Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Summary

Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.

Abstract

Bottom-up synthetische biologie biedt een nieuwe benadering voor het onderzoeken en reconstitueren biochemische systemen en mogelijk minimale organismen. Dit nieuwe terrein bezig ingenieurs, chemici, biologen en natuurkundigen te ontwerpen en assembleren fundamentele biologische componenten in complexe, goed functionerende systemen van beneden naar boven. Dergelijke bottom-up systemen kan leiden tot de ontwikkeling van kunstmatige cellen voor fundamenteel biologisch onderzoek en innovatieve therapieën ^1,2. Giant unilamellaire blaasjes (GUVs) kan dienen als model platform voor synthetische biologie vanwege hun cel-achtige membraan structuur en omvang. Microfluïdische jetting of microjetting, is een techniek die het mogelijk maakt voor het genereren van GUVs met gecontroleerde grootte, membraansamenstelling, transmembraan eiwit incorporatie en inkapseling ^3. Het basisprincipe van deze werkwijze is het gebruik van meerdere, hoogfrequente fluïdum pulsen gegenereerd door een piëzo-inkjet-inrichting een gesuspendeerde l vervormenIPID dubbellaag in een GUV. Het proces is te vergelijken met het blazen zeepbellen uit een soap film. Door het variëren van de samenstelling van de gespoten oplossing, de samenstelling van de oplossing omvat, en / of de componenten van de bilaag, kunnen onderzoekers deze techniek toegepast om aangepaste blaasjes maken. Dit document beschrijft de procedure voor eenvoudige blaasjes genereren uit een druppel-interface dubbellaag door microjetting.

Introduction

Het is steeds duidelijker geworden dat de celbiologie is een multi-schaal probleem dat impliceert het integreren van ons begrip van moleculen tot cellen. Bijgevolg weten precies hoe moleculen werken individueel is niet voldoende om complexe cellulaire gedrag te begrijpen. Dit is deels te wijten aan het bestaan ​​van de inzichten in het gedrag van multi-component systemen, zoals wordt geïllustreerd door de reconstructie van actine netwerk interactie met lipidedubbellaag blaasjes ^4, mitotische spoel assemblage in Xenopus extraheren ⁵ en ruimtelijke dynamiek van bacteriële celdeling machines ^6. Een manier om de reductionis....

Protocol

1. Infinity Kamer Fabrication

1. Ontwerp de infinity kamer (genoemd naar zijn vorm) met behulp van een computer-assisted design (CAD)-software, en sla het bestand, zodat het compatibel is met een laser cutter. Om deze vorm, aparte twee cirkels met een diameter van 0.183 creëren door een hart-op-hart afstand van 0,15 inch Snijd de kamer van 1/8- 3/16 in helder acryl met de laser cutter. De infinity vorm vergemakkelijkt druppel-interface dubbellaagsformatie en stabiliteit.
2. Boor een 1/16 in gat door de rand van de acryl-kamer naar de infinity-vormige goed. Herhaal aan de andere kant. Snijd een kleine rechthoek van een 0,2 mm acrylplaat met een schaar o....

Results

We hebben een microfluidic jetting opstelling op een gebruikelijke omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een custom fase samengesteld uit bewerkte onderdelen en handmatige micrometer (figuur 1) gemonteerd. Karakterisering van de inkjet geeft inzicht in het blaasje generatie proces. Het variëren van de afstand tussen de spuitmond en inkjet lipide bilaag beïnvloedt de kracht op vervorming van het membraan veroorzaken. Nabij de bilaag richt de straalstroom en voorkomt dat het membraan van dispergeren ener.......

Discussion

Veel technieken zijn ontwikkeld voor vesicle generatie, zoals electroformation, emulsie en druppel generatie ^14-16. Echter, nieuwe experimentele technieken nodig dat voor het ontwerp van biologische systemen met toenemende gelijkenis met levende systemen. Microfluidic methoden in het bijzonder, hebben een verhoogd niveau van controle inzake membraan unilamellarity, monodispersity van grootte, en de interne inhoud ^17,18 aangeboden, waardoor blaasje modellen dichter bij biologie. Bovendien, karakteri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piezoelectric Inkjet	MicroFab Technologies	MJ-AL-01-xxx	xxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III Controller	MicroFab Technologies	CT-M3-02
High-speed camera	Vision Research	MiroEX2
DPhPC lipid in chloroform	Avanti	850356C	Ordered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µm	Fisher Scientific	SLGV033RS
1 ml Syringes	Fisher Scientific	14823434
n-Decane	Acros Organics	111871000
Glucose	Acros Organics	410950010
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903-1KG
Methylcellulose	Fisher Scientific	NC9084958
1/8 in Acrylic	McMaster Carr	8560K239	CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm Acrylic	Astra Products	Clarex clear 001
Acrylic Cement	TAP Plastics	10693
Loctite 495 Superglue	Fisher Scientific	NC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive	Strobels Supply	30765
Natural rubber	McMaster Carr	85995K14
Custom stage	homemade	N/A	CAD designs are available upon request