Twee methoden voor het vaststellen van primaire humane Endometriale Stromal Cellen uit hysterectomie Exemplaren

Samenvatting

Oprichting primaire endometrium stromale celkweek systemen van hysterectomie exemplaren is een waardevolle biologische techniek en een cruciale stap voorafgaand aan het nastreven van een breed scala van onderzoek wil. We beschrijven hier twee methoden om stroma culturen chirurgisch weggesneden endometriale weefsel van menselijke patiënten vastgesteld.

Samenvatting

Vele inspanningen gedaan om te bepalen in vitro celkweek systemen. Deze systemen zijn ontworpen om een model van een groot aantal in vivo processen. Celkweek systemen die voortkomen uit menselijke endometrium monsters zijn geen uitzondering. Toepassingen variëren van normale cyclische fysiologische processen endometrium pathologieën zoals gynaecologische kankers, infectieziekten en voortplantingsfunctie. Hier bieden we twee methoden voor het vaststellen van primaire endometrium stromale cellen van chirurgisch weggesneden endometrium hysterectomie exemplaren. De eerste methode wordt aangeduid als "het schrapen methode" en omvat mechanische schrapen met chirurgische of scheermesjes, terwijl de tweede methode wordt aangeduid als "de trypsine-methode. 'Deze laatste methode wordt de enzymatische activiteit van trypsine om de scheiding van de elementen en bevorderen cel uitgroei. We illustreren stap-voor-stap methode door middel van digitale beelden en microscopie. We hebben ook provide voorbeelden voor het valideren van endometrium stromale cellijnen via kwantitatieve real time polymerase kettingreactie (qPCR) en immunofluorescentie (IF).

Inleiding

De menselijke baarmoeder corpus bestaat uit drie lagen, de perimetrium (of serosa), het myometrium en het endometrium. Onderscheidende elk van deze lagen een belangrijke stap endometrium cellijnen vast. De perimetrium is de buitenste laag van de baarmoeder en samengesteld uit dunne, sereuze cellen. De myometrium is de dikke, middelste laag van de baarmoeder en bestaat uit gladde spiercellen. Het endometrium is geïdentificeerd als de binnenste laag van de baarmoeder en omvat epitheliale en stromale cel populaties.

Het endometrium is verder onderverdeeld in de basalis laag waarvan stamcelpopulatie wordt verondersteld dat de functionalis laag herbevolking ongeveer elke 28 dagen ^1. De functionalis laag van het menselijke endometrium ondergaat significante biochemische en morfologische veranderingen in respons op circulerende hormonen. Deze hormonen zijn afgeleid van de hypofyse en de eierstokken.

Degecoördineerde productie en afgifte van hormonen resulteert in een voortplantingscyclus. De voortplantingscyclus is ontworpen om het endometrium te bereiden op mogelijke embryo implantatie gebeurtenissen. Bij mensen wordt de voortplantingscyclus bekend als "de menstruele cyclus" en onderverdeeld in drie fasen - proliferatieve, secretoire en menstruatie. De proliferatieve fase betreft de verspreiding van de functionalis endometrium laag terwijl de secretoire fase wordt gekenmerkt door functionalis rijping. Specifiek extracellulaire veranderingen, afscheidingen en celdifferentiatie signaal een mogelijke inplanting. Als implantatie niet geschieden vóór het einde van de secretoire fase wordt de functionalis baarmoederslijmvlies laag vergoten tijdens de menstruele fase. Het belang van de menstruatie en de gebeurtenissen die het vergieten van de functionalis laag triggeren zijn nog gedebatteerd. In mensen, is gesteld dat de menstruatie is het gevolg van een specifieke mid-secretoire fase differentiatie gebeurtenis bekendals "spontane decidualization" ^2. In dit manuscript hebben we gedetailleerde methodologie voor zowel endometrium stromale celisolatie methoden, en gebruik een combinatie van immunofluorescentie en digitale beelden naar de werkzaamheid van deze benaderingen te tonen. Daarnaast we een algemeen in vitro model van spontane decidualization endometrium stromale cel isolatie bevestigen.

Protocol

Hysterectomie exemplaren gebruikt in dit manuscript werden verzameld in overeenstemming met een universiteit IRB goedgekeurde ethiek protocol genummerde IRB-HSR # 14424.

1. Sample Overname van Clinical Bron

1. Verkrijgen overheid en het institutioneel bepaalde ethische richtlijnen en documentatie goedkeuring voordat u begint.
2. Voeren alle stappen in steriele omstandigheden.
3. Domein-patiënt afgeleide weefsel in medium (RPMI of DMEM / High Glucose) in een 50 ml buis bij 4 ° C indien het monster niet kan worden verwerkt in kweek onmiddellijk. Monsters kunnen in deze toestand worden bewaard gedurende maximaal 24 uur.
4. Was weefselmonster driemaal met 1X steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en de oplossing tussen wasbeurten ontdoen.

2. Voorbereiding van de primaire cellijnen met behulp van de schrapen Methode

1. Voeg 4-10 ml groeimedium (RPMI of DMEM / hoge glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycin) weefsel en voeg Fungizone (0,25 ug / ml eindconcentratie) gedurende 30 minuten.
2. Gooi de groeimedia.
3. Was weefsel tweemaal met 1X PBS.
4. Plaats het weefsel op een 6 cm celkweekplaat om onderscheid te maken tussen myometrium en endometrium lagen (zie de figuren 2A-2C voor een nadere beschrijving). Scheid het endometrium.
5. Met behulp van een scalpel of scheermesje, doorsnijden het weefsel in kleine stukjes, terwijl krabben op de 6 cm celkweekschaal. Deze krassen vergemakkelijken van de bevestiging van de nieuwe primaire endometriumcellen. Vergeleken met de trypsine werkwijze wordt meer weefsel nodig (zie figuur 2D een benadering).
6. Zachtjes, voeg 2 ml groeimedium om krassen gerecht (weefselfragmenten zichtbaar en ideaal geïmmobiliseerd van het krassen beweging zijn).
7. Breng de plaat (platen) over aan een celkweek incubator (37 ° C en 5% _CO2). Wijs een plek voor primaire cellijnen, weg van OTHer celkweekschalen. Primaire kweken zijn gevoeliger voor infectie en verontreiniging.
8. Onderzoek de cellen onder een lichtmicroscoop dagelijks. Kleine populaties van cellen zou ontstaan ​​bij dag twee of drie van over de plakjes weefsel (zie figuur 3B).
9. Om culturen te behouden, was voorzichtig met 1X PBS en voeg verse groeimedia (2 ml) om de drie dagen. Wanneer proliferatie toeneemt, extra groeimedia (3-4 ml) kan worden toegevoegd aan de 6 cm kweek plaat (platen).
   Opmerking: Tijdens het wassen en media verandert, zal stukjes weefsel waarschijnlijk worden opgezogen. Dit heeft geen invloed op de groei van hechtende cellen. Het weefsel moet worden opgezogen door de volgende stap (2,10) nieuwe kolonies waarschijnlijk ontstaan ​​na een week.
10. Wanneer de 6 cm plaat is ongeveer 75-80% samenvloeiing (zie figuur 3B), doorgang met behulp van 0,05% trypsine. Primaire cellen kan niet onbeperkt worden gepasseerd - bevriezen beneden een plaat van cellen zodra twee of drie borden zijn maintained. Als er meer passages nodig zijn, volgen een immortalization protocol (beoordeeld in Ref ^3).

3. Voorbereiding van de primaire cellijnen met behulp van de trypsine-methode

1. Leg een klein stukje endometriumweefsel (zie Figuur 2D voor een benadering) in 2 ml van 0,25% trypsine aangevuld met Kanamycine (0,03 mg / ml uiteindelijke concentratie).
2. Incubeer weefsel bij 37 ° C op draaiplateau 30 minuten.
3. Kort vortex het weefsel.
4. Centrifugeer het monster bij 200-400 xg gedurende 2 minuten en gooi het supernatant.
5. Voeg verse trypsine en Kanamycin.
6. Incubeer het weefsel bij 37 ° C onder draaiing een uur.
7. Vortex het weefsel voor 5-10 sec.
8. 2 ml groeimedium (aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine) Aan trypsine gedeactiveerd.
9. Centrifugeer cellen bij 200-400 g gedurende 2-3 minuten.
10. Verwijder het supernatant en voeg 2 ml groeienth media om de gepelleteerde cellen.
11. Plaat op een 6 cm celkweekschaal. Het schrapen van de plaat zoals in stap 2.5 van voorbereiden Primaire cellijnen met behulp van de schrapen methode is niet nodig, maar bevordert de hechting en uitgroei van primaire culturen.
12. Monitor cellen onder een lichtmicroscoop dagelijks. Cellen zijn meestal zichtbaar onder een lichtmicroscoop na 24-48 uur (zie Figuur 3C).
13. De culturen behouden bewaken de cellen en media veranderen elke 2-3 dagen als in stap 2.9.
14. Om de passage van de cellen, gebruik 0,05% of 0,25% trypsine wanneer cellen te bereiken 75-80% confluentie (zie figuur 3C).

4. Opslaan extra weefsel voor analyse (Snap Invriezen en formalinefixatie)

1. Tweemaal spoelen monster met 1X PBS.
2. Zuig zoveel vloeistof als mogelijk.
3. Voor Snap Bevriezing, plaatst endometriumweefsel monster in een 1,7 centrifugebuis (zie figuren 2F en 2G). Plaats de 1.7centrifugebuis in vloeibare stikstof gedurende 10 seconden of totdat blijkt dat het weefsel beneden bevroren.
   Opmerking: Zorg ervoor dat u rechtstreeks aan vloeibare stikstof bij de voorbereiding van de monsters. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C tot verdere verwerking of analyse.
4. Voor formalinefixatie, snijd een klein stukje van het endometrium weefsel (zie figuur 2H), en onder te dompelen in 10% gebufferde formaline zink. Na 24 uur, gooi formaline en voeg 70% ethanol weefselmonsters tot verdere verwerking.

5. Immunofluorescentie (IF)

1. Cel fixatie
   1. Bereid cellen op een cultuur dia of plaat.
   2. Voorzichtig, wassen cellen met 1X PBS.
   3. Add voorgekoeld (4 ° C) methanol en aceton (gemengd bij een 1:1 verhouding) gedurende 5 minuten.
   4. Lucht drogen de dia voordat u verder gaat. Dia kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1-2 weken indien nodig.
2. Verwerking IF
   1. Hydrateren cellen met 1X PBS gedurende 10 minuten. Voor de voorllowing stappen 1-6 over tot alle wast en incubatie op een draaiend platform.
   2. Vak met 1X PBS aangevuld met 1% runderserumalbumine (BSA) en 1% soortspecifieke serum (bron ^2e antilichaam) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
   3. Incubeer in primaire antilichaam (zie aanbevelingen van de fabrikant voor antilichaam verdunningen). Zie Materialen voor specifieke antilichamen. Verdun het primaire antilichaam in verse blokkerende buffer als in stap 5.2.2. Deze incubatie kan worden uitgevoerd ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
   4. Was 3 maal met 1X PBS gedurende 5 minuten elk.
   5. Incubeer in het secundair antilichaam (zie aanbevelingen van de fabrikant voor antilichaam verdunningen). Verdun het secundaire antilichaam in verse blokkerende buffer als in stap 5.2.2. Om fotoblekingsreactie voorkomen, is het belangrijk om deze en de volgende stappen uitvoeren in de afwezigheid van licht.
   6. Was 3 maal met 1X PBS gedurende 5 minuten elk.
   7. Thoroughly dia drogen.
   8. Voeg montage media en DAPI tegenkleuring oplossing.
   9. Solliciteer dekglaasje en sluit de randen met behulp van kit (s). Dia's kunnen bij 4 ° C worden bewaard in het donker gedurende 2 weken.

6. RNA-extractie

1. Pellet 1 x 10 ⁷ cellen door centrifugeren. Alle materialen en reagentia in dit protocol moet gratis worden RNAse.
2. Lyse cellen in 1 ml TRIZOL-reagens en incubeer de monsters gehomogeniseerd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om dissociatie van nucleoproteïne complexen voltooien.
3. Voeg 200 ul chloroform per 1 ml TRIZOL. Schud krachtig met de hand gedurende 15 seconden en incubeer gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur.
4. Centrifugeer bij maximale snelheid (15.000 x g) gedurende 15 min bij 4 ° C. Drie lagen resulteert.
5. Breng de bovenste waterige fase over in een schoon microcentrifugebuisje. Voeg 1 ui glycogeen de RNA opbrengst te verhogen; echter, deze stap is alleen nodig wanneer een kleinehoeveelheid RNA verwacht.
6. Voeg 0,5 ml isopropylalcohol aan de waterige laag en keren de monsters 3-5 keer. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Om opbrengst te verhogen, kunnen monsters -20 ° C of -80 ° C gedurende 30 minuten geplaatst.
7. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 10 min bij 4 ° C.
8. Op dit punt zou een kleine pellet RNA zichtbaar. Verwijder het supernatant.
9. Was de RNA met 1 ml 75% ethanol.
10. Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 5 minuten en gooi het supernatant. Monsters kunnen weer aan anorganische verontreinigingen af ​​te wassen, maar deze stap is niet noodzakelijk.
11. In het kort, droog de RNA pellet tot RNA pellet droog is (duurt meestal 7-10 min).
    Opmerking: Een extra stap kan worden gebruikt om anorganische stof af en verminderen droogtijd. Na het teruggooien van het supernatant van de ethanol te wassen, spinnen monsters bij de maximale snelheid voor een extra minuut en zuig resterende vloeistof. Zorg dat er geen pellet zuigen.
12. Los RNA in RNase-free water, afhankelijk van de grootte van de RNA-pellet. Volumes variëren meestal 10-50 ul.
13. Incubeer monsters bij 55 ° C gedurende 10 min, en meet de concentratie van RNA.
14. WINKEL monsters bij -20 ° C tot verdere verwerking.

7. Reverse Transcriptie

1. Het monster RNA (1-3 ug) tot een volume van 9 pl met _H2O
2. Warmte RNA 70 ° C gedurende 10 minuten.
3. Een AMV master mix genereren, combineren de volgende reagentia: 5 pl dNTP (werkende concentratie van 50 uM), 5 pl N6 DNA oligo (bewerken concentratie van 80 uM), 5 ui 5X AMV buffer en 1 pl AMV . Deze master mix oplossing is ontworpen per een monster.
4. Voeg 16 ul van de master mix tot het verwarmde RNA. Het uiteindelijke reactie volume 25 pi reactie.
5. Gebruik de volgende PCR-omstandigheden voor omgekeerde transcriptie: (fase 1) 42 ° C gedurende 90 min, (Stage 2) 95 ° C gedurende 5 min, en (stadium 3) 4 ° C tot verdere verwerking.

8. Real Time PCR

1. Voer PCR-reacties met de primers, annealing temperatuur, cyclus nummers en reagentia in tabel 1.
   Opmerking: Het is ideaal om instructies van de fabrikant volgen bij het ​​gebruik van PCR-reagentia (zie bedrijfs-en catalogusnummers in Materials).

9. In vitro decidualization Protocol (Derived from Ref ⁴ en ⁵⁾

1. Plate endometriumcellen.
2. Groeien tot een confluentie van 75-85%.
3. Na cellen confluent, eenmaal wassen met 1X PBS.
4. Snel, add-hormoon vrije media (fenol vrij RPMI aangevuld met 5% houtskool strip FBS en 1% penicilline-streptomycine).
5. Na 24 uur, voeg hormoon vrij medium aangevuld met medroxyprogesteronacetaat (MPA) bij een uiteindelijke concentratie van 1 uM en 8-bromoadenosine 3 ', 5'-Cyclisch monofosfaat (cAMP) in een uiteindelijke concentratie van 0,5 mM.
6. Na ten minste 48 uur, stop de reactie en bewaar de plaat (s) voor verdere verwerking.

Resultaten

Zoals benadrukt in de sectie Protocol, moet u alle methoden onder overheid, institutionele en ethische richtlijnen uit te voeren bij het ​​hanteren en het voorbereiden van menselijk weefsel.

Inbegrepen in dit manuscript is een illustratie van de algemene werkschema van "het schrapen methode" (figuur 1A) en "de trypsine-methode" (figuur 1B) gebruikt om primaire kweken endometrial stellen. Deze werkwijzen worden in detail b...

Discussie

Andere groepen hebben beschreven en aangepaste methodologie voor de bereiding van endometriale stromale culturen, waarvan de meeste gebruik collagenase ^{4,12,13,15-18.} In dit manuscript hebben we methodologie en bewijsmateriaal voor twee vereenvoudigde primaire endometriale stromale kweekmethoden, die beide worden gebruikt door ons laboratorium om economische redenen en de gemakkelijke verkrijgbaarheid van trypsine en / of een scheermesje.

Wanneer onze twee methoden vergelijken, zo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin	Hyclone	SH3023602 of SH30004202
1.7 micro Centrifuge Tube	Genesee Scientific	22-272A
1 µl, 20 µl, 200 ml and 1,000 µl Pipette	Genesee Scientific	24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml Conical Tube	Hyclone	339650
50 ml Conical Tube	Hyclone	339652
6 cm Cell Culture Dish	Thermo scientific	12-556-002
8 well Chambers	Thermo Scientific	AB-4162
Acetate	Fisher scientific	C4-100
AMV RT Enzyme/Buffer	Bio Labs	M077L
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP-1605-100
Buffered Zinc Formalin	Thermo	59201ZF
Charcoal strip FBS	Fisher	NC9019735
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Cover slip	Fisher Brand	12-544D
Cyclic AMP (cAMP)	Sigma	B7880
DMEM/High Glucose	Hyclone	SH30243FS
dNTP	Bioline	BIO-39025
Donkey Anti Goat -TRITC	Santa Cruz	SC-3855
Donkey Serum	Jackson’s lab	017-000-002
E Cadherin Antibody	Epitomics	1702-1
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-1
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	03-600-511
Fungizone Amphotericin B	Gibco	15290-018
GAPDH Probe	Life Technologies	HS99999905
Glycogen	5Prime	2301440
Goat Anti Mouse - FITC	Jackson’s Lab	115-096-003
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-1
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5
Medroxyprogesterone acetate (MPA)	Sigma	M1629
MeOH (Methanol)	Fisher Scientific	A4-08-1
Mounting Media (w/DAPI)	Vector Labratories	H-1500
N6 DNA Oligos	Invitrogen
Number 15 Scraper	BD	371615
Pan Cytokeratin  Mouse mAB	Cell Signaling	4545
PBS (phosphate buffered saline)	Fisher Scientific	BP-399-4
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X	Hyclone	SV30082.01
PML Anti Goat Anti body	Santa Cruz	SC-9862
Primer(s)	Eurofins
RPMI	Hyclone	SH30027FS
RPMI (Phenol free)	Gibco	11835
Sybr Green	Thermo Scientific	AB-4162
Taqman	Thermo	AB-4138
Trizol	Life Technologies	15596018
Vimentin Antibody	Epitomics	4211-1