Twee methoden voor het vaststellen van primaire humane Endometriale Stromal Cellen uit hysterectomie Exemplaren

Summary

Oprichting primaire endometrium stromale celkweek systemen van hysterectomie exemplaren is een waardevolle biologische techniek en een cruciale stap voorafgaand aan het nastreven van een breed scala van onderzoek wil. We beschrijven hier twee methoden om stroma culturen chirurgisch weggesneden endometriale weefsel van menselijke patiënten vastgesteld.

Abstract

Vele inspanningen gedaan om te bepalen in vitro celkweek systemen. Deze systemen zijn ontworpen om een model van een groot aantal in vivo processen. Celkweek systemen die voortkomen uit menselijke endometrium monsters zijn geen uitzondering. Toepassingen variëren van normale cyclische fysiologische processen endometrium pathologieën zoals gynaecologische kankers, infectieziekten en voortplantingsfunctie. Hier bieden we twee methoden voor het vaststellen van primaire endometrium stromale cellen van chirurgisch weggesneden endometrium hysterectomie exemplaren. De eerste methode wordt aangeduid als "het schrapen methode" en omvat mechanische schrapen met chirurgische of scheermesjes, terwijl de tweede methode wordt aangeduid als "de trypsine-methode. 'Deze laatste methode wordt de enzymatische activiteit van trypsine om de scheiding van de elementen en bevorderen cel uitgroei. We illustreren stap-voor-stap methode door middel van digitale beelden en microscopie. We hebben ook provide voorbeelden voor het valideren van endometrium stromale cellijnen via kwantitatieve real time polymerase kettingreactie (qPCR) en immunofluorescentie (IF).

Introduction

De menselijke baarmoeder corpus bestaat uit drie lagen, de perimetrium (of serosa), het myometrium en het endometrium. Onderscheidende elk van deze lagen een belangrijke stap endometrium cellijnen vast. De perimetrium is de buitenste laag van de baarmoeder en samengesteld uit dunne, sereuze cellen. De myometrium is de dikke, middelste laag van de baarmoeder en bestaat uit gladde spiercellen. Het endometrium is geïdentificeerd als de binnenste laag van de baarmoeder en omvat epitheliale en stromale cel populaties.

Het endometrium is verder onderverdeeld in de basalis laag waarvan stamcelpopulatie wordt verondersteld dat de functionalis laa....

Protocol

Hysterectomie exemplaren gebruikt in dit manuscript werden verzameld in overeenstemming met een universiteit IRB goedgekeurde ethiek protocol genummerde IRB-HSR # 14424.

1. Sample Overname van Clinical Bron

1. Verkrijgen overheid en het institutioneel bepaalde ethische richtlijnen en documentatie goedkeuring voordat u begint.
2. Voeren alle stappen in steriele omstandigheden.
3. Domein-patiënt afgeleide weefsel in medium (RPMI of DMEM / High Glucose) in een 50 ml buis bij 4 ° C indien het monster niet kan worden verwerkt in kweek onmiddellijk. Monsters kunnen in deze toestand worden bewaard gedurende maximaal 24 uur.....

Results

Zoals benadrukt in de sectie Protocol, moet u alle methoden onder overheid, institutionele en ethische richtlijnen uit te voeren bij het ​​hanteren en het voorbereiden van menselijk weefsel.

Inbegrepen in dit manuscript is een illustratie van de algemene werkschema van "het schrapen methode" (figuur 1A) en "de trypsine-methode" (figuur 1B) gebruikt om primaire kweken endometrial stellen. Deze werkwijzen worden in detail b.......

Discussion

Andere groepen hebben beschreven en aangepaste methodologie voor de bereiding van endometriale stromale culturen, waarvan de meeste gebruik collagenase ^{4,12,13,15-18.} In dit manuscript hebben we methodologie en bewijsmateriaal voor twee vereenvoudigde primaire endometriale stromale kweekmethoden, die beide worden gebruikt door ons laboratorium om economische redenen en de gemakkelijke verkrijgbaarheid van trypsine en / of een scheermesje.

Wanneer onze twee methoden vergelijken, zo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin	Hyclone	SH3023602 or SH30004202
1.7 micro Centrifuge Tube	Genesee Scientific	22-272A
1 µl, 20 µl, 200 ml and 1,000 µl Pipette	Genesee Scientific	24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml Conical Tube	Hyclone	339650
50 ml Conical Tube	Hyclone	339652
6 cm Cell Culture Dish	Thermo scientific	12-556-002
8 well Chambers	Thermo Scientific	AB-4162
Acetate	Fisher scientific	C4-100
AMV RT Enzyme/Buffer	Bio Labs	M077L
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP-1605-100
Buffered Zinc Formalin	Thermo	59201ZF
Charcoal strip FBS	Fisher	NC9019735
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Cover slip	Fisher Brand	12-544D
Cyclic AMP (cAMP)	Sigma	B7880
DMEM/High Glucose	Hyclone	SH30243FS
dNTP	Bioline	BIO-39025
Donkey Anti Goat -TRITC	Santa Cruz	SC-3855
Donkey Serum	Jackson’s lab	017-000-002
E Cadherin Antibody	Epitomics	1702-1
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-1
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	03-600-511
Fungizone Amphotericin B	Gibco	15290-018
GAPDH Probe	Life Technologies	HS99999905
Glycogen	5Prime	2301440
Goat Anti Mouse - FITC	Jackson’s Lab	115-096-003
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-1
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5
Medroxyprogesterone acetate (MPA)	Sigma	M1629
MeOH (Methanol)	Fisher Scientific	A4-08-1
Mounting Media (w/DAPI)	Vector Labratories	H-1500
N6 DNA Oligos	Invitrogen
Number 15 Scraper	BD	371615
Pan Cytokeratin  Mouse mAB	Cell Signaling	4545
PBS (phosphate buffered saline)	Fisher Scientific	BP-399-4
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X	Hyclone	SV30082.01
PML Anti Goat Anti body	Santa Cruz	SC-9862
Primer(s)	Eurofins
RPMI	Hyclone	SH30027FS
RPMI (Phenol free)	Gibco	11835
Sybr Green	Thermo Scientific	AB-4162
Taqman	Thermo	AB-4138
Trizol	Life Technologies	15596018
Vimentin Antibody	Epitomics	4211-1