Lineaire versterking Mediated PCR - Lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van Onbekende flankerend DNA

Summary

Lineaire amplificatie-gemedieerde (LAM)-PCR is een methode ontwikkeld om de exacte positie van integratie virale vectoren in het genoom te identificeren. De techniek heeft zich ontwikkeld tot de superieure methode om klonale dynamiek in gentherapie patiënten, bioveiligheid van nieuwe vector technologieën, diversiteit T-cel, kanker stamcellen modellen, enz. te bestuderen

Abstract

Lineaire-amplificatie gemedieerde PCR (LAM-PCR) is ontwikkeld om hematopoëse te bestuderen in gengecorrigeerde cellen van patiënten die behandeld zijn met gentherapie met integrerende vectorsystemen. Vanwege de stabiele integratie van retrovirale vectoren, kunnen integratieplaatsen worden gebruikt om het clonale lot van individuele cellen en hun nakomelingen te bestuderen. LAM-PCR leverde voor het eerst bewijs dat leukemie bij patiënten die met gentherapie zijn behandeld, ontstond door provirus geïnduceerde overexpressie van een naburig proto-oncogen. De hoge gevoeligheid en specificiteit van LAM-PCR vergeleken met bestaande methoden zoals inverse PCR en ligatie-gemedieerde (LM)-PCR wordt bereikt door een initiële pre-amplificatiestap (lineaire PCR van 100 cycli) met behulp van biotinylerde vectorspecifieke primers die toekomstige reactiestappen mogelijk maken op vaste fase (magnetische kralen). LAM-PCR is momenteel de meest gevoelige methode die beschikbaar is om onbekend DNA te identificeren dat zich in de nabijheid van bekend DNA bevindt. Onlangs is een variant van LAM-PCR ontwikkeld die restrictiedigestie omzeilt, waardoor de ophaalbias van integratieplaatsen wordt afgeschaft en een uitgebreide analyse van proviruslocaties in gastheergenomen mogelijk wordt. Het volgende protocol legt stap voor stap uit hoe beide 3’- en 5’-sequenties aangrenzend aan de geïntegreerde lentivirale vector worden geamplificeerd.

Introduction

Lineaire amplificatie-gemedieerde PCR (LAM-PCR) kan identificeren en karakteriseren onbekende flankerende DNA grenzend aan bekende DNA van elke oorsprong. Meer specifiek heeft LAM-PCR ontwikkeld om virale vector integratielocaties lokaliseren (IS) binnen het gastheergenoom ^1,2. Genetische elementen zoals retrovirussen of transposons integreren hun genoom in het genoom van de gastheer in een (semi-) willekeurige wijze ^3-6. In veel gevallen is beslissend precies de positie waar deze vectoren geïntegreerd kennen. LAM-PCR is bewezen superieur aan andere technieken zoals ligatie-gemedieerde PCR ⁷ en varianten of inverse PCR ⁸ zijn. De gevoeligheid en robuustheid van deze werkwijze ontstaat omdat de eerste voorversterking van het vector-genoom kruispunten en magnetische selectie van geamplificeerde PCR producten. Zoals de alternatieve methoden vermeld, LAM-PCR is gebaseerd op het gebruik van restrictie-enzymen, een voorspanning introduceren in het ophalen aantal IS ^9-11. Aldusslechts een subset van de IS repertoire (de integrome) kan worden gedetecteerd in een reactie. Deze voorspanning wordt geminimaliseerd door de parallelle analyse van een monster met behulp van optimale combinaties van restrictie-enzymen ^9. Onlangs, een variant van de technologie genoemd niet-beperkende LAM-PCR (nrLAM-PCR) ontwikkeld dat het gebruik van restrictie-enzymen omzeilt en maakt onpartijdige genoom-brede analyse van een monster in een enkele reactie ^9,12.

In het verleden, is LAM-PCR gebruikt om identificatie van de veroorzakende retrovirale geeft aanleiding tot leukemie bij enkele patiënten in klinische proeven voor gentherapie ^13-15. Sindsdien is LAM-PCR aangepast identificeren IS van andere integrerende vectoren (lentivirale vectoren, transposons) en ook integratiepatronen passief integrerende vectoren zoals adeno-geassocieerde vectoren (AAV) of integrase-defecte lentivirale vectoren (IDLV) identificeren ^{16 -21.} Toepassingen van LAM-PCR zijn wijd verspreid: traditionelely, de techniek wordt veel gebruikt om de klonale samenstelling van genetisch gemodificeerde cellen te bestuderen bij patiënten die gentherapie hebben ondergaan of om de bioveiligheid van nieuwe vector systemen te beoordelen door het ontrafelen van hun integratie gedrag ^15,16,22-24. Onlangs, LAM-PCR ingeschakeld bepalen specificiteit en off-target activiteit van designer nucleases door een IDLV vangen test ^25.

Bovendien LAM-PCR laat toe om gemakkelijk volgen het lot van een getransduceerde cel na verloop van tijd in een organisme. Dit maakt proto-oncogenen en tumorsuppressor genen en om hematopoiese of kanker stamcel biologie ^26-28 bestuderen. Tenslotte, LAM-PCR aangepast aan T-cel receptor diversiteit studie in mensen ²⁹ (en ongepubliceerde gegevens).

De intrinsieke kracht van de technologie wordt nog versterkt door het koppelen van de methode om diepe sequencing technologieën die het mogelijk maken het karakteriseren miljoenen onbekende flankerende DNA met single nucleotide rRESOLUTIE geheel genomen. In het volgende protocol beschrijven we stap voor stap de versterking en de identificatie van flankerende onbekende DNA voorbeeldig te identificeren lentivirale vector IS. Oligonucleotiden die in het protocol zijn opgesomd in tabel 1. Geëxtraheerde DNA of cDNA van elke bron kan worden gebruikt als DNA-matrijs voor LAM-PCR en nrLAM-PCR.

Protocol

1. Bereiding van Linker Cassettes (LC)

1. Meng 40 pl LC1 oligonucleotide (tabel 1), 40 pl LC2 oligonucleotide (tabel 1, met de juiste restrictie-enzym overhang), 110 pl Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) en 10 pi 250 mM _MgCl2.
2. Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten en laat het reactiemengsel langzaam afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 300 ul _H2O en concentreer dsLinker-DNA op een centrifugatie filter. Voeg 80 ui _H2O het eluaat en 10 pi aliquot van bereide linker cassette 0,2 PCR buizen.

2. Preamplification van Vector Genome Knooppunten

1. Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie.
   1. Bepaal de concentratie van de DNA-monsters. Pipet x pi (1-1,000 ng voor LAM/100-1, 000 ng voor nrLAM) van DNA in een 0,2 ml PCR-buis. Volume van DNA moet gelijk zijn in elk monster en in de liep zijnge van 0,5 tot 25 ul.
   2. Bereid PCR master mix zoals beschreven in Tabel 2 Mix (50 - x). Ul van de master mix met elk DNA-monster in 0,2 ml PCR-buisjes.
2. Preamplify vector genoom juncties middels PCR-omstandigheden toegelicht in Tabel 2. Na voltooiing van PCR wordt 0,5 ul Taq Polymerase aan elke PCR buis en herhaling PCR-programma. PCR producten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C.

3. Magnetische scheiding van PCR Product

1. Bereiding van Magnetic Beads
   1. Pipetteer 20 ul (200 ug) van streptavidine beklede magnetische kralen in een 1,5 ml buis en blootgesteld gedurende 1 minuut op de magnetische deeltjesscheider (MPS) bij kamertemperatuur. Gooi supernatant.
   2. Verwijder buis MPS en resuspendeer magnetische kralen in 40 ul PSB / 0,1% BSA (pH 7,5). Blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Herhaal eenmaal deze stap.
   3. Wassen kralen wie 20 pl 3 M LiCl oplossing (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) bloot aan MPS gedurende 1 min en gooi supernatant. Resuspendeer kralen in 50 gl 6 M LiCl oplossing (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
2. Meng gehele PCR-reactie van stap 2.2 met 50 ul van vervaardigde magnetische kralen. Incubeer op een horizontaal schudapparaat (300 rpm) ten minste 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Deze stap maakt binding van gebiotinyleerd PCR-product beklede parels (DNA-Bead complex) streptavidine. DNA parelcomplex kan worden overnacht geïncubeerd op het schudapparaat of opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen.
3. Expose DNA-Bead complex MPS gedurende 1 min bij kamertemperatuur verwijderd supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 100 pi _H2O Onmiddellijk verder met stap 4 voor LAM of stap 5 voor nrLAM.

4. LAM-Procedure

1. Dubbele streng DNA (dsDNA) Synthese (LAM alleen)
   1. Expose DNA-Bead complex van stap 3.3 tot MPS gedurende 1 minuut en diskaart supernatant. Voeg 8,25 ui _H2O, 1 pl 10x hexa-buffer, 0,25 pl dNTPs (10 mM) en 0,5 pl (2 U) Klenow polymerase. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
   2. Voeg 90 ui _H2O en blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut. Gooi supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 100 ul H ₂ O.
2. Beperking Digest
   1. Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Voeg 8,5 ul _H2O, 1 pi 10x restrictie-enzym buffer en 0,5 ul van restrictie-enzym en incubeer reactie gedurende 1 uur. Herhaal stap 4.1.2.
      OPMERKING: Incubeer reactie bij de temperatuur door de fabrikant van het restrictie-enzym. Zorg ervoor dat er geen beperking plaats aanwezig binnen of stroomafwaarts van de primer bindingsplaats voor voorversterking in het DNA van belang. Voor de keuze van geschikte restrictie-enzymen / restrictie-enzym combinaties verwijzen naar ^9.
3. Ligatie van ds Linker (LK)
   1. Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Voeg 5 ul H ₂ O, 1 ui 10x FastLink buffer, 1 ui ATP (10 mM), 2 pi Linker cassette uit stap 1.2, en 1 ui Fast-Link DNA ligase (2 U / pl). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Herhaal stap 4.1.2.
4. Denaturatie van Gesynthetiseerde dsDNA
   1. Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Resuspendeer DNA-Bead complex in 5 pi 0,1 N NaOH. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur op een horizontale schudinrichting.
   2. Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en verzamel voorversterkte vector-genoom knooppunt bevattende supernatant in nieuwe 1,5 ml buis. Onmiddellijk verder met stap 6 of winkel supernatant bij -20 ° C.

5. NrLAM-Procedure

1. Ligatie van enkelstrengs linker (SSLC) (nrLAM alleen)
   1. Expose DNA-Bead complex van stap 3.3 tot MPSgedurende 1 minuut en gooi supernatant. Voeg 6,5 ul _H2O, 1 pi 10x CircLigase Reaction Buffer, 0,5 pl _MnCl2 (50 mM), 0,5 ui ATP (1 mM), 1 ui ssLinker oligonucleotide en 0,5 pl CircLigase (100 U / pl). Incubeer bij 60 ° C gedurende 1 uur.
   2. Voeg 90 ui _H2O en blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut. Verwijder supernatant en was DNA-Bead complex in 100 pi _H2O Opnieuw blootstellen aan MPS 1 min, gooi supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 10 ui _H2O

6. Exponentiële Amplification I

1. Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie.
   1. Pipetteer 2 pi template DNA (uit stap 4.4.2 (LAM) of 5.1.2 (nrLAM)) in een 0,2 ml PCR-buis.
   2. Bereid PCR master mix zoals beschreven in Tabel 3. Voeg 48 ul van master mix aan elk monster uit stap 6.1.1 en versterken vector genoom kruispunten door PCR conditions geïllustreerd in Tabel 3. PCR producten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C.

7. Magnetische scheiding van PCR Product

1. Bereid magnetische korrels zoals toegelicht in stap 3.1.1 - 3.1.3. Resuspendeer kralen in 20 pl (voor LAM) en 50 pl (voor nrLAM) van 6 M LiCl oplossing (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Meng 20 pl (LAM) en 50 pl (nrLAM) PCR-reactie uit stap 6.1.2 met vervaardigde magnetische beads (stap 7.1) en incubeer op een horizontaal schudapparaat (300 rpm) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. DNA parelcomplex kan worden overnacht geïncubeerd op het schudapparaat of opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen.
2. Expose DNA-Bead complex MPS gedurende 1 min, verwijder supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 100 pi _H2O Expose DNA-Bead complex om MPS gedurende 1 minuut en gooi supernatant.
3. Resuspendeer DNA-Bead complex in 20 pi (LAM) of 5 pl (nrLAM) 0,1 N NaOH. Incuverminder gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een horizontaal schudapparaat, blootstellen aan MPS gedurende 1 minuut en laat geamplificeerd DNA supernatant nieuwe 1,5 ml buisje. Onmiddellijk verder met stap 8.1 of winkel supernatant bij -20 ° C.

8. Exponentiële Amplification II

1. Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie.
   1. Pipetteer 2 pl matrijs-DNA (uit stap 7.3) in een 0,2 ml PCR buis.
   2. Bereid PCR master mix zoals beschreven in Tabel 4. Voeg 48 ul van master mix aan elk monster uit stap 8.1.1 en versterken vector genoom splitsingen PCR-omstandigheden toegelicht in Tabel 4. PCR producten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C.
2. Visualiseren (nr) LAM-PCR-producten, belasting 10 ul van het PCR-product uit stap 8.1.2 op een 2% agarosegel. Als banden zijn zichtbaar, analyseren 10 ul van de LAM-PCR-product op hoge-resolutie gel. LET OP: Ethidium bromide is mutageen. Werken zeer zorgvuldig en altijd de juiste handschoenen te dragen.

9. Voorbereiding voor high-throughput sequencing

1. Zuivering van (nr) LAM-PCR-producten
   1. Meng 40 pi PCR-product van stap 8.1.2 met 44 ul van kamertemperatuur AMPure XP Magnetic Beads. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur en bloot MPS extra 2 minuten.
   2. Het supernatans en tweemaal wassen met 200 ul 70% EtOH het MPS.
   3. Gooi supernatant en resuspendeer DNA-Bead complex in 30 pi H ₂ O. Incubeer 1 min en overdracht supernatant in de frisse 0,2 ml buis. Bepaal de concentratie van gezuiverd DNA.
2. Fusionprimer PCR om sequencing specifieke adapters toevoegen.
   1. Voor elke te analyseren monster bereid een 50 ul PCR reactie.
   2. Pipet x pi (40 ng) van DNA in een 0,2 ml PCR-buis. Omvang van DNA moet gelijk in elk monster en in het traject van 0,5 tot 25 pi zijn.
   3. Bereid PCR master mix zoals beschreven in tabel 5 plaatsen (50 - x). Gl master mix aan elk monster uit stap 9.2.2 sequentiebepaling adapters introduceren (nr) LAM-PCR producten van PCR-omstandigheden toegelicht in tabel 5 PCR producten. kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 4 dagen of lange termijn bij -20 ° C.
   4. Om Fusionprimer-PCR producten load visualiseren 10 ul van het PCR-product uit stap 9.2.3 op een 2% agarosegel. Zuiver resterende PCR-product zoals beschreven in stap 9.1.1 - 9.1.3. Analyseer 1 ui gezuiverd PCR product uit stap 9.4 op een geautomatiseerde high-resolution elektroforeseapparaat exact te kwantificeren concentratie en fragment grootte van Fusionprimer-PCR-producten.

Results

LAM-PCR resulteert in amplificatie van vector genoom kruispunten met een bepaald fragment grootte voor elke kruising. De afzonderlijke PCR-fragmenten afhankelijk van de afstand tussen de locatie van de bekende DNA in het genoom en de dichtstbijzijnde restrictie-enzym herkenningsplaats. Dit maakt het visualiseren van de diversiteit van geamplificeerde verbindingen in monsters geanalyseerd door gelelektroforese zoals. Als eenmalig (monoklonale), verscheidene (oligoclonale), of meervoudige (polyklonale) groepen aa...

Discussion

Het LAM-PCR-techniek maakt het identificeren van onbekende DNA-sequenties die een bekende DNA regio flankeren. Vanwege de hoge gevoeligheid gevolg van voorversterking van de verbindingen met specifieke primers hybridiseren bij de bekende DNA-sequentie, is het mogelijk amplificeren en detecteren zelfs zeldzame verbindingen naar de enkele cel. Integendeel, een polyklonaal situatie LAM-PCR kan duizenden verschillende knooppunten amplificeren in een enkele reactie.

Echter, door het gebruik van r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA Polymerase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Alternatieve Taq-polymerasen kunnen worden gebruikt
PCR Buffer	Qiagen	201203	Gebruik van deze buffer wordt aanbevolen
dNTP-Mengsel	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	of enige andere dNTP's
Oligonucleotiden (Primers)	MWG Biotech		HPLC-gezuiverd
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0,1% wt/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7,5	USB Corporation	22637	of enige andere leverancier
EDTA	Applichem	A1103,0250	of enige andere leverancier
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Hexanucleotide mengsel	Roche Diagnostics	11277081001
Restrictieneuklease	NEB		of enige andere leverancier
Fast-Link DNA ligatiekit	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	of enige andere leverancier
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	of enige andere leverancier
TBE buffer	Amresco	0658	of enige andere leverancier
Ethidiumbromide	Applichem	A2273,0005	Ethidiumbromide is mutageen
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	of enige andere DNA ladder
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	of enige andere leverancier
Magna-Sep Magnetische Deeltjes Separator	Life Technologies	K158501	voor gebruik met 1,5 ml buisjes
Magna-Sep Magnetische Deeltjes Separator	Life Technologies	K158696	voor gebruik met 96-well platen
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membraan	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	of ander elektroforese systeem
TProfessional 96	Biometra	050-551	of andere Thermocycler voor 96-well platen
Orbital shaker KS 260 basic	IKA	2980200	of andere horizontale shaker
PCR softtubes 0,2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	of andere 0,2 ml PCR-buisjes
1,5 ml buisjes	Eppendorf	12682	of andere 1,5 ml buisjes
Gel documentatie systeem	PeqLab		of enige andere gel documentatie systeem
Nanodrop ND-1000 spectrofotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 voorgevormd gel	Elchrom Scientific	3497
Gesubmergeerde gelelektroforese apparaat SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA