.
  6. Schroef de vrouwelijke Luer-adapter van de inkjet-, en veilig op zijn plaats over het uiteinde van de filter. Nogmaals, uitwerpen vloeistof om te voorkomen dat lucht in. Schroef in de top van de inkjet. De vloeistof moet reizen naar de punt van de inkjet nadat dit volledig is bevestigd.

3. Klaarmaken van de apparatuur

  1. Met behulp van een v-klem, zet de spuit geheel op de microscoop podium. Bevestig de draad van de inkjet om de inkjet controller. Opmerking: Een aangepaste fase werd voor dit protocol, terwijl de fase ontwerp kan worden bepaald door de gebruiker, is het essentieel om onafhankelijk xyz controle van de spuit en xy controle van de monsterhouder.
  2. Bepaal de vergroting en noodzakelijk lenscombinatie om de gewenste weergave te bereiken. Hier een 10X objectief en 10X oculair worden gebruikt.
  3. Gebruik een high-speed camera (≥ 1000 fps) aan de jetting en blaasje generatie visualiseren. Voorafgaand aan beeldvorming, voeren noodzakelijk camerakalibratie. Gebruik maken van beeld-gebaseerde auto-trekker in de camera software om het vastleggen van beelden te starten.
  4. Monteer de oneindigheid kamer op de microscoop podium. Zet de kamer door met tape op zijn plaats op het podium.
  5. Lijn de inkjet tip voorzichtig met het gat doorboord in de natuurlijke rubber (zie figuur 1b). Om dit te doen, breng de inkjet dicht bij de kamer en de positionering op het oog aan te passen, maak dan meer nauwkeurige aanpassingen door de microscoop lens. Voorzichtigheid te betrachten, als grove bewegingen de inkjet tip kan beschadigen.
  6. Zodra de inkjet uitgelijnd, terug de injectiespuit verwijderd uit de kamer om schade aan de inkjet tijdens het laden van de putjes te voorkomen. Zorg ervoor dat de beweging van de inkjet unidirectioneel zodat uitgelijnd met het gat in het membraan blijft.
  7. Druk zachtjes op de plunger van de spuitsamenstel tot een kleine druppel vormt zich bij de inkjet nozzle. Dit zal een aantal initiële tegendruk te bieden.
  8. Voer de jetting parameters. Voor een trapeziumvormige bipolaire golf, gebruik maken van de volgende parameters: 20 kHz pulsfrequentie, 3 usee stijgtijd, 35 psec pulsduur, 3 usee val tijd, 65 V aangelegde spanning (amplitude), en 100 jet pulsen per trekker (aantal impulsen) . Echter, de aangelegde spanning (pulsamplitude) en aantal impulsen (jet pulsen per trekker) worden gevarieerd om blaasjesgrootte controleren.

4. Vesicle Generation

  1. Voeg 25-30 ul lipide oplossing gesuspendeerd in n-decaan aan de oneindigheid kamer, over het volledige oppervlak van beide putten.
  2. Voeg 25 ul glucose (van dezelfde osmolariteit als de sucrose-oplossing) aan de buitenste rand van een goed, pipetteren langzaam en vloeiend. Bij depositie, zou een daling van glucose te vormen, omdat de glucose en vet in oplossing gaan niet samen. Voeg nog eens 251, l glucose het tegenovergestelde ook, wat een daling zal maken en vormen de lipide dubbellaag membraan in het midden van de kamer binnen 5-10 minuten.
  3. Steek de inkjet door de natuurlijke rubber, en zorgvuldig begeleiden het naar de druppel-interface dubbellaag. Benader de dubbellaag langzaam, als de geïntroduceerde inkjet zal volume verplaatsen en kan de dubbellaag scheuren.
  4. Als de inkjet is binnen ~ 200 micrometer, gelden de jetting met de in stap 3.8 beschreven instellingen. De afstand tussen de bilaag kan hoofdzakelijk afhankelijk van de spanning en het aantal impulsen onder andere parameters. Dit protocol raadt langzaam toenemende instellingen (spanning en pulse-nummer) en het observeren van dubbellaag vervorming.

5. Het reinigen van de apparatuur

  1. Maak de spuit assemblage van de microscoop podium, en gooi de 1 ml plastic spuit en filter.
  2. Om de inkjet reinigen, zuigen de volgende oplossingen in volgorde door dompelen de tip in de solution 7-10x per: 70% ethanol, 2% Neutrad oplossing in warm water, 70% ethanol, en DDH 2 O. Als de inkjet niet goed passen op de aspiratie pipet, snijd een pipet tip om een ​​adapter te vormen.
  3. Droog de kamer met weefsel. Plaats de oneindigheid kamer in een bekerglas van 250 ml met 2% v / v Neutrad in warm water, en ultrasone trillingen gedurende 5-10 minuten. Na sonicatie, drogen de putten onder perslucht. Vocht in de putjes kan de stabiliteit van de lipide dubbellaag membraan beschadigen, zodat het wordt aanbevolen dat de kamers in een oven geplaatst bij 60 ° C gedurende 15 minuten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een microfluidic jetting opstelling op een gebruikelijke omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een custom fase samengesteld uit bewerkte onderdelen en handmatige micrometer (figuur 1) gemonteerd. Karakterisering van de inkjet geeft inzicht in het blaasje generatie proces. Het variëren van de afstand tussen de spuitmond en inkjet lipide bilaag beïnvloedt de kracht op vervorming van het membraan veroorzaken. Nabij de bilaag richt de straalstroom en voorkomt dat het membraan van dispergeren ener...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel technieken zijn ontwikkeld voor vesicle generatie, zoals electroformation, emulsie en druppel generatie 14-16. Echter, nieuwe experimentele technieken nodig dat voor het ontwerp van biologische systemen met toenemende gelijkenis met levende systemen. Microfluidic methoden in het bijzonder, hebben een verhoogd niveau van controle inzake membraan unilamellarity, monodispersity van grootte, en de interne inhoud 17,18 aangeboden, waardoor blaasje modellen dichter bij biologie. Bovendien, karakteri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Mike Vahey van de Fletcher Lab aan de Universiteit van Californië, Berkeley voor advies over de microjetting parameters. Dit werk werd gesponsord door de NIH-subsidie ​​DP2 HL117748-01.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Piezoelectric InkjetMicroFab TechnologiesMJ-AL-01-xxxxxx geeft de diameter van de opening in microns aan
Jet Drive III ControllerMicroFab TechnologiesCT-M3-02
High-speed cameraVision ResearchMiroEX2
DPhPC lipid in chloroformAvanti850356CBesteld in kleine aliquoten in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µmFisher ScientificSLGV033RS
1 ml SpuitFisher Scientific14823434
n-DecaanAcros Organics111871000
GlucoseAcros Organics410950010
SucroseSigma-AldrichS7903-1KG
MethylcelluloseFisher ScientificNC9084958
1/8 in AcrylaatMcMaster Carr8560K239CAD ontwerpen voor de oneindig gevormde kamer zijn op aanvraag beschikbaar
0.2 mm AcrylaatAstra ProductsClarex clear 001
Acrylic CementTAP Plastics10693
Loctite 495 SuperglueFisher ScientificNC9011323
Loctite 3494 UV Versterkende LijmStrobels Supply30765
Natuurlijk rubberMcMaster Carr85995K14
Custom stagehomemadeN/ACAD ontwerpen zijn op aanvraag beschikbaar

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
  2. Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
  3. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
  4. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
  5. Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
  8. Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
  9. Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
  10. Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
  11. Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
  12. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
  14. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  15. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
  16. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  17. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
  18. Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
  19. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lipide dubbellaagvesikelsgiant unilamellaire vesikelsdroplet interface bilayerpi zo elektrische inkjetmembraansamenstellingvesikelencapsulatiecontrole van vesikelgroottemonodispersiteit van vesikels

Gerelateerde artikelen