Dit protocol combineert elektrospinnen en microsferen om weefselgeëngineerde scaffolds te ontwikkelen om neuronen te richten. Het zenuwgroeifactor werd ingekapseld in PLGA-microsferen en elektrogespunnen in hyaluronzuur (HA) vezelige scaffolds. De bioactiviteit van het eiwit werd getest door de scaffolds te zaaien met primaire kippendorsaalwortelganglia en 4-6 dagen te kweken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze procedure beschrijft een methode om een veelzijdig substraat te fabriceren om zenuwcelgroei te sturen. Dit systeem bevat mechanische, topografische, adhesieve en chemische signalen. Mechanische eigenschappen worden gecontroleerd door het type materiaal dat wordt gebruikt om de elektrogesponnen vezels te fabriceren. In dit protocol gebruiken we 30% gemethacryleerde hyaluronzuur (HA), dat een trekmodulus van ~500 Pa heeft, om een zacht vezelig schaaltje te produceren. Elektrospinnen op een roterende as produceert uitgelijnde vezels om een topografisch signaal te creëren. Adhesie wordt bereikt door het schaaltje te coaten met fibronectine. De belangrijkste uitdaging die hierin wordt aangepakt, is het leveren van een chemisch signaal gedurende de diepte van het schaaltje voor langere perioden. Deze procedure beschrijft het fabriceren van poly(melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) microsferen die Zenuwgroeifactor (NGF) bevatten en het direct impregneren van het schaaltje met deze microsferen tijdens het elektrospinproces. Vanwege de ruwe productieomgeving, inclusief hoge schuifkrachten en elektrische ladingen, wordt de eiwitlevensvatbaarheid na de productie gemeten. Het systeem biedt eiwitafgifte gedurende meer dan 60 dagen en is aangetoond als bevorderlijk voor primaire zenuwcelgroei.
Inleiding
Een van de voortdurende uitdagingen in zenuwweefsel techniek is het creëren van een zenuwleiding (NC) die de extra cellulaire matrix, waar zenuwen groeien natuurlijk nabootst. Onderzoek heeft aangetoond dat de cellen reageren op verschillende factoren in hun omgeving met inbegrip van mechanische, topografische, lijm en chemische signalen 1-3. Een van de belangrijkste uitdagingen op dit gebied bepalen van de juiste combinatie van signalen en het vervaardigen van een systeem dat signalen kan handhaven voor een langere periode celgroei 4 ondersteunen. Perifere neuronen is bekend dat ze een zachte ondergrond de voorkeur geven, worden geregisseerd do....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1 Water / Olie / Water Dubbele Emulsion Microsfeer Productie
- Maak eerst 2% en 0,5% w / v oplossing van polyvinylalcohol (PVA) in gedeïoniseerd water. Roer de oplossing bij 50 ° C totdat een heldere, kan enkele uren duren. Bereid een oplossing van 2% v / v isopropylalcohol in gedeïoniseerd water.
- Bereid een waterige oplossing van hydrofiele gewenste eiwit. De onderstaande tabel geeft bijvoorbeeld formuleringen.
Tabel 1:. Voorbeeld Eiwit Oplossingen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Microsferen 50 ± 14 micrometer in diameter met een meer dan 85% eiwit inkapseling zijn consistent geproduceerd en elektrogesponnen in steigers. Grootte werd bepaald door beeldvorming monsters van microsferen uit drie afzonderlijke productie batches. De beelden waarin vastgelegd op een optische microscoop en lengten wanneer gemeten met commerciële software lab. Figuur 1 toont een histogram van de grootteverdeling. Encapsulation percentage werd ook getest drie verschillende microsfeer opbrengsten, door he.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vele studies hebben aangetoond dat de zenuwcellen kunnen worden geregisseerd door topografische cues (fiber alignment) en chemische signalen (groeifactoren) 1,2,10,11,35. Electrospinning is een gemakkelijke methode om uitgelijnde vezels geven. Groeifactoren stimuleren zenuwgroei maar om ze op te nemen in zenuw leidingen (NC), is een werkwijze voor aanhoudende afgifte vereist. Om een meer robuust systeem met beide signalen maken, moeten deze twee signalen worden gecombineerd. Verscheidene werkwijzen zijn eer.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Richard Barber Foundation en een Thomas Rumble Fellowship (TJW).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Bescherm tegen licht |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Maak stockoplossing in DMSO |
| Spuitpomp | KD Scientific | KDS100 | |
| Voeding | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Moet worden bevestigd aan een op maat gemaakte draaibank |
| Toerenteller | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Gebruik om de snelheid van de draaibank te controleren |
| Omnicure UV Spot Cure System met collimaterende adapter | EXFO | S1000 | |
| Naalden | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Dekglasjes | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinylalcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isopropylalcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Rundserumalbumine (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloormethaan | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Proteïne Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectine | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
Referenties
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
