In vitro celcultuurmodel voor Toxic Geïnhaleerd chemische testen

Samenvatting

Dit protocol is ontworpen om blootstelling werkwijze celculturen aan geïnhaleerd giftige chemicaliën tonen. Blootstelling van gedifferentieerde lucht-vloeistof interface (ALI) culturen van epitheelcellen biedt een uniek model van de luchtwegen blootstelling aan giftige gassen zoals chloor. In dit manuscript beschrijven we effect van chloor blootstelling aan lucht-water grensvlak kweken van epitheelcellen en ondergedompelde kweek van cardiomyocyten. In vitro blootstelling systemen kunnen belangrijke mechanistische studies routes die vervolgens kunnen worden gebruikt om nieuwe therapeutische middelen te ontwikkelen evalueren.

Samenvatting

Celculturen onmisbaar te ontwikkelen en bestuderen werkzaamheid van therapeutische middelen vóór het gebruik in diermodellen. Wij hebben de unieke mogelijkheid om het model goed gedifferentieerd menselijke luchtwegepitheel en hartspiercellen. Dit kan een waardevol instrument om de schadelijke effecten van toxische geïnhaleerde stoffen, zoals chloor, die normaal kan zijn op het celoppervlak, en vormt diverse bijproducten na reactie met water, en het beperken van hun effecten ondergedompelde culturen bestuderen. Ons model met behulp van goed gedifferentieerd menselijke luchtwegen epitheelcelkweken bij lucht-liqiuid-interface omzeilt deze beperking evenals biedt een gelegenheid om kritische mechanismen van toxiciteit van potentieel giftige ingeademde stoffen te evalueren. We beschrijven verbeterde verlies van membraan integriteit, caspase vrijlating en dood aan giftige chemische ingeademde zoals blootstelling chloor. In dit artikel hebben we methodes voorgesteld om de blootstelling chloor modelleren in zoogdiercellen hart en luchtweg epitheel cellen in cultuur en eenvoudige tests om het effect op deze celtypen te evalueren.

Inleiding

Blootstelling aan giftige geïnhaleerde stoffen (TIC) / gassen zoals chloor (Cl ₂₎ blijft een voortdurende gezondheidsprobleem in toevallige blootstelling en hun mogelijk gebruik als een chemisch agens bedreiging. Hoewel de longen zijn de primaire doelwit zijn organen zoals hart en de hersenen ook beïnvloed ^1-3. In vivo modellen worden algemeen gebruikt voor de toxiciteit van tics, maar in vitro assays voor toxiciteitsbeoordeling eenvoudiger, sneller en goedkoper. In vitro modellen laten ook uitgebreid onderzoek van middel-cel interacties die moeilijk te evalueren in vivo kunnen zijn. Dergelijke in vitro belichtingssystemen zijn zeldzaam en bovendien in sommige conventionele modellen waarin giftige stoffen worden toegevoegd aan het kweekmedium waarin de cellen ondergedompeld zijn, de eigenschappen van de agenten kunnen veranderen als gevolg van interacties en binding aan componenten in het medium. In dergelijke scenario's celkweek systemen zoals lucht-vloeistof interface (ALI) Culturen van primaire humane epitheelcellen, hier voorgesteld, die direct kunnen worden blootgesteld aan gasvormige middelen kunnen zijn veelbelovend.

Epitheelcellen van de luchtwegen zijn de eerste regels van de verdediging tegen ingeademde giftige chemicaliën. De menselijke luchtwegepitheel vormt een fysieke barrière tussen het lumen en de onderliggende cellen in de long en deelneemt aan de reactie van de long. Het produceert een aantal cytokines en andere pro-en anti-inflammatoire middelen en scheidt slijm / luchtwegen oppervlak vloeibaar (ASL) die het epitheel. Een van de beperkingen in conventionele ondergedompeld in vitro kweeksystemen is ook dat de ASL en slijm dat de epitheliale oppervlak bedekken wordt verwijderd of verdund. Dit strookt niet met de fysiologische toestand van longepitheelcellen die zijn blootgesteld aan de lucht. Daarom zou een ideaal in vitro systeem voor TIC toxiciteit deze architectuur repliceren. Er is grote belangstelling voor de ontwikkeling snelle screening methoden dat in vivo toxiciteit voorspellen. Epitheliale cellen gekweekt bij de ALI differentiëren en hebben goed gedifferentieerde structuren en functies in vergelijking met cellen gekweekt onder water en een superieur model van de luchtwegen dienen.

In deze studie beschrijven we het gebruik van lucht-vloeistof-interface van de cultuur van de menselijke luchtwegen (tracheobronchiale) epitheelcellen voor het testen van giftige inhalatie toxiciteit gas en vergelijk het met een verzonken celkweek van cardiomyocyte, vandaar studie van een ander belangrijk doelwit voor de toxiciteit.

Protocol

1. Rat Cardiomyocyte Cultures

1. Alle experimenten werden uitgevoerd onder protocollen door de institutionele Animal Care en gebruik Comite, IACUC goedgekeurd.
2. Verkrijgen hartspiercellen rat uit het hart (ventrikels) van mannelijke ratten (240-260 g) met behulp van methoden die eerder ⁴ beschreven. Kort verdoven dieren met een intraperitoneale injectie van pentobarbital (100 mg / kg; bevestigen verdoofd door teen knijpen methode) en vervolgens verwijderen harten in 10,0 ml, 1 mM ^{Ca2 +} bevattende Krebs Ringer buffer, pH 7,4.
3. Spoel de harten 5-6x om bloed te verwijderen en dan overschakelen naar een Ca ^{2 +} gratis Krebs Ringer buffer met 0,02% protease en 0,06% collagenase A (5,0 ml / hart). Incubeer de harten in deze oplossing gedurende 10-15 minuten bij 37 ° C met af en toe schudden.
4. Na 10-15 minuten, spoel dan de enzymatische oplossing met Ca ^{2 +} gratis Krebs Ringer buffer voor nog eens 5 minuten. Laat de cellen van de slappe weefsel onsing van een pipet 25 ml pipetteren de schorsing op en neer meerdere malen.
5. Scheid de cellen van weefsel door filtreren door een 70 um nylon mesh en hen in staat stellen om zich te vestigen in Krebs Ringer buffer die 0,1 mM Ca ^{2 +.} Hang de cel pellet in 1,0 ml Krebs Ringer buffer met 0,2 mM Ca ^{2 +.}
6. Layer voorzichtig over 5,0 ml 60 ug / ml runder serumalbumine, BSA, in 15 ml centrifuge buizen, om hartspiercellen te scheiden van nonmyocytes en hen in staat stellen om zich te vestigen gedurende 30 minuten. De hartspiercellen zijn zwaarder en naar de onderkant van de buis. Verwijder voorzichtig het supernatant cellen en media. Herhaal deze stap eenmaal het verder zuiveren van de cellen.
7. Geleidelijk overgang door wassen (in stappen met 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM en 1,0 mM ^{Ca2 +} bevattende buffer) de ventriculaire myocyten / hartspiercellen op 1,0 mM ^{Ca2 +} bevattende buffer en geresuspendeerd in ACCT medium bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle Medium , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-carnitine, 5 mM creatine, 5 mM taurine, 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine.
8. Plate de cardiomyocyten als ACCT medium bij een dichtheid van 100 tot 150 cellen / mm ² op 100 mm of 35 mm laminine beklede plastic kweekplaten of 40 x 22 mm glazen dekglaasjes tevoren met laminine (1 ug / cm ^2). Na 1 uur werd de vaat met 2,0 ml ACCT cellen die niet zijn aangesloten verwijderen. Voeg 10,0 ml vers medium en incubeer de cellen.

2. Gedifferentieerde Air-vloeistof interface (ALI) cultuur van de mens luchtwegepitheelcellen basale cellen

1. Procure menselijke tracheobronchiale weefsels van National Disease Research Interchange onder Institutional Review Board goedgekeurde protocollen. Celoogst en het uitvoeren van cultuur met behulp van een gepubliceerde procedure ^5,6. Deze procedure maakt gebruik celculturen omdat ze een nauwkeurig model voor humane inhalatie blootstelling tics echter, indien nodig kan isoleren en groeien ALI mogebruik en / of ratten epitheelcellen ^7,8.
2. In het kort, maak kleine stukjes (~ ¼ inch) van het weefsel na het verwijderen van alle bindweefsel en de lymfeklieren. Was weefsel meerdere malen in Ringerlactaat. Weefsels In een 50 ml conische buis en voeg protease-oplossing (1% Protease/0.01% DNase in minimaal essentieel medium, MEM, weefsel vloeistof verhouding (01:10)).
3. Rock the weefsel bij 4 ° C voor de overnachting. Beëindig de dissociatie van het weefsel door toevoeging van 10% foetaal runderserum. Schraap het epitheliale oppervlak met een chirurgisch scalpel en verzamel de cellen door centrifugeren (2000 rpm gedurende 10 min).
4. Plaat cellen bij passage een op collageen gecoate snapwells in bijzondere ALI medium bereid zoals beschreven door Fulcher et al. ^9. Cultuur voor 5 dagen voordat u aan de lucht-vloeistof interface (ALI) door het verwijderen van apicale media.
5. Voer de cellen met ALI media om de andere dag en laat de cellen differentiëren extra 2-3 weken (observeren tal kloppend cilia en slijm afscheiding) voor het uitvoeren van blootstelling. Was de apicale oppervlak met warm PBS samen met media veranderingen.

3. Chloor Exposure

1. Bevatten de belichting chloor systeem (CES) in een gekwalificeerde chemische kap met een operationele gezicht snelheid van 100 fpm dat de noodzakelijke secundaire maatregelen om blootstelling van het personeel in geval van accidentele chloor lekkage te voorkomen biedt.
2. Gebruik het systeem onder lichte overdruk (0,5 inch water). Droge lucht wordt toegevoerd bij 15 L / min en een passend chloor wordt toegevoerd aan de gewenste uiteindelijke chloorconcentratie bereiken. De kamers hebben een deksel met vergrendeling met 4 mini BCU sloten en een lage hardheid siliconen pakking om de druk afdichting.
3. Lever de Cl ₂ mengsel door een Mass Flow Controller. De CES maakt gebruik van een cilinder met samengeperst gas dat 1,0% Cl ₂ in droge stikstof.
4. Regel de verdunning luchtstroom met behulp van deop maat ontworpen bedieningspaneel en evenzo regelen de Cl _{2-concentratie} geleverd aan de expositiekamers. Een laag volume bemonsteringspomp trekt de uitlaatgassen van de kamers in een chloor analyzer aan concentraties die vervolgens worden opgenomen op een datalogger aangesloten op de analysator te controleren.
5. Meet de debieten in de kamers voorafgaand aan blootstelling met behulp van een flowmeter op gelijke levering en afzuigdebieten verzekeren.
6. Bereid de celculturen voor de belichting door het verwijderen van het supernatant media en het toevoegen van verse media (basolaterale media in ALI culturen). Eventuele voorbehandelingen met middelen kan worden uitgevoerd op dit moment.
7. Expose de ALI culturen van epitheelcellen tot Cl _2-gas (50, 100 of 300 ppm gedurende 30 minuten) in de twee verzegelde polysulfon biocontainment kamers. De cardiomyocyten (water of confluente kweken op membranen) worden blootgesteld aan 50 of 100 ppm Cl ₂ gedurende 15 minuten.
8. Na blootstelling spoelen de kamers met lucht totdat de Cl _2-niveau onder 1 ppm en veilig kan worden geopend om cellen te verwijderen (binnen 5 min).

4. Transepitheliaal Elektrische weerstand (TER) Meting

1. Meet de TER van lucht-vloeistof-interface, ALI, culturen met behulp van een epitheliale voltohmmeter met een paar zilveren chloride "eetstokje" elektroden.
2. Equilibreer het eetstokje elektrode in de ALI media 15 min. voor gebruik.
3. Voeg warm media om het apicale (1,0 ml) en basolaterale (2,0 ml) oppervlak en meet de TER met de chopstick elektroden van de voltohmmeter.
4. Dompel de kortere arm van de elektrode in apicale media en de langste arm in de basolaterale media. Klik op de 'maatregel' knop op de voltohmmeter om de elektrische weerstand te evalueren.
5. De voltohmmeter heeft de optie om ohm of k ohm meten. Trek de weerstand over een celvrije kweek steun van de weerstand gemeten over elke cellaag aan de trans opbrengstepitheliale weerstand (TER).

5. Caspase Meting

1. Voeg vers ALI medium (2,0 ml) aan het basolaterale oppervlak na blootstelling en incubeer de cellen bij kamertemperatuur. Verzamel supernatant media op 4 en 24 uur.
2. Maatregel caspase 3/7 activiteit in de media supernatanten met een commercieel caspase 3/7 testkit.

6. Western Blot en Immunocytochemie

1. Voer western blots met cellysaten zoals eerder beschreven ^10. Hang het eiwit lysaat (20 ug) in 5x gereduceerd monster buffer en kook gedurende 5 minuten. Onderwerp het eiwit lysaat aan SDS-PAGE (4-15%) en breng de gescheiden eiwitten naar een nitrocellulosemembraan door elektroforetische blotting.
2. Blokkeer niet-specifieke binding door het incuberen van het membraan met 5% melk in wasbuffer (PBS + 0,1% detergens) en sonde de membranen met primaire antilichamen tegen SERCA2 of sarcomeer actine bij 1:1000 verdunning, overnacht bij 4 ° C. Vervolgens wassen en incubeer membranen de respectieve peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en ontwikkelen van detectie zoals eerder beschreven ¹⁰ met commerciële peroxidase detectiekit.
3. Voor immunocytochemie behandelen levende cellen gekweekt op inzetstukken of dekglaasjes in 6-well platen met 0,4% Triton-X-100 in 10 mM natrium citraat buffer gedurende 20 minuten na het spoelen met PBS.
4. Blok specifieke binding door behandeling van de cellen met 5% ezel serum gedurende 20 min en vervolgens incuberen van de cellen met niet-specifiek IgG of specifiek sarcomeer actine of Ki-67 afzonderlijke primaire antilichamen.
5. Was de cellen met PBS en geïncubeerd met fluorescent-geconjugeerde secundaire antilichamen tegen het primaire antilichaam en een nucleaire kleuring (1 ug / ml DAPI) detecteren.
6. Wassen met PBS en monteer coverslips met behulp van commerciële montage media.
7. Visualiseer de kleuring met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Resultaten

Primaire staafvormige hartspiercellen bevestigen op laminin matrices en verspreiden en differentiëren tot samenvloeiing culturen (Figuur 1A en haar inzet). Deze cellen werden verder gekarakteriseerd op basis van sarcomeer actine en SERCA2 expressie (Figuren 1B en 1C). Rat cardiomyocyten zijn zeer gevoelig voor toxiciteit chloor 15 minuten blootstelling aan 100 ppm chloor veroorzaakt uitgebreide celronding en dood submerse cultuur en verstoring van confluente lagen op ce...

Discussie

De meest voorkomende vorm van acute blootstelling aan gifstoffen ontstaat wanneer men ademt een giftige chemische stof in de longen. Deze chemicaliën kunnen ook snel worden opgenomen in de bloedbaan en invloed kan andere organen zoals hersenen en het hart. Giftigheid bij inademen van diverse agenten met behulp van diermodellen worden bestudeerd en op grote schaal gemeld, maar de mechanismen zijn minder goed begrepen. Dit is een belangrijke hindernis in de ontwikkeling van effectieve therapieën. Afwezigheid van in vi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epitheliaal voltohmmeter en chopstick elektrode	World Precision Instruments	EVOM en STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon celstrainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment kamers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomere actin antilichaam	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antilichaam	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antilichaam	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-geconjugeerd secundair antilichaam	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer oplossing	Abott Laboratories	7953
Ezelserum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, fosfaat gebufferde zoutoplossing	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membraan	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detectiekit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Montage media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Natriumcitraat	Sigma-Aldrich	71497
Collageen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminine	BD biosciences	354259
Penicilline/streptomycine	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ