Methodenartikel

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's

DOI:

10.3791/51533

⸱

17 mei 2014

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravis embryo's zijn een krachtig hulpmiddel voor grootschalige screening van kleine moleculen. Transgene zebravis dat fluorescente reporter eiwitten tot expressie worden vaak gebruikt om chemicaliën die genexpressie moduleren. Chemische schermen die fluorescentie assay in levende zebravis vaak een beroep op dure, gespecialiseerde apparatuur voor hoge gehalte screening. We beschrijven een procedure met behulp van een standaard epifluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde podium om het beeld automatisch zebravis embryo's en detecteren weefsel-specifieke fluorescentie. Met behulp van transgene zebravis dat oestrogeen receptor-activiteit via expressie van GFP melden, we een semi-geautomatiseerde procedure ontwikkeld voor het screenen op oestrogeen receptor liganden die de verslaggever in een weefsel-specifieke wijze te activeren. In deze video beschrijven we procedures arraying zebravis embryo 24-48 uur na de bevruchting (HPF) in een 96-well plaat en het toevoegen van kleine moleculen die oestrogeenreceptoren binden. Op 72-96 HPF, beelden van elk putje vande hele plaat worden automatisch verzameld en handmatig gecontroleerd op weefsel-specifieke fluorescentie. Dit protocol toont het vermogen aan oestrogenen die receptoren in hartkleppen inschakelen, lever detecteren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgene zebravis ontwikkeld die het mogelijk maken de directe visualisatie van de activiteit in signaaltransductiewegen zoals fibroblast groeifactoren 1, retinoïnezuur 2 en 3 oestrogenen, in levende embryo. Dergelijke tools kunnen screenen op stoffen die signalerende wegen verstoren (getest als verandering in de fluorescentie-intensiteit) of voor chemische stoffen die moduleren signalering in een weefsel-specifieke wijze (verandering in de fluorescentie lokalisatie) 4. Geautomatiseerde beeldopname verhoogt de doorvoer van chemische schermen dramatisch 5,6. Schermen die automatisch assay fluorescentie in levende zebravis vaak een beroep op dure, gespecialiseerde apparatuur. Zogenaamde high content levert het voordeel van hoge resolutie kwantitatieve beeldvorming maar ten koste van het gebruik van gespecialiseerde plaatlezers ingericht voor confocale microscopie 7,8. Het doel van deze methode is automatisch assay weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryoin een 96-wells plaat met een standaard epifluorescentiemicroscoop. Weefsel-specifieke fluorescentie kan worden onderscheiden met behulp van deze techniek en kan een redelijke benadering voor laboratoria die de toegang tot gespecialiseerde plaat lezers of high content apparatuur ontbreekt zijn.

In dit protocol gebruiken we geautomatiseerde beeldvorming om weefselspecifieke oestrogeenreceptor (ER) agonisten in levende zebravis detecteren 3 dagen na de bevruchting (dpf). De transgene lijn Tg (5xERE: GFP) c262/c262 bevat 5 tandem oestrogeen respons element DNA-sequenties (ERE) stroomopwaarts van groen fluorescerend eiwit (GFP) 3. Bij afwezigheid van ligand, ERs gewoonlijk inactief. Ligandbinding veroorzaakt een conformationele verandering waardoor receptoren ERE DNA te binden en transcriptie te reguleren 9. 5xERE: GFP vis kan worden gebruikt om chemische bibliotheken te screenen ER modulatoren en kan worden gebruikt om de milieu watermonsters oestrogene verontreinigingen screenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Dit protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Alabama in Birmingham Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Zebravis Fokkerij en Ei Collecties

  1. Drie dagen voor het begin van blootstelling aan chemische stoffen, assembleren kweekbakken met verdelers om aparte mannen en vrouwen. Vul elke tank halverwege met aquacultuur systeem water. Met behulp van een net, overdragen Tg (5xERE: GFP) c262/c262 vis kweekbakken, het plaatsen van 2 reutjes en 3 teefjes in elke tank gescheiden door een scheidingswand. Leg een deksel op elke tank en label met datum en stammen worden overschreden.
  2. De volgende ochtend, verwijder alle barrières en tilt schotten tot een ondiep gebied te creëren aan de ene kant van de kweekbak. Laat zebravis om te paren, het verzamelen van embryo's in 10 min. intervallen om precies ontwikkelingsstoornissen enscenering garanderen. Clean eieren door spoelen door een theezeefje behulp E3B medium en voorzichtig spoelen embryo's in petrischalen. Terug volwassen vissen naar permanentetanks.
  3. Met behulp van een microscoop ontleden, sorteren, tellen, en verwijder eventuele onbevruchte, abnormale of beschadigde embryo's. Plaats embryo's in petrischaaltjes in E3B medium en huis bij 28,5 ° C met een 14:10 licht: donker cyclus. Embryo dichtheid kan beïnvloeden ontwikkeling. Plaats niet meer dan 100 embryo's in een 100 x 35 mm schaal en niet meer dan 50 embryo's in een 60 x 15 mm schaal.
  4. Door 24 HPF, vervang media E3B die 200 uM 1-fenyl 2-thio (PTU). PTU voorkomt pigmentvorming en houdt zebravis embryo's en larven transparant voor verbeterde beeldhelderheid. LET OP: geconcentreerde PTU voorraad is gevaarlijk; Draag handschoenen bij het maken E3B + PTU oplossing.
  5. Op 1 dag na de bevruchting (DPF), handmatig de chorion van elk embryo met behulp van fijne pincet verwijderen. De chorion lijkt geen invloed op de penetratie van oestrogenen, maar verwijdering verbetert helderheid van het beeld. Er hoeft chorions van de media te verwijderen. Opmerking: Als alternatief voor manuele dechorionation, partijen embryo kan chemisch dechorionated met 1 mg / ml pronase behandeling, zoals eerder beschreven 11.

2. Chemische behandeling van embryo's

  1. De dag vóór de behandeling, voor te bereiden voorraad oplossingen van elke chemische stof in 1000-voudige concentratie in DMSO (of geschikt oplosmiddel). Bijvoorbeeld, embryo's blootgesteld aan 10 uM bisfenol A (BPA), bereid in 10 mM BPA voorraadoplossing in 100% DMSO. Dit garandeert een gelijkmatige DMSO-concentratie in elke behandeling en kan een niet-toxisch 1:1000 verdunning van DMSO om te dienen als vehikel controle. Fokvee oplossingen bij -20 ° C. Voor dit protocol, zal embryo's worden blootgesteld aan 1 uM en 10 uM BPA, 18,5 nM en 1,85 uM genisteïne, 367 nM estradiol (positieve controle) en het voertuig (0,1% DMSO, negatieve controle).
    WAARSCHUWING: Chemicaliën zoals BPA en estradiol gevaarlijk en kan schadelijke effecten op de menselijke foetus. Handvat endocriene verstoorders met zorg en gebruik altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
  2. Op de dag van de behandeling, dooi voorbereid voorraad chemische oplossingen. Verdun 1:1000 pipetteren 1 ml E3B + PTU in een 1,5 ml microcentrifugebuis en toevoegen van 1 pl voorraad chemische oplossing. Vortex krachtig. Verdunnen DMSO 1:1.000 in E3B + PTU als een voertuig controle. Gebruik 1 ml E3B + PTE in een 1,5 ml microcentrifuge buis als onbehandelde controle.
  3. Met behulp van een grote diameter plastic overdracht pipet embryo's uit petrischaaltjes in elk putje van een 96-well plaat, 3 embryo's per well, 3 putten per conditie. Verdamping bij langdurige behandeling te voorkomen, weg te laten embryo vanuit de rijen en kolommen van de plaat (rij A en E, kolommen 1 en 12). Buitenste putjes worden gevuld met 300 ul E3B + PTU. Label de plaat deksel op de juiste wijze.
  4. Verwijder het medium uit elk putje met een fijne getipt plastic overdracht pipet. Werk snel om te voorkomen uitdroging van de embryo's.
  5. Voeg 200 ul van de behandeling oplossing in goed overeenkomt. Plaats het deksel underneath de plaat als een leidraad voor toevoeging van behandelingen zorgen in de juiste putten. Vortex elke buis voorafgaand aan het pipetteren om de stof in de oplossing te verdelen. Bevestig visueel elk embryo is in de behandeling oplossing. Als embryo's zijn aan de kant van de put, gebruik dan een schone overdracht pipet om ze te wassen in de put met de behandeling oplossing.
  6. Plaats de plaat in de incubator bij 28.5 ° C. Embryo's worden geanalyseerd op fluorescentie bij 72 hpf.

3. Automatische beeldvorming van embryo's in 96-well platen

  1. Verdoven embryo door 10 gl 4 mg / ml tricaïne aan elk putje.
    OPMERKING: Verdoven embryo's voorafgaand aan de beeldvorming. Op 24-96 HPF, zebravis vertonen spontane beweging en een schrikreactie op de veranderende lichtbron tijdens de beeldopname. Verlamming van embryo's vermindert beweging tijdens de beeldvorming.
  2. Plaats de plaat met 96 putjes in de gemotoriseerde fase en kalibreer het podium. Met behulp van Zeiss Zen Blauw 2011 software voor microscopie automatischop en controle, selecteer de optie steekproef vervoerder en selecteer multiwell 96. Selecteer kalibreren. Volg de stapsgewijze aanwijzingen om het podium te kalibreren.
    OPMERKING: vink de knop tegels na deze stap. Als de knop tegels is uitgeschakeld, kan kalibratie-instellingen verloren gaan en de 96-well plaat zal moeten worden gekalibreerd.
  3. Met behulp van een 10x objectief en de helderveld (BF) instellen, identificeren van een positieve controle embryo en de belichting instellingen adequaat voor BF en GFP-kanalen, en zorg ervoor dat fluorescentie-signaal niet de camera is het verzadigen. Focus op een enkel embryo en programmeer de microscoop om 3 totale Z-profielen, een afbeelding 50 pm boven en een 50 urn onder de huidige focal plane verwerven.
    OPMERKING: Omdat verschillende weefsels bezetten verschillende brandpunten vliegtuigen, zal dit ervoor zorgen dat voor elk zebravis beelden worden vastgelegd met het hart en de lever in focus.
  4. Stel de software parameters om een ​​betegelde beeld met behulp van GFP en BF channe verwervenls. Selecteer op het tabblad overname geavanceerde instellingen. Select tegel regio's, dan tegels. Kies de optie cirkel ook.
    OPMERKING: Tegels wordt gebruikt om een ​​samengesteld beeld van elke creëren ook. Een field-of-view betreffen slechts een klein gedeelte van elk putje. De tegels functie kan automatisch vastleggen meerdere aangrenzende velden-of-view uit elk putje, het creëren van een samengesteld beeld van het gehele goed. Het is derhalve mogelijk om automatisch vastleggen 96 samengestelde afbeeldingen per plaat, waarbij elke samengestelde beeld omvat tientallen afzonderlijke afbeeldingen in een enkel putje.
  5. Selecteer vervoerder en vul factor 90%. Een vulfactor van 90% selecteren vastlegt meervoudige afbeeldingen van de geselecteerde putjes zodanig dat 90% van het oppervlak van elk putje wordt zichtbaar in het samengestelde beeld.
    OPMERKING: Bij het selecteren vulfactor wordt een diagram weergegeven die de ruimte af te beelden. Selecteer een percentage dat onder de oppervlakte van de putdat geschikt is voor het experiment.
  6. Onder opties, selecteer de hoeveelheid overlapping gewenst.
    OPMERKING: Bij het aan elkaar plakken van tegels voor een enkel beeld vertegenwoordiger, een overlap van 5-10% zorgt voor een gladde naad tussen de beelden. Echter, als het stiksel is niet nodig, met behulp van een 0% overlap zal beeldvorming verkorten. Met behulp van 90% vulfactor en 5% overlap, een samengesteld beeld van een enkele put bestaat uit 59 afzonderlijke beelden.
  7. Start beeldvorming. De microscoop zal automatisch beelden te verwerven.
  8. Handmatig inspecteren samengestelde beelden van elk putje voor weefsel-specifieke fluorescentie (figuur 1).
  9. OPMERKING: Het is het beste om te beginnen met de positieve controle om te bevestigen dat de blootstelling aan chemische stoffen werkten voorafgaand aan het observeren experimentele behandeling putten.

4. Handmatig Fotolader van embryo's in 96-well plaat

OPMERKING: Om resultaten te bevestigen, gebruik dan een objectief 20x lange werkafstand te ackatern meer gedetailleerde beelden handmatig (figuur 2).

  1. Met behulp van een 20x objectief en de helderveld (BF) instellen, identificeren van een positieve controle embryo en stel belichtingsinstellingen voor BF en GFP-kanalen adequaat, en zorg ervoor dat fluorescentie-signaal niet de camera is het verzadigen.
  2. Identificeer de individuele embryo's en foto's maken met de hand.
    OPMERKING: Nadat de belichtingsinstellingen zijn geselecteerd voor de positieve controle embryo, de instellingen niet wijzigen. Dit maakt een vergelijking van de fluorescentie-intensiteit als elke opname wordt gemaakt onder gelijke voorwaarden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont samengestelde beelden van afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat. Elk beeld composiet bestaat uit 59 afzonderlijke foto's met 5% afbeelding overlap. Merk op dat de levende zebravis willekeurig georiënteerd zijn in elk putje, maar we kunnen onderscheiden fluorescentie in het hart van de lever. Helderveld beelden zijn bruikbaar als verwijzingen naar de zebravis oriëntatie te beoordelen en te visualiseren morfologische afwijkingen (figuren 1A en 1C). Geautomatiseerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om het beeld automatisch weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's. Het protocol is ontwikkeld met behulp van een Zeiss Axio Observer. Z1 met Zen Blue 2011-software, maar de techniek kan worden aangepast met behulp van een omgekeerde microscoop met een gemotoriseerde podium en microscoop controle software die tegels kunnen voeren maken van samengestelde afbeeldingen. Het uitrusten van een omgekeerde microscoop met een gemotoriseerde podium kan een praktische...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Susan Farmer en het personeel van de UAB zebravis onderzoeksfaciliteit voor zebravis zorg. Financiering verstrekt door start-up fondsen van de afdeling Farmacologie en Toxicologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kunststof overdrachtpipetten; groot diameterFisher13-711-23
Kunststof overdrachtpipetten; fijne puntFisher13-711-26
96-wells, rond, platte bodem platenFisher21-377-203
100 x 35 mm platenFisher08-757-100D
35 x 60 mm platenFisher08-757-100B
Dumont #5 fijne pincettenFine Science Tools11254-20punt afmetingen 0,05 x 0,01 mm, voor het handmatig verwijderen van chorions van embryo's
Tricaine methaansulfonaatSigma AldrichA5040-25Gzie Zebrafish Book voor recept (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) 
1-fenyl 2-thioureum (PTU)Sigma AldrichP7629-10GBereid 20 mM stock (100x) en gebruik bij 200 μM in E3B 
Zeiss Axio Observer Z1Carl ZeissProtocol vereist een omgekeerd fluorescerend microscoop met een gemotoriseerde stage
20x lange werkafstand objectiefCarl ZeissWe gebruiken een objectief met 0,4 NA en 8,4 mm werkafstand
Axiocam HRm digitale cameraCarl Zeiss
ZenBlue 2011 microscoop controle softwareCarl ZeissProtocol vereist microscopie automatisering en controle software om het vastleggen van betegelde beelden met behulp van een gemotoriseerde stage mogelijk te maken
Methyleen BlauwSigma AldrichMB-1; 25 grammaak 2% oplossing in RO water voor gebruik in E3B (hieronder)
E3B60X E3 OPLOSSING:
NaCl                       - 17,2 gram
KCl                       - 0,76 gram
CaCl2-2H2O      - 2,9 gram
MgSO4-7H2O  - 4,9 gram of MgSO4 - 2,39 gram
Oplossen in 1 liter Milli-Q water; bewaar in steriele 1 liter fles.

1X E3B OPLOSSING VOOR ZEBRAVIS:
60X E3      150 ml
2% methyleenblauw     100 μl 
Breng tot 9 liter met Milli-Q water
 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).
  2. Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
  3. Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
  4. Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
  5. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
  6. Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
  7. Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
  8. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
  9. Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
  10. Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
  11. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescentie imaginggemotoriseerde tafelepifluorescentiemicroscoopoestrogeenreceptor96 well plaatGFP reporterchemische screeningZ sectie imaging

Gerelateerde artikelen