Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

12.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51519

⸱

24 juli 2014

 ,  ,  , 
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen voor de cultuur van humane pluripotente stamcellen (hPSC), gebaseerd op het groeien van gedissocieerde enkele cellen in een niet-kolonietype monolaag (NCM). Deze nieuwe methode, die gebruik maakt van Rho-geassocieerde kinase remmers of de laminine isovorm 521 (LN-521), is geschikt voor het produceren van grote hoeveelheden homogene hPSC's, genetische manipulatie en geneesmiddelontdekking.

Samenvatting

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) beloven veel voor regeneratieve geneeskunde en biofarmaceutische toepassingen. Momenteel zijn optimale kweek en efficiënte expansie van grote hoeveelheden klinische hPSCs kritische kwesties in hPSC-gebaseerde therapieën. Conventioneel worden hPSCs vermeerderd als kolonies op zowel feeder- als feeder-vrije kweeksystemen. Deze methoden hebben echter verschillende belangrijke beperkingen, waaronder lage celopbrengsten en het genereren van heterogeen gedifferentieerde cellen. Om de huidige hPSC-kweekmethoden te verbeteren, hebben we onlangs een nieuwe methode ontwikkeld, gebaseerd op niet-kolonie type monolaag (NCM) kweek van gedissocieerde enkele cellen. Hier presenteren we gedetailleerde NCM protocollen gebaseerd op de Rho-geassocieerde kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We geven ook nieuwe informatie over NCM-kweek met verschillende kleine moleculen zoals Y-39983 (ROCK I inhibitor), fenylbenzodioxaan (ROCK II inhibitor) en thiazovivin (een nieuwe ROCK inhibitor). We breiden ons basisprotocol verder uit om hPSCs te kweken op gedefinieerde extracellulaire eiwitten zoals de laminine isovorm 521 (LN-521) zonder het gebruik van ROCK-remmers. Bovendien hebben we, gebaseerd op NCM, efficiënte transfectie of transductie van plasmide DNA's, lentivirale deeltjes en oligonucleotide-gebaseerde microRNA's in hPSCs aangetoond om deze cellen genetisch te modificeren voor moleculaire analyses en geneesmiddelontdekking. De op NCM gebaseerde methoden overwinnen de belangrijkste tekortkomingen van kolonie-type kweek en kunnen dus geschikt zijn voor het produceren van grote hoeveelheden homogene hPSCs voor toekomstige klinische therapieën, stamcelonderzoek en geneesmiddelontdekking.

Inleiding

De capaciteit van hPSCs om onderscheid te maken in de richting van multilineage volwassen weefsels heeft nieuwe wegen geopend voor de behandeling van patiënten die lijden aan ernstige ziekten die hart-, lever-, pancreas-, en neurologische systemen 1-4 betrekken. Diverse soorten cellen afgeleid van hPSCs zou ook robuuste mobiele platforms voor ziektemodel, genetische manipulatie, drug discovery, en toxicologische testen 1,4. Het belangrijkste punt dat hun toekomstige klinische en farmacologische toepassingen zorgt is het genereren van grote aantallen klinische-grade hPSCs via in vitro celkweek. Echter, de huidige cultuur systemen zijn onvoldoende of inherent variabel, waarbij verschillende feeder en-feeder vrij culturen van hPSCs als kolonies 5,6.

Kolonie-achtige groei van hPSCs aandelen veel constructie-eigenschappen van de binnenste celmassa (ICM) van de vroege embryo's van zoogdieren. De ICM is gevoelig om te differentiëren tot drie kiem-lagenin een meercellige milieu vanwege het bestaan ​​van heterogene signalering gradiënten. Aldus wordt de verwerving van heterogeniteit in de vroege embryonale ontwikkeling als een vereiste werkwijze voor differentiatie, maar een ongewenste eigenschap van HPSC cultuur. De heterogeniteit in HPSC cultuur wordt vaak veroorzaakt door overmatige apoptotische signalen en spontane differentiatie als gevolg van suboptimale groeiomstandigheden. Dus in kolonie-typen cultuur, de heterogene cellen worden vaak waargenomen in de periferie van de kolonies 7,8. Het is ook aangetoond dat de cellen in menselijke embryonale stamcellen (hESC) kolonies vertonen differentiële reacties op signaalstoffen zoals BMP-4 9. Bovendien kolonie cultuur methoden produceren een laag cel opbrengst evenals zeer lage cel herstel tarieven van cryopreservatie te wijten aan oncontroleerbare groei en apoptotische signaalwegen 6,9. De laatste jaren zijn er verschillende suspensiekweken ontwikkeld voor kweken hPSCs, particularly voor uitbreiding van grote hoeveelheden hPSCs in feeder-en matrix-vrije omstandigheden 6,10-13. Uiteraard, andere cultuur systemen hebben hun eigen voordelen en nadelen. In het algemeen, de heterogeniteit van hPSCs is een van de belangrijkste nadelen van de methoden kolonie-type en geaggregeerde cultuur, die optimaal voor het leveren van DNA en RNA materialen in hPSCs voor gentechnologie 6 zijn.

Het is duidelijk dat er een dwingende noodzaak om nieuwe systemen die een aantal tekortkomingen van de huidige kweekmethoden omzeilen ontwikkelen. De ontdekkingen van kleine molecule inhibitoren (zoals de ROTS remmer Y-27632 en JAK remmer 1) dat eencellige verbeteren overleven de weg vrijmaken voor gedissocieerde-HPSC cultuur 14,15. Met het gebruik van deze kleine moleculen, hebben we onlangs een kweekmethode ontwikkeld op basis van niet-kolonie soort (NCM) groei van gedissocieerd-hPSCs 9. Deze nieuwe kweekmethode combineert zowel eencellige passage en high-densityplating methoden, waardoor we grote hoeveelheden homogene hPSCs produceren onder consistente groei cycli zonder grote chromosomale afwijkingen 9. Alternatief kan NCM cultuur met verschillende kleine moleculen en gedefinieerde matrices (bijvoorbeeld laminins) worden uitgevoerd om de kweekmethode voor brede toepassingen te optimaliseren. Hier presenteren we een aantal gedetailleerde protocollen op basis van NCM cultuur en af ​​te bakenen gedetailleerde procedures voor genetische manipulatie. Om de veelzijdigheid van NCM protocollen tonen we ook getest NCM cultuur met diverse ROCK inhibitoren en met de single laminine isovorm 521 (dwz LN-521).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Single-cell-gebaseerde niet-kolonie soort monolaag (NCM) cultuur van hPSCs.

1. Voorbereidingen

  1. Voeg 500 ml medium voor kweek van muis embryonale fibroblasten (MEF): DMEM medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine en 0,1 mM niet-essentiële aminozuren (NEAA).
  2. Isoleer muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen, afkomstig van de CF1 stam na een routine protocol 16 en cultuur MEF op 0,1% gelatine beklede 6-well celkweek plaat in DMEM medium. Als alternatief kopen MEF voorraden bij doorgang 3 van commerciële middelen.
  3. Bereid Matrigel platen.
    1. Verdun 5 ml van hESC-gekwalificeerde Matrigel voorraad met 5 ml DMEM/F12-medium (gekoeld op ~ 4 ° C) en op te slaan als 50% porties in een -20 ° C vriezer. Ontdooi de bevroren Matrigel voorraad in een koelkast (4 ° C ~) O / N en verder verdunnen Matrigel koude DMEM/F12-medium (aanleiding geeft tot een 2,5% werkende concentratie).
    2. Coat 6-well celkweek platen met 1,5 ml van 2,5% Matrigel per goed, slaan de beklede platen in de koelkast O / N (Opmerking: Gebruik de Matrigel-gecoate plaat binnen 2 weken).
    3. Verwijder de Matrigel plaat uit de koelkast, zodat de plaat op te warmen bij RT in de celkweek kap gedurende 10 tot 30 minuten (Noot: niet opwarmen van de plaat in een celkweek incubator), en zuig DMEM medium voorafgaand aan hPSCs plating.
  4. Voeg 500 ml hESC medium: 80% DMEM/F12-medium, 20% KSR, 2 mM L-glutamine, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 0,1 mM β-mercapto-ethanol, en 4 ng / ml FGF-2.
  5. Bereid 10 ml 2X HPSC invriesmedium: 60% FBS, 20% DMSO en 20 pM Y-27632 in mTeSR1 medium steriliseren door filtratie, en gebruik het medium binnen 1 week.

. 2 Protocol 1 (Basis): Grow HPSC Kolonies op Feeders

  1. Gebruik MEF passage nummers op 5 of 6 (aangeduid als p5 en p6) voor HPSC cultuur om consistente Resul krijgents. Mitotisch inactiveren MEF door behandeling van de cellen met 10 ug / ml mitomycine C gedurende 3 uur bij 37 ° C, was de cellen 3x met 1 x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS) en daarna dissociëren MEFs met 0,05% trypsine in 0,53 mM EDTA. Alternatief bestralen MEFs in een dosis van 8000 rad met een X-ray bestraler.
  2. Tel het aantal cellen met behulp van de trypaanblauw vlek uitsluiting methode onder de microscoop. U kunt ook een automatische cel teller.
  3. Plaat bestraalde MEF on 6-well polystyreen platen bekleed met 0,1% gelatine in een dichtheid van 1,88 x 10 5 cellen per putje (dwz 1,96 x 10 4 cellen / cm 2). Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
  4. Verwijder de MEF kweekmedium door aspiratie met een Pasteur pipet (NB: geen wassen stappen die nodig zijn in deze tijd).
  5. Vermaal HPSC kolonies van vorige cultuur in kleine groepjes, onderzoeken de bosjes onder de microscoop om hun maten variërend fr zorgenOM 50 tot 100 urn in diameter en plaat HPSC klonten bovenop MEF feeder lagen in een putje dat 2 ml HPSC medium.
  6. Wijzig hESC medium per dag gedurende 3 tot 5 dagen, op te nemen kolonie groei door foto, markeert geen morfologisch veranderde of gedifferentieerde kolonies (~ 5%), en handmatig de gemarkeerde kolonies verwijderen door voorzichtig aspiratie met een Pasteur pipet.
  7. Spoel de overblijvende kolonies op MEF tweemaal (2 min elk met D-PBS) en incubeer de kolonies met 2 ml 1 mg / ml collagenase IV HPSC medium voor 10 tot 30 min), en onderzoekt het losmaken van HPSC kolonies van de MEF-gecoate oppervlak (Let op: gebruik een schraper om het detachement proces helpen alleen als de kolonies stevig zijn bevestigd aan de plaat).
  8. Voeg 5 ml HPSC medium aan elk putje om enzymatische reacties, overdracht kolonies een 15 ml buisje minimaliseren, zodat HPSC kolonies sedimenteren gedurende 3 tot 5 minuten bij kamertemperatuur, en zorgen voor de sedimentatie van kolonies door directe visualisatie van de cellen onderin de buis (NB: de slang niet Centrifugeer bij deze stap).
  9. Verwijder de bovenstaande vloeistoffen die resten MEF en gedissocieerde enkele cellen, resuspendeer de kolonies met 5 ml van hESC medium, en twee keer herhaal de sedimentatie stap.
  10. Verwijder het medium, vermaal HPSC kolonies in kleine groepjes, op te slaan in 1X HPSC bevriezing medium (of CryoStore CS10 bevriezing medium) voor cryopreservatie (1 samenvloeiing goed per bevroren flesje) of plaat op een 6-wells plaat voor cel passage.

3 Protocol nr. 2:. Zet HPSC Kolonies van Feeders naar NCM

  1. Spoel HPSC pellets in D-PBS eenmaal incubeer de pellets met 1 ml 1X Accutase gedurende 10 min, en onderzoekt de enzymatische reactie onder een microscoop te eencellige dissociatie waarborgen.
  2. Sluit de enzymatische reacties door voorzichtig resuspenderen van de cellen in 5 ml mTeSR1 medium dat 10 uM Y-27632 gevolgd door centrifugatie bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min(Let op, geen buitensporige centrifugeren krachten die celschade veroorzaken niet te gebruiken).
  3. Voeg 5 ml mTeSR1 medium om de pellet, resuspendeer de pellet als enkele cellen en filter gedissocieerde cellen door een 40 um cel zeef (om resten cel aggregaten te verwijderen).
  4. Zaad 1.3-2 x 10 6 hPSCs in een goed (1,4-2,1 x 10 5 cellen / cm 2) van een 6-wells plaat bekleed met 2,5% hESC-gekwalificeerde Matrigel, voeg mTeSR1 medium tot 2,5 ml, en omvatten 10 uM Y-27632 op de middellange (tot de eerste 24 uur eencellige plating te vergemakkelijken). Als alternatief gebruik maken van de volgende kleine moleculen tot 10 uM Y-27632 te vervangen voor het verbeteren van eencellige plating: 1 uM Y-39983 (ROCK I-remmer), 1 uM phenylbenzodioxane (ROCK II-remmer), 1 uM thiazovivin (een roman ROCK inhibitor) , en 2 uM JAK remmer 1.
  5. Vervang het medium met drugsvrije mTeSR1 medium op de volgende dag (binnen 24 uur), distantiëren cellen van een extragoed, en tel het aantal cellen te eencellige plating efficiëntie te bepalen (Opmerking: ongeveer 50 tot 90% van eencellige plating efficiëntie die in dit stadium kan worden bereikt).
  6. Laat de cellen groeien als een enkele-cel monolaag gevormd voor een paar dagen met 3 ml mTeSR1 medium. Dagelijks veranderen medium.
  7. Empirisch bepalen het schema voor passage van aangepaste NCM afhankelijk van de celdichtheid. Passage wanneer celgroei samenloop op dag 3 of dag 4, of op het tijdstip 4 uur na het verdwijnen van cel-cel grenzen bereikt. Distantiëren de cellen in 1 ml van Accutase, gebruikt een 1 tot 3 splitsverhouding (dwz 1 confluente putje van cellen uitgeplaat in 3 putjes van 6-wells plaat) voor mobiele passage en stabiliseren aangepast NCM door 5 passages.
  8. Cel bevriezing
    1. Gebruik een confluente goed (~ 5-6 x10 6 cellen) gedurende een bevroren flacon: dissociëren cellen ve confluente goed met 1 ml Accutase gedurende 10 minuten.
    2. Verdunnen wi 5 ml mTeSR1 medium en centrifugeer cellen zoals hierboven beschreven.
    3. Resuspendeer de pellet in 500 ui mTeSR1 medium en voeg langzaam 500 ui 2x HPSC invriesmedium (bevattende 20 pM Y-27632) in een cryoconserveringsflesje. Alternatief resuspendeer de cellen in 1X HPSC invriesmedium met 2 uM JAK-remmer 1 of 1X CryoStor CS10 medium in de aanwezigheid van een 10 pM Y-27632 of 2 uM JAK-remmer 1.
    4. Plaats bevroren flacons in een ijs-gekoeld cryocontainer (bottom-gevuld met isopranol) en breng de cryocontainer een -80 ° C vriezer onmiddellijk.
    5. Overdracht cellen van de -80 ° C vriezer een vloeibare stikstof tank (de volgende dag) voor lange termijn cryopreservatie.
  9. Cel ontdooien
    1. Gebruik maken van een cryoconserveringsflesje voor plating 1 putje van een 6-wells plaat.
    2. Voorverwarmen mTeSR1 medium in een 37 ° C waterbad gedurende 10 min, dooi cellen in hetzelfde waterbad gedurende 2 min,druppelsgewijs cellen In 5 ml voorverwarmde mTeSR1 medium dat 10 uM Y-27632 en centrifuge zoals hierboven beschreven.
    3. Voorzichtig resuspendeer de celpellets met 2 ml mTeSR1 medium dat 10 uM Y-27632 en langzaam overbrengen cellen om een ​​goed vooraf bekleed met Matrigel (Opmerking: voorkomen die luchtbellen).
    4. Verander medium dagelijks en verwachten HPSC groei samenvloeiing bereiken op dag 3 of 4.

4 Protocol 3:. Zet HPSC Kolonies op Matrigel om NCM Cultuur

  1. Verwijderen van een Matrigel-gecoate plaat uit de koelkast, plaats de plaat in de weefselkweek kap voor 10 tot 30 minuten, verwijder het medium uit elk putje van de plaat, en voeg 2 ml voorverwarmde mTeSR1 medium aan elk putje.
  2. Transfer aangewreven HPSC klonten van de feeder cultuur (stap 2.10 van de basis-protocol) om de bovenstaande Matrigel plaat. Voeg mTeSR1 medium tot 2,5 ml uiteindelijk volume in elk putje.
  3. Opnieuw medium dagelijks gedurende 3 tot 4 dagens tot kolonies bereiken 80-90% confluentie.
  4. Voor cel passage afspoelen kolonies met D-PBS tweemaal behandelen van de cellen met 1 ml 2 mg / ml dispase bij 37 ° C gedurende 15 tot 20 minuten en sediment en passage cellen bosjes.
  5. Voor NCM cultuur: herhaal stap 3,1-3,9 beschreven in Protocol nr. 2.

5 Protocol 4:. NCM Cultuur van hPSCs op LN-521

  1. Ontdooi de recombinante LN-521 oplossing bij 4 ° C vóór de dag van gebruik en maakt het laminine bekledingsoplossing (LCS) door verdunning van de ontdooide laminine met 1 x D-PBS (met Ca2 + / Mg2 +) tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml.
  2. Voeg 1 ml van de LCS een goed in 6-well plaat (let op: vermijd droog-out tijdens het coating proces).
  3. Dicht de gecoate plaat met Parafilm om verdamping te voorkomen en bewaar de plaat in de koelkast (4 ° C) O / N (let op: gebruik de plaat binnen 1 week).
  4. Verwijder voorzichtig de LCS met een Pasteur pipet zonder teuching het gecoate oppervlak en voeg 2 ml mTeSR1 medium om goed.
  5. Warm alle cultuur-oplossingen (waaronder D-PBS) in een 37 ° C waterbad gedurende 25 minuten.
  6. Converteren HPSC kolonies te NCM
    1. Distantiëren celaggregaten om enkele cellen met Accutase zoals beschreven in Protocol nr. 2.
    2. Zaad 1.3-2 x 10 6 hPSCs tot een goed LN-521-coated (1,4-2,1 x 10 5 cellen / cm 2) zonder de aanwezigheid van ROCK-inhibitoren.
    3. Opnieuw medium per dag gedurende 3 tot 4 dagen.
    4. Distantiëren de cellen in 1 ml Accutase op dag 3 of 4 voor de cel passage met een 1 tot 3 splitsverhouding.

. 6 Protocol 5: NCM Cultuur voor plasmide-DNA transfectie

  1. Passen HPSC koloniën NCM cultuur zoals beschreven in de Protocollen 2-4.
  2. Plaat gedissocieerd hPSCs in 12-wells plaat met een celdichtheid van 7,5 x 10 5 cellen / putje in mTeSR1 medium in de aanwezigheid van 10 uM Y-27632.
  3. Vervang mTeSR1 medium met drugsvrije mTeSR1 medium tussen 4-8 uur na plating de cellen.
  4. Voor elke transfectie Verdun 2,5 ug expressieplasmiden (bijv. pmaxGFP) en 5 pi Lipofectamine 2000 in afzonderlijke Eppendorf buizen in 125 pl elk van Opti-MEM Reduced Serum Medium.
  5. Na 5 min, meng de verdunde reagentia en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (transfectie complexen).
  6. Voeg 250 ul transfectie complexen aan elk putje met hPSCs in 1 ml mTeSR1 en incubeer de cellen bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 24 uur.
  7. Onderzoek de transfectie-efficiëntie onder een fluorescentiemicroscoop en foto willekeurig voor de berekening van de werkelijke transfectie-efficiëntie.

. 7 Protocol 6: NCM Cultuur voor transfectie van MicroRNA

  1. Distantiëren semi-confluente hPSCs op dag 2 onder NCM omstandigheden door 1 ml van Accutase per putje in 6 -Well plaat.
  2. Voeg 10 ml van mTeSR1 medium om enzymatische reacties en centrifuge verdunnen bij 200 xg gedurende 5 minuten.
  3. Resuspendeer de celpellet met mTeSR1 medium zaad de cellen bij een dichtheid van 7,5 x 10 5 cellen per putje in een 12-wells plaat in mTeSR1 medium dat 10 uM Y-27632, en liet de cellen hechten gedurende 4 uur.
  4. Vervang het medium met Y27632-free mTeSR1 medium.
  5. Gebruik in de handel verkrijgbare microRNA's (bijvoorbeeld een niet-targeting Miridian miRNA transfectiecontrole gelabeld met Dy547). Titreer concentraties variërend 0-160 nM met de meegeleverde reagentia en volg de instructies van de fabrikant.
  6. Optimaliseer transfectie-efficiëntie voor elke concentratie in HPSC lijnen door beeldvorming van de Dy547 fluorescentie van de levende cellen onder een microscoop bij 24 uur na de transfectie.
  7. Bereken de transfectie efficiënties het percentage van positieve cellen Dy547 alle afgebeeld cellen.
. TLE "> 8 Protocol nr. 7: NCM Cultuur voor transductie van Lentiviral Vector

  1. Herhaal de stappen 7,1-7,4 van Protocol nr. 6.
  2. Bereken de hoeveelheid virale partikels worden gebruikt voor transductie: Gebruik de volgende formule: TU = (MOI x CN) / VT, terwijl TU duidt het totale aantal transformeren eenheden MOI gelijk is aan de gewenste multipliciteit van infectie bij de put (MOI of TU / cel), CN geeft het aantal cellen in elk putje, en VT geeft voorraad virale titers (TU / ml). Bijvoorbeeld, aangezien stock virale titers SMART-shRNA vector gelijk aan 1 x 10 9 TU / ml (transformeren eenheden per ml), 7,5 x 10 5 cellen per putje bij de transductie en een verwachte MOI van 20: gebruik 15 ul van de voorraad virale deeltjes voor elk putje (let op: deze toestand wordt aanbevolen voor voorbijgaande lentivirale inductie).
  3. Voorverwarmen 300 ul mTeSR1-medium met 10 mg / ml polybreen gedurende 30 minuten.
  4. Voeg 15 ul van voorraad virale deeltjes inde voorverwarmde mTeSR1 medium dat polybreen en de oplossing meng.
  5. Vervang het celkweekmedium met 300 ul voorverwarmde medium dat de virusdeeltjes.
  6. Na 4 uur incubatie, onderzoeken turboGFP fluorescentie (een maker voor shRNA expressie) aan de transductie efficiëntie te bepalen.
  7. Voeg 300 ul van extra mTeSR1 medium om de transducerende goed wanneer de cellen beginnen te turboGFP drukken.
  8. Na 12-16 uur incubatie, heroverwegen turbo-GFP expressie.
  9. Voer gewenste follow-up experimenten met deze getransduceerde cellen binnen 72 uur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een algemeen schema van NCM cultuur

Figuur 1 toont een typische NCM cultuur schema geeft de dynamische veranderingen van hPSCs na hoge dichtheid eencellige plating in aanwezigheid van de remmer ROCK Y-27632. Deze morfologische veranderingen zijn na plating, cellulaire clusters vorming en exponentiële groei cel gevolgd door cel condensatie (Figuur 1A) intercellulaire verbindingen. Een representatief experiment geeft WA01 (H1) hESCs, uitgeplaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn twee belangrijke manieren om cultuur hPSCs in vitro: conventionele kolonie type cultuur (van cellen op feeders of extracellulaire matrices) en ophanging cultuur van hPSCs als aggregaten zonder feeders 6. De beperkingen van kweekmethoden zowel kolonie-type en ophanging omvatten geaccumuleerde heterogeniteit en overerfbare epigenetische veranderingen. NCM cultuur, gebaseerd op zowel single-cell passage en high-density cel plating, vertegenwoordigt een nieuwe kweekmethode voor HPSC groei 6,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health (NIH) bij het National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We willen Dr. Ronald D. McKay bedanken voor zijn discussie en opmerkingen over dit project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tellerteller voor geautomatiseerde cellenInvitrogen Inc.C10227Automatisch celtelling
Faxitron Cabinet X-ray SystemFaxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL Model RX-650X-stralingsbestraling van MEFs
MULTIWELL 6-wells platenBecton Dickinson Labware353046Polystyreen platen
DMEMInvitrogen Inc.11965–092Voor MEF medium
Mitomycin CRoche107409Mitoseremmer
TrypsineInvitrogen Inc.25300-054Voor MEF dissociatie
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330–032Voor hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen Inc.31985-062Voor hPSC transfectie
Inactief FBSInvitrogen Inc.16000–044Component van MEF medium
Knockout Serum ReplacementInvitrogen Inc.10828–028KSR, Component van hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SalineInvitrogen Inc.14190-144D-PBS, vrij van Ca2+/Mg2+
Niet-essentiële aminozurenInvitrogen11140–050NEAA, component van hPSC medium
L-GlutamineInvitrogen 25030–081Component van hPSC medium
mTeSR1 & SupplementenStemCell Technologies5850Dierlijk eiwitvrij
TeSR2 & SupplementenStemCell Technologies5860Xeno-vrij medium
β-mercaptoethanolSigma M7522Component van hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC		American Type Culture Collection (ATCC) SCRC-1040Voor feedercultuur van hPSCs
hESC-gekwalificeerde MatrigelBD Bioscience354277Voor feeder-vrije cultuur van hPSCs
Laminin-521BioLaminaLN521-02Human recombinant eiwit
FGF-2 (recombinant FGF, basisch)R&D Systems, MN223-FBGroeifactor in hPSC medium
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X gemengde enzymatische oplossing
JAK-remmer IEMD4 Biosciences420099Een remmer van Janus kinase
Y-27632EMD4 Biosciences688000ROCK-remmer
Y-27632Stemgent04-0012ROCK-remmer
Y-39983Stemgent04-0029ROCK I-remmer
PhenylbenzodioxaanStemgent04-0030ROCK II-remmer
ThiazovivinStemgent04-0017Een nieuwe ROCK-remmer
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 µm celstrainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °CThermo Scientific C6516F-1“Mr. Frosty” Bevriezingscontainer
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027Transfectiereagentia
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02Transfectiereagens
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfectie ControlThermo ScientificIP-004500-01-05Gelabeld met Dy547, om de aflevering van microRNAs te controleren 
SMART-shRNAThermo Scientific Te bepalenLentivirale vector
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)Opgenomen in elke transfectiekitExpressieplasmide voor transfectiecontrole
Oct-4Santa Cruz Biotechnologysc-5279Muis IgG2b, pluripotente marker
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologysc-21702Muis IgM, differentiatiemarker
SSEA-4Santa Cruz Biotechnologysc-21704Muis IgG3, pluripotente marker
Tra-1-60Santa Cruz Biotechnologysc-21705 Muis IgM, pluripotente marker
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706Muis IgM, pluripotente marker
CK8 (C51)Santa Cruz Biotechnologysc-8020Muis IgG1, tegen cytokeratine 8
α-fetoproteïneSanta Cruz Biotechnologysc-8399AFP, muis IgG2a
HNF-3β (P-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2, geiten polyklonaal antilichaam
Troponin T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0Muis IgG1
DesmineThermo ScientificRB-9014-P1Konijn IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc, JapanRCAB0004P-FPolyklonaal antilichaam 
Rat anti-GFAPZymed13-0300Glial fibrillair zuur eiwit
Albumine (clone HSA1/25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513AMuis IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4)DakoCytomation IncIR611/IS611Muis IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326Konijn polyklonaal antilichaam
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, muis IgG2a
HNF4α (C11F12)Cell Signaling Technologies3113Konijn monoklonaal antilichaam
Paraformaldehyde (oplossing)Electron Microscopy Sciences15710PFA, fixeermiddel, verdund in D-PBS

Referenties

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167(2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Humane pluripotente stamcellenmonocuultuurROCK remmer Y 27632laminine 521 kweekgenetische modificatieceltransfectieexpansie van stamcellengedefinieerde prote nekweekkleine molecuulremmerskolonievrije kweek
Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.