Methodenartikel

Inzicht in de vroege organogenese Met behulp van een vereenvoudigd

38.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51526

⸱

12 januari 2015

 ,  ,  ,  , 
1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

In dit artikel

Samenvatting

Het Xenopus laevis-embryo blijft uiterst nuttig in de studie van vroege ontwikkeling vanwege zijn grote omvang en gemakkelijke manipulatie. Er wordt een vereenvoudigd protocol voor volledige montage in situ hybridisatie gegeven dat kan worden gebruikt bij de identificatie van specifieke organen in dit modelsysteem.

Samenvatting

Organogenese is de studie van hoe organen worden gespecificeerd en vervolgens hun specifieke vorm en functies verwerven tijdens de ontwikkeling. Het Xenopuslaevis embryo is erg nuttig voor het bestuderen van organogenese omdat hun grote omvang zeer geschikt is voor het identificeren van organen in de vroegste stadia van organogenese. Op dit moment is de primaire methode die wordt gebruikt voor het identificeren van een specifiek orgaan of primordium whole mount in situ hybridisatie met gelabelde antisense RNA-sondes specifiek voor een gen dat tot expressie wordt gebracht in het orgaan van belang. Bovendien is het relatief eenvoudig om genen of signaalroutes in Xenopus te manipuleren en in situ hybridisatie maakt het mogelijk om vervolgens veranderingen in de aanwezigheid of morfologie van een doelorgaan te meten. Whole mount in situ hybridisatie is een meerdaags protocol met veel stappen betrokken. Hier bieden we een vereenvoudigd protocol met verminderd aantal stappen en gebruikte reagentia dat goed werkt voor routinematige tests. In situ hybridisatie robots hebben het proces enorm vergemakkelijkt en we beschrijven hoe en wanneer we die technologie in het proces gebruiken. Zodra een in situ hybridisatie voltooid is, kan het vastleggen van de beste afbeelding van het resultaat frustrerend zijn. We geven advies over hoe u de beeldvorming van in situ hybridisatie resultaten kunt optimaliseren. Hoewel het protocol de beoordeling van organogenese in Xenopus laevis beschrijft, kan hetzelfde basisprotocol vrijwel zeker worden aangepast aan Xenopus tropicalis en andere modelsystemen.

Inleiding

Het expressiepatroon van een specifiek gen is een belangrijke informatie om de potentiële rol van dat gen bij de ontwikkeling van een specifiek orgaan of celtype te bepalen. Simpel gezegd, als het niet op het juiste moment en op de juiste plaats wordt geëxpresseerd, is het onwaarschijnlijk dat het een sleutelrol speelt. In Xenopus, zoals in de meeste vroege embryo's, is de meest gebruikte test voor het detecteren van de expressie van een gen de volledige montage in situ hybridisatie met behulp van gelabelde antisense RNA-probes. Het gebruik van antilichaamkleuring om de expressie van een gen in Xenopus te beoordelen wordt steeds gebruikelijker naarmate onderzoekers antilichamen ontdekken, meestal opgewekt tegen zoogdierproteïnen, die reageren met het Xenopus-homoloog of hun eigen antilichamen genereren 1-3. Echter, het overgrote deel van de studies over Xenopus organogeneze maakt nog steeds gebruik van antisense RNA-probes. Wanneer antilichamen worden gebruikt, vereist elk individueel antilichaam vaak optimalisatie voor de primaire antilichaamconcentratie of fixatieprotocollen. Daarentegen is het protocol voor in situ hybridisaties in wezen invariant voor verschillende probes. Het basisconcept is relatief eenvoudig en er is een uitstekend standaardprotocol goed vastgesteld 4. Ons protocol is een gestroomlijnde versie van het oorspronkelijke protocol 4 die nog steeds uitstekende detectie van genregulatiepatronen in het vroege embryo biedt. De embryo's worden gefixeerd en vervolgens voorbereid voor hybridisatie door oplossingen en temperaturen te veranderen, zodat het een hoge stringentie binding van de gelabelde antisense RNA-probe tot zijn doel-mRNA mogelijk maakt. De ongebonden probe wordt weggespoeld en de embryo's worden vervolgens voorbereid voor binding van een antilichaam tegen het label op de RNA-probes. Overtollig antilichaam wordt vervolgens weggespoeld en een enzymatische kleuringsreactie wordt gebruikt om te lokaliseren waar de RNA-probe in de embryo is gebonden. Er zijn nu een aantal Xenopus transgene lijnen die expressie van fluorescerende proteïnen in specifieke weefsels aandrijven en deze zijn beschikbaar bij de Xenopus-kweekcentra zoals het National Xenopus Resource in Woods Hole. Hoewel zeer nuttig voor veel experimenten die de ontwikkeling van organen in levende embryo's vereisen, vereist deze optie aparte huisvesting voor de transgene lijnen.

In situ hybridisatie kan duidelijk afbakenen waar specifieke organen of celtypen zich in het vroege embryo zullen vormen (Figuur 1). De techniek is opmerkelijk gevoelig gezien dat men genexpressie kan detecteren in een klein aantal cellen in een enkel embryo 5. Echter, in situ hybridisatie met behulp van de intensiteit van colorimetrische kleuring wordt niet als kwantitatief beschouwd omdat de kleurreactie niet lineair is. Ondanks de moeilijkheid om de kleuringsintensiteit te kwantificeren, zijn veranderingen in expressie vaak heel merkbaar; vooral wanneer de in situ hybridisatie kwantificeerbare toenames of afnames in de grootte van expressiedomeinen laat zien 6,7.

De duidelijke voordelen van volledige montage in situ hybridisatie maken het een kritische test in de studie van vroege ontwikkeling. Echter, het is een tijdrovende test die vele stappen over verschillende dagen vereist. Dit protocol is een vereenvoudigde versie van het standaardprotocol dat verschillende stappen elimineert zonder de kwaliteit van het in situ resultaat te verminderen. De vereenvoudiging elimineert ook bronnen van variabiliteit, waardoor het oplossen van problemen eenvoudiger wordt als een in situ hybridisatie niet optimaal is. Specifiek hebben we het gebruik van proteinase K en RNAse-behandelingen van het embryo geëlimineerd, twee stappen die kunnen afhangen van de kwaliteit van de reagentia en die ook de signaalintensiteit kunnen verminderen als het overdreven wordt. Het protocol biedt ook enige mate van kostenbesparing door het elimineren van het gebruik van verschillende reagentia. Ten slotte biedt dit protocol ook enkele eenvoudige richtlijnen voor verbeterde opname van afbeeldingen van in situ hybridisatieresultaten. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor werk in Xenopus-embryo's, is het waarschijnlijk dat ten minste enkele van de vereenvoudigingen toepasbaar zullen zijn op in situ hybridisatiewerk in andere embryosystemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Embryo Voorbereiding

  1. Indien niet routinematig uitgevoerd worden bij embryokweek, de gelei het embryo met 2,5% cysteïne, pH 8,0 vóór fixatie 8. Hoewel het niet absoluut noodzakelijk, is het nuttig om dan handmatig bevruchting envelop te verwijderen voor fixatie met fijne pincet.
    1. Gebruik glas pasteurpipetten om de embryo's te dragen. De pipet is niet breed genoeg is om over te dragen embryo's dus gebruik een diamant pen om de glazen pipet op een punt dat breed genoeg is om pick-up een embryo te snijden. Elimineer de scherpe randen van de pipetten na het snijden door snel passeren de cut tip door de vlam van een bunsenbrander aan de scherpe randen smelten.
      OPMERKING: Zorg moet worden genomen, zoals het glas nog heet genoeg is om brandwonden te veroorzaken kan zijn, ook al lijkt het door visuele inspectie te zijn afgekoeld.
  2. Voer de embryo fixatie in fasen. Ten eerste, voor te bereiden glazen flesjes voor gebruik in embryo fixatie. Gebruik deze flacons voor alle stappen inbegrip van de definitieveopslag. Gebruik injectieflacons die helder met een goede Teflon afdichting in het deksel zijn, waardoor de controle embryo's in alle fasen van het proces. Label de vaatjes met geschikte experimentele gegevens met stift en dek de label met doorzichtige tape, als ook permanente marker verloren in de loop van de procedure door het gebruik van alcohol en andere oplosmiddelen.
    1. Gebruik Mempfa om de embryo's te repareren. Voeg een voorraad van 8% paraformaldehyde in batches van 50-100 ml per keer. Gebruik ongeveer 75% van de benodigde H 2 O en warmte tot 50-60 ° C, die nodig is om de paraformaldehyde in oplossing te krijgen.
      LET OP: Deze oplossing is iets anders dan de Memfa gebruikt bij oudere gepubliceerde protocol versies in dat het gebruik maakt van paraformaldehyde in plaats van formaldehyde.
    2. Voeg 2-3 druppels 10N NaOH of totdat de pH is ongeveer 7,5 (gebruik pH-papier om de pH te controleren). Paraformaldehyde is zeer giftig, dus het genereren van de stockoplossing in een zuurkast. Zodra de paraformaldehyde in oplossing, filtreer de oplossing door Whatman papier in een verse kolf en voeg H2O tot het eindvolume. Desgewenst bewaar de paraformaldehyde oplossing bij 4 ° C gedurende 1-2 weken.
    3. Monteer de overige componenten van de Mempfa fixatie-oplossing (Tabel 1). Ervoor zorgen dat de uiteindelijke werking concentratie van paraformaldehyde is 4%. Bewaar alle onderdelen van het fixatie-oplossing bij 4 ° C als voorraad.
    4. Met behulp van een geslepen glazen pipet, bevestig de embryo's door toevoeging van de embryo met de gedeclareerde glazen flacons die zijn gevuld met ongeveer 3-4 ml Mempfa oplossing (Tabel 1). Vermijd de vaststelling van meer dan 20-30 embryo's per flacon. Voeg de embryo's met een minimum van vloeistofoverdracht van het embryo medium. Fix embryo Mempfa oplossing 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
    5. Voor late endoderm structuren voeren de in situs op handmatig geïsoleerde darm en endoderm derivaten 9,10, Die zorgt voor een goede penetratie van de sonde en vermijdt ook holte kleuring.
    6. Sla een oplossing van 100% methanol bij -20 ° C. Na paraformaldehyde fixatie, vervangen Mempfa oplossing ongeveer 4 ml van de -20 ° C, 100% methanol voor opslag van embryo's.
    7. Schud de flesjes na toevoeging van de methanol te voorkomen dat de embryo's kleven aan het glas of ander embryo. Ook, zorg ervoor dat de flesjes zijn goed afgesloten omdat de methanol kan verdampen in de vriezer na verloop van tijd als los.
      OPMERKING: Embryo's worden gedurende ten minste één jaar, en waarschijnlijk langer in de methanol vóór kleuring zonder verlies van in situ hybridisatie kwaliteit.

2. Probe Voorbereiding

  1. Gebruik 1-2 ug matrijs DNA de digoxigenine gelabelde probes maken. Knip plasmide bevattende de geschikte DNA-sequentie aan het einde van het gen van belang met een beperking van de 5 'enzym geschikt voor that vector antisense probes genereren.
    Opmerking: Het plasmide zou een geschikte RNA polymerase bindingsplaats (bijvoorbeeld T7, T3 of SP6) hebben.
  2. Laat het DNA, water, NTP mix en polymerase buffer opwarmen tot kamertemperatuur vóór het monteren van de sonde synthesereactie. Voeg de componenten van de RNA-synthese reactie op een 1,5 ml microcentrifugebuis in de volgorde zoals vermeld in tabel 2. Stel het volume water toegevoegd om het totale volume van de sonde synthesereactie 20 ui te brengen. Monteer de reactie bij kamertemperatuur omdat componenten van de polymerasebuffer het matrijs-DNA als in hoge concentraties en koude precipiteren.
  3. Incubeer de transcriptie reactie gedurende 2 uur bij 37 ° C.
    OPMERKING: Incubaties van iets langer dan twee uur leidt tot geen nadelige effecten, maar ook tonen weinig verhoogde opbrengst. Als gedurende één uur, wordt de opbrengst verminderd maar nog steeds voldoende om een ​​goede probe te maken.
    1. In afwachting van de transcriptie reactie tot einde, maken een agarosegel die wordt gebruikt om de kwaliteit van de probe testen. Smelt 1 ug agarose in 100 ml 1 x TAE buffer (zie tabel 1) van de oplossing te verwarmen tot het kookpunt. Verwijder de oplossing van het vuur wanneer de agar poeder volledig is opgelost.
    2. Voeg 2 pi ethidiumbromide voorraadoplossing (10 mg / ml) tot ongeveer 100 ml agarose gel als de agarose afgekoeld tot ongeveer 60 ° C tot visualisatie van RNA onder ultraviolet (UV) licht binnen te laten.
      OPMERKING: Deze agarosegel oplossing kan in een 60 ° C incubator worden gehouden, zodat toekomstige gels kunnen worden gegoten zonder herhaald smelten. Wees voorzichtig bij het gebruik van ethidiumbromide vanwege mogelijke toxiciteit.
  4. Voeg 1 ul DNAsel (RNAse vrij kwaliteit) om de transcriptie reactie na 2 uur incubatie en incubeer nogmaals 10 min bij 37 ° C om matrijs-DNA te elimineren.
  5. Verwijder 1 pl van het reactiemengsel teControleer op 1% agarose TAE-gel en de rest (20 ul) voeg 80 ul van 1% SDS in TE buffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), 10 pl 5 M NH4-acetaat en 220 gl koude ethanol. Vortex de mix krachtig en zet apart op ijs totdat de resultaten van het RNA kwaliteitscontrole zijn bekend.
    1. Run 1 pl RNA verwijderd voordat neerslaan op 1% agarose TAE-gel. Het laden op de gel te verlichten, voeg 4-5 ul water en 1 pl standaard laadkleurstof het RNA. Bekijk het RNA op de gel met UV licht transilluminator teneinde de kwaliteit van de probe controleren (zie bespreking).
  6. Neerslaan van de resterende RNA dat was gereserveerd op ijs in stap 2.5 door het draaien in een microcentrifuge op volle snelheid gedurende 10 tot 15 minuten. Trekken uit de bovenstaande vloeistof met een uitgesponnen glazen pipet en laat het even drogen.
    1. Resuspendeer de sonde met 1 ml van RNA hybridisatie buffer (tabel 1) in eppendorf buis. Vortex en briefly verwarming weer de buis tot 37 ° C en vortex. Breng de probe-oplossing om een ​​15 ml schroefdop polystyreen buis en vul tot 7-10 ml met RNA hybridisatie buffer. Opmerking: De sonde kan verder worden verdund (een 10-voudige verdere verdunning kan nog steeds werken), wat vaak resulteert in lage achtergrond, maar de vlekken reacties zal ook langer duren.

3. In situ hybridisatie

  1. Neem de embryo's die werden opgeslagen in -20 ° C methanol en laat opwarmen tot kamertemperatuur. Voer de gehele procedure in glazen flesjes. Als verschillende embryo's van de ene groep gaat op om bekeken te worden door verschillende sondes, bewaar ze in een enkele flacon tot net voor de sondes worden toegevoegd aan variabiliteit en arbeid te verlagen op de eerste dag.
    1. Hydrateren het embryo door een methanol reeks zoals aangegeven in tabel 3 (zie Tabel 1 voor wassen recepten) ter voorbereiding toevoeging van de probe. Zwenk de embryos na elke wijziging om ervoor te zorgen dat ze niet vast te houden aan de zijkanten of met elkaar, en rock de embryo's door het monteren van de injectieflacons op een nutator. Bij het overbrengen van de vloeistoffen, controleer dan de binnenkant van de kappen om ervoor te zorgen dat de embryo's niet zijn er gevangen.
    2. Eenmaal in de probe oplossing, hybridiseren de embryo's nachts zoals beschreven in Tabel 3.
  2. Verwijder de probe oplossing. Sla de gebruikte probe door opslag in een 15 ml schroefdop polystyreen buis, gemarkeerd met datum en het aantal keren dat de probe is gebruikt, bij -20 ° C.
    OPMERKING: Dezelfde sonde kan vele malen worden hergebruikt voor de daaropvolgende in situ hybridisatie, totdat de colorimetrische reacties beginnen om een abnormaal lange tijd te nemen om de gewenste intensiteit te bereiken.
    1. Zodra de sonde verwijderd, bereid de embryo's voor antilichaamkleuring tegen de sonde door de reeks wassingen opgesomd in tabel 4. Wijzig de temperatuur vereist (tabel 4) door verplaatsing thij nutator met injectieflacons embryo gevoegd, direct in hybridisatie ovens die zijn ingesteld op de juiste temperatuur.
    2. Vul het geschikte volume van de MAB + HTSS + BR + anti-Dig antilichaam (Tabel 4) op het moment dat het embryo worden geïncubeerd in de MAB + HTSS + BR blokkeeroplossing zodat het antilichaam voorafgaand geblokkeerd aan het toevoegen aan de embryo. Maak de blokkerende oplossingen vers op de dag van gebruik.
  3. Verwijder de antilichaamoplossing en beginnen wast zoals in Tabel 5 na overnacht incubatie met antilichaam. Voer minstens twaalf 30 min wassingen in voorbereiding op kleuring met alkalische fosfatase substraat en achtergrondgeluid zoveel mogelijk. Gebruik ofwel MAB buffer of TBT-oplossing (tabel 1) voor de stappen wassen.
    OPMERKING: TBT oplossing is TTW dat 2 mg heeft / ml BSA toegevoegd.
    1. Vervang de laatste wasbeurt oplossing met de BM Purple alkalische fosfatase substraat. Voer de kleuring reactie bij ofwel kamertemperatuur of 37 ° C.
      OPMERKING: Kleuring is sneller bij 37 ° C maar als nacht staan, kunnen ongewenste achtergrondkleuring vaak resultaat. De kleuring reacties zullen vereisen vaak 's nachts vlekken en kamertemperatuur is het veiligst voor dit.
    2. Als verdere kleuring wordt vereist en de BM paarse oplossing neemt op een blauwe kleur, vervang de kleuring met een fris BM Purple en zet de buizen in 37 ° C. Als het doel-mRNA is zeer overvloedig, zet de embryo's in de kleuroplossing bij 4 ° C geïncubeerd en vervolgens naar de embryo kamertemperatuur of 37 ° C een betere controle van de kleuringsreactie mogelijk.
    3. Nieuwe reacties voorzichtig, als de tijd tot eindresultaat verschilt aanzienlijk tussen de verschillende doelgroepen RNA's. Voor de consistentie, stop de kleuringsreactie (zie 3.4) als er geen nieuwe sites van meningsuiting die voortvloeien met langere incubatietijd. Belangrijk, indien in situ hybridisatie wordt gebruikt als een assayvoor experimenten te kijken naar verschillende behandelgroepen, gebruiken dezelfde tijd voor kleur reacties tussen behandeling en controle embryo's.
  4. Stop de kleuringsreactie en voorbereiden van de embryo's voor opslag en beeldopname door het veranderen van de vloeistoffen zoals aangegeven in tabel 6. Niet rocken het embryo in dit stadium, omdat het verwijderen van de vlek kan worden gevisualiseerd als paarse verkleuring van de methanol rond de embryo's.
    OPMERKING: Vaak embryo een lichtblauwe kleuring van de kleuroplossing en koude methanol kan ten minste gedeeltelijk verwijderen dat, hoewel dit niet voldoende om zware achtergrond of holte vlekken verwijderen. Koud methanol verwijst naar methanol die wordt bijgehouden in een -20 ° C vriezer.
    1. Rehydrateren de embryo's en bevestig de vlek met Mempfa (Tabel 6). Eenmaal bevestigd, verwijder de Mempfa en was de embryo's met 25% methanol.
    2. Verwijder de 25% methanol en voeg de blekende oplossing als verwijdering van endogeen pigmentis vereist. Wees voorzichtig bij het hanteren van de bleken oplossing als het brandwonden kan veroorzaken. Neem het bleken dicht het gebeurt relatief snel en de mate van bleken kan worden gevarieerd voor verschillende effecten (Figuur 2).
    3. Dehydrateer embryo door methanol reeks 100% methanol voor langdurige opslag na bleken of plaatsing PBS voor de korte termijn opslag en latere beeldvorming (zie tabel 6).

4. Imaging Embryo's

  1. Zodra een embryo de kleuring proces is voltooid, afbeelding het embryo, zodat de informatie over waar het gen van belang wordt uitgedrukt wordt vastgelegd voor een breder publiek. Gebruik 1% agarose als achtergrond aan niet-afgehandelde embryo's te bekijken.
    OPMERKING: De agarose geeft een blauw / grijze achtergrond die goed contrasteert met de embryo en de blauwe kleur van de kleuringsreactie. Het helpt ook diffuus storende schaduwen en reflecties die de aandacht afleiden van het embryo.
    1. Voeg agarose aan water en breng aan de kook totdat de agarose is opgelost en laat afkoelen tot 50 voordat gieten in de petrischaal. Zoals bij de TAE gel oplossing bewaar de agarose oplossing 55 ° C incubator voor meerdere doeleinden. Giet de agarose tot een diepte van ongeveer 2 mm in de petrischaal. Indien nodig, pas de diepte van agarose om een ​​iets anders tint van de achtergrond opleveren.
    2. Na rehydratie van opslag in methanol aan een waterige oplossing (PBS of TTW), met methanol serie, plaatst de embryo's in een petrischaal met agarose basis (zie tabel 6). Bewaar de oplossing schoon en, indien nodig, gebruik maken van eenvoudige filtering tot kleine deeltjes die de schone achtergrond van goede beelden kunnen verstoren te elimineren.
    3. Om het beeld van de embryo's van alternatieve opvattingen, zoals van de buikzijde, snijd dunne kanalen in de agarose om het embryo te passen met behulp van fijne tang en plaats de embryo's in die kanalen voor oriëntatie (Figuur 3 ). Wees voorzichtig bij het manipuleren van de embryo's worden gemakkelijk beschadigd.
      OPMERKING: De meeste fasen hebben een karakteristieke positie die zij nemen wanneer geplaatst in oplossing. Bijvoorbeeld, blastula-stadium embryo's hebben de neiging om dierlijke kant gaan zitten. Zodra de embryo's beginnen te verlengen, leggen ze aan hun kant.
  2. Gebruik de glasvezel lichtbron om het embryo te verlichten van een kleine hoek, het creëren van schaduwen op het embryo die diepte geven aan het imago en helpen onderscheiden oppervlaktestructuren. Omdat bleken pigment dat nuttig bezienswaardigheden biedt, kan elimineren gebruiken shadowing voor sterk gebleekt embryo's.
  3. Schakel de embryo afbeelding kleuring die diep in het embryo, zoals in de notochord, long of gebieden van de hersenen (figuur 4). Hiertoe zet het embryo door een methanol serie tot 100% methanol.
    1. Na volledige onderdompeling in methanol, breng de embryo's een oplossing van een deel benzylalcohol en twee delen benzylnzoate (BABB). De embryo zal aanvankelijk drijven op het oppervlak, maar als methanol mengt met de BABB, zullen ze zinken in de BABB. Voeren elke stap omgaan met BABB in glazen flesjes of schotels; BABB zal geen plastic of verf smelten.
    2. Eenmaal gewist, bekijk de embryo's met doorgelaten licht van beneden komt het embryo. De intensiteit van het licht en de hoek van onder naar contrast te verbeteren en de beste kleur.
    3. Bij het bekijken ontruimd embryo heffen het glas petrischaal van de basis af. Dit doe je door simpelweg met behulp van twee andere petrischaal deksels op te trekken, zodat de regio van de schotel met embryo's wordt verhoogd.
      LET OP: Dit heeft het voordeel van het nemen van de basis uit van focus en het elimineren van storende effecten van onvolkomenheden of vlekken op de microscoop basis die kunnen interfereren met de afbeelding.

5. Dubbelklik in situ hybridisatie

  1. Om tegelijkertijd te bekijken het expressiepatroon van two verschillende genen in een embryo, synthetiseren twee sondes, één voor elk van de verschillende genen. Samenstel een probe met DIG-11-UTP als label zoals hierboven beschreven. Verdun het product van de transcriptie reactie in RNA hybridisatie buffer tot een meer geconcentreerde 3x probe opleveren dan voor een enkele in situ hybridisaties.
    1. Samenstel de andere probe plaats met hetzelfde protocol als voor DIG gemerkte gesondeerd met uitzondering fluoresceïne-12-UTP worden vervangen DIG-11-UTP. Verdun het product van de transcriptie reactie in RNA hybridisatie buffer tot een meer geconcentreerde 3x probe opleveren dan voor een enkele in situ hybridisaties.
    2. Meng de twee geconcentreerde probes in een 1: 1 verhouding. Voor het beste resultaat, gebruik dan de fluoresceïne-gelabelde probe voor het gen dat de sterkste uitdrukking in de single in situ hybridisatie protocol laat zien.
  2. Gebruik hetzelfde in situ hybridisatie protocol beschreven voor de enkele in situ </ Em> hybridisaties, behalve gebruikt een dubbele sonde (probe die de 1,5x geconcentreerde mengsel van digoxigenine-gelabelde en fluoresceïne-gelabelde probes) aan het einde van de eerste dag in plaats van een in situ hybridisatie probe.
    1. Volg de enkele hybridisatie protocol op de tweede dag van de dubbele in situ hybridisatie protocol, met uitzondering van het gebruik van anti-fluoresceïne-AP Fab fragmenten bij een 1: 4000 verdunning in plaats van anti-DIG-AP Fab-fragmenten. Spoel de overtollige antilichaam uit het embryo als in de single in situ-protocol en het uitvoeren van de eerste kleur reactie met behulp van de BM-Purple AP substraat.
  3. Na de eerste kleurreactie, inactiveren de flourescein antilichaam in 0,1 M glycine pH 2,0 gedurende 40 min gevolgd door vijf tien minuten wassingen in MAB. Blokkeer de embryo MAB + HTSS + BR 90 min. Voeg de anti-DIG antilichaam bij een 1: 2000 verdunning in MAB + HTSS + BR en incuberen bij 4 ° C overnacht.
    1. De volgende dag was de embryo thoroughly in MAB (12 wasbeurten van 30 min) om de overmaat antilichaam te verwijderen.
    2. Was de embryo's gedurende 10 minuten in AP-buffer (Tabel 1) en vervolgens kleuren met BCIP (0,5 mg / ml AP-buffer).
      OPMERKING: De in situ combinatie zou een donker blauwpaarse kleuring voor de eerste kleurreactie en een lichtblauwe kleur reactie voor het tweede (figuur 5) werd verkregen.
    3. Stop de uiteindelijke kleur reactie door het verwijderen van de AP-buffer en spoel drie keer met MAB. Bevestig de embryo's met Mempfa gedurende 10 min. Was de embryo's met 5 snelle wasbeurten in MAB of TBT.
    4. Met deze kleurencombinatie, het gebruik van methanol in de post kleuring behandelingen niet meer mogelijk, omdat de BCIP alleen kleur elimineren. Bewaar de embryo na kleuren en fixeren in PBS met 0,02% natriumazide. Kleuringsintensiteit kan zwak met dubbele in situs zijn. Indien dit een probleem is, verminderen de wassingen vier, elk van 2 uur duren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het gebruik van weefselspecifieke probes uitstekende informatie met betrekking tot de stand van de specifieke organen. In de volgende voorbeelden wordt de stap van het embryo op basis van Nieuwkoop en Faber stagingtabel 11. Gebruikt men probes vorm genen tot expressie na differentiatie, cardiaal troponine I in stadium 28-30, bijvoorbeeld (figuur 1C), de aanwezigheid of de grootte van een gedifferentieerde orgaan kan worden beoordeeld in elk stadium na differentiatie. Jaren geleden, e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het vermogen om te gebruiken in situ hybridisatie met het expressiepatroon van specifieke genen zichtbaar blijft de meest gebruikte methode om specifieke organen of celtypen in het Xenopus embryo identificeren. Dit is wegens verscheidene voordelen van deze techniek. De expressie van een gen kan specifieke structuren te identificeren goed voordat een histologische tekenen van differentiatie, zoals het geval is voor Nkx2.5 expressie in het hart voorouders voorafgaand aan een duidelijke afbakenin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de CIHR bedanken voor de fellowshipondersteuning van Steve Deimling en het Department of Paediatrics, University of Western Ontario voor de ondersteuning van Steve Deimling, Rami Halabi en Stephanie Grover. Dit werk werd ondersteund door de NSERC-subsidie R2654A11 en een NSERC Discovery Accelerator Supplement

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Labguake Tube ShakersVWR17-08-2011
VWR VialsVWR10-07-2012
L-CysteineBioShopCYS342.500
Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mMRoche11277057001
Digoxigenin-11-UTPRoche11209256910
Rnase inhibator (Rnase OUT)Invitrogen 10777-019
T7 RNA PolymeraseFermentasEPO111
T3 RNA PolymeraseFermentasEPO101
SP6 RNA PolymeraseFermentasEPO131
Dnase 1Invitrogen 18047-019
Sheep Serum Wisent31150
Blocking reagentRoche11096176001
BM purple Ap SubstrateRoche11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragmentsRoche11093274910
MethanolVWRCAMX0485-7
NaClBioShopSOD002.10
SDSEM 7910
EDTABioShopEDT001.500
TrisBioShopTRS003.5
Tween-20EM 9480
MgSO4SigmaM-2643
MopsBioShopMOP001.250
EGTASigmaE-3889-25G
ParaformaldehydeBioShopPAR070.500 
Formamide VWR    CAFX0420-4 
RNARoche10109223001
Maleic Acid VWR    CAMX0100-3
tri-Sodium CitrateBioShopCIT001
Hydrogen Peroxide (30% Solution)EM HX0635-2
BSABioShopALB001.100
PVP-40ICN195451
Ficoll 400GE Healthcare17-0300-10
Benzyl AlcoholSigmaB-1042
Benzyl BenzoateSigmaB-6630
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500

Referenties

  1. Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
  2. Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
  3. Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
  4. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  5. Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
  6. Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
  7. Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
  8. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
  10. Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
  12. Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
  13. Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
  14. Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
  15. Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
  16. Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
  17. Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
  18. Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
  19. Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
  20. Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Xenopus embryo sstudie naar organogenesegenexpressieanalyseembryo fixatieprobesyntheseantilichaamskleuringoptimalisatie van beeldvormingmethanolserieARO achtergrond

Gerelateerde artikelen