Lineaire versterking Mediated PCR - Lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van Onbekende flankerend DNA

Summary

Lineaire amplificatie-gemedieerde (LAM)-PCR is een methode ontwikkeld om de exacte positie van integratie virale vectoren in het genoom te identificeren. De techniek heeft zich ontwikkeld tot de superieure methode om klonale dynamiek in gentherapie patiënten, bioveiligheid van nieuwe vector technologieën, diversiteit T-cel, kanker stamcellen modellen, enz. te bestuderen

Abstract

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Introduction

Lineaire amplificatie-gemedieerde PCR (LAM-PCR) kan identificeren en karakteriseren onbekende flankerende DNA grenzend aan bekende DNA van elke oorsprong. Meer specifiek heeft LAM-PCR ontwikkeld om virale vector integratielocaties lokaliseren (IS) binnen het gastheergenoom ^1,2. Genetische elementen zoals retrovirussen of transposons integreren hun genoom in het genoom van de gastheer in een (semi-) willekeurige wijze ^3-6. In veel gevallen is beslissend precies de positie waar deze vectoren geïntegreerd kennen. LAM-PCR is bewezen superieur aan andere technieken zoals ligatie-gemedieerde PCR ⁷ en varianten of inverse PCR ⁸ zi....

Protocol

1. Bereiding van Linker Cassettes (LC)

1. Meng 40 pl LC1 oligonucleotide (tabel 1), 40 pl LC2 oligonucleotide (tabel 1, met de juiste restrictie-enzym overhang), 110 pl Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) en 10 pi 250 mM _MgCl2.
2. Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten en laat het reactiemengsel langzaam afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 300 ul _H2O en concentreer dsLinker-DNA op een centrifugatie filter. Voeg 80 ui _H2O het eluaat en 10 pi aliquot van bereide linker cassette 0,2 PCR buizen.

2. Preamplification van Vector Genome Knooppunten

1. Voor elke....

Results

LAM-PCR resulteert in amplificatie van vector genoom kruispunten met een bepaald fragment grootte voor elke kruising. De afzonderlijke PCR-fragmenten afhankelijk van de afstand tussen de locatie van de bekende DNA in het genoom en de dichtstbijzijnde restrictie-enzym herkenningsplaats. Dit maakt het visualiseren van de diversiteit van geamplificeerde verbindingen in monsters geanalyseerd door gelelektroforese zoals. Als eenmalig (monoklonale), verscheidene (oligoclonale), of meervoudige (polyklonale) groepen aa.......

Discussion

Het LAM-PCR-techniek maakt het identificeren van onbekende DNA-sequenties die een bekende DNA regio flankeren. Vanwege de hoge gevoeligheid gevolg van voorversterking van de verbindingen met specifieke primers hybridiseren bij de bekende DNA-sequentie, is het mogelijk amplificeren en detecteren zelfs zeldzame verbindingen naar de enkele cel. Integendeel, een polyklonaal situatie LAM-PCR kan duizenden verschillende knooppunten amplificeren in een enkele reactie.

Echter, door het gebruik van r.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA Polymerase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Alternative Taq Polymerases may be used
PCR Buffer	Qiagen	201203	Use of this buffer is recommended
dNTP-Mixture	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	or any other dNTPs
Oligonucleotides (Primers)	MWG Biotech		HPLC purified
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0.1% wt/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5	USB Corporation	22637	or any other supplier
EDTA	Applichem	A1103,0250	or any other supplier
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Hexanucleotide mixture	Roche Diagnostics	11277081001
Restriction endonuclease	NEB		or any other supplier
Fast-Link DNA ligation kit	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	or any other supplier
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	or any other supplier
TBE buffer	Amresco	0658	or any other supplier
Ethidium bromide	Applichem	A2273,0005	Ethidium bromide is mutagenic
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	or any other DNA ladder
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	or any other supplier
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158501	for use with 1.5 ml Tubes
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158696	for use with 96-well plates
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	or other electrophoresis system
TProfessional 96	Biometra	050-551	or other Thermocycler for 96-well plates
Orbital shaker KS 260 basic	IKA	2980200	or other horizontal shaker
PCR softtubes 0.2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	or other 0.2 ml PCR tubes
1.5 ml tubes	Eppendorf	12682	or other 1.5 ml tubes
Gel documentation system	PeqLab		or any other gel documentation system
Nanodrop ND-1000 spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 precast gel	Elchrom Scientific	3497
Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA