Methodenartikel

Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL)

12.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51549

⸱

23 mei 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur

In dit artikel

Samenvatting

Het uitbreiden van de stichting en de toepasbaarheid van fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) door inventarisatie van de relevante beginselen en demonstreren van de verenigbaarheid ervan met een veelheid aan fluoroforen en antilichaam-gerichte voorwaarden.

Samenvatting

Fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) is een stralings excitatie-emissie proces dat verhoogde signaal en contrast verbetering produceert in vitro en in vivo. BRANDSTOF deelt veel van dezelfde uitgangspunten als Bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET), maar sterk verschilt aanvaardbare werkafstand tussen de luminescerende bron en de fluorescerende entiteit. Terwijl BRET effectief beperkt tot maximaal 2 maal de straal Förster, gewoonlijk minder dan 14 nm, kan FUEL optreden bij afstanden tot um of zelfs cm bij ontbreken van een optisch absorptiemiddel. Op het fundament en de toepasbaarheid van FUEL hier breiden we door de herziening van de relevante beginselen achter het fenomeen en demonstreren de compatibiliteit met een breed scala aan fluoroforen en fluorescerende nanodeeltjes. Verder is het nut van antilichaam gerichte FUEL onderzocht. De hier getoonde voorbeelden tonen aan dat brandstof kan worden gebruikt voor applnicatieorganisatie waar BRET niet mogelijk is, het vullen van de ruimtelijke leegte die bestaat tussen BRET en traditionele hele dier beeldvorming.

Inleiding

De genetische modificatie van organismen, zoals virussen 1, 2, 3 bacteriën of kleine zoogdieren 4 ofwel induceren of constitutief bioluminescentie, zeer succesvol en breed aangetoond 5-7. Bioluminescentie is een in vivo chemiluminescente reacties met natuurlijk voorkomende reagentia, heeft het voordeel om licht te produceren zonder de noodzaak van een externe lichtbron. Als zodanig is bioluminescentie beeldvorming geen last van de gemeenschappelijke nadelen van auto-en niet-specifiek signaal gevonden van fluorescentie beeldvorming 8. Bijgevolg bioluminescentie een belangrijke signaal-ruisverhouding aangezien elke gedetecteerde signaal uitsluitend afkomstig van de beoogde bron. Hoewel veel modellen de lux operon van Photorhabdus luminescens (emissiemaximum gecentreerd tussen 480 en 490 nm) in vitro en in vivo toepassingen 9 uitgebuit, zijn gebruik in kleine MammALS is problematisch vanwege de aard van de beeldvorming voorwaarden; de doordringende bestaan ​​van optische absorptiemiddelen, zoals hemoglobine en verstrooiing middelen, zoals weefsel en bot, sterk beïnvloeden blauw naar geel golflengten 3. De expressie van een aangelegde vuurvliegluciferase (maximale emissie bij 617nm) is recent ontwikkeld en opgenomen, het verstrekken van een hulpmiddel dat sterk overwint optische absorptie 10, maar is nog steeds onderworpen aan verstrooiingseffecten.

In reactie daarop zijn er meerdere pogingen tot rood-verschuiving van het uitgezonden signaal in de gewenste optische raam van 650-900 nm, een regio geminimaliseerd absorptie en verstrooiing, met behulp van bioluminescentie resonantie energie-overdracht (BRET) 11-13 geweest. Als een instrument om signaaldetectie verbeteren, BRET, die een bioluminescerend bron gebruikt als de donor en een toegevoegde fluorofoor als de acceptor, heeft gevonden beperkt succes. Als een rudimentaire voorbeeld van dit fenomeen, "self-lichtdoorlatende quantum dots4, (SIQDs) 14 bestaan ​​uit gemodificeerde Renilla reniformis luciferasen gebonden aan het uitwendige polymeer-lysine layer van commercieel beschikbare quantum dots (QD). Na substraat Bovendien moeten de bioluminescente reactie induceert-emissie van de QDs, genereren een aanzienlijke productie van rode fotonen. Echter, deze SIQDs toepasbaarheid beperkt tot in vivo visualisatie van fysiologisch relevante gebeurtenissen. Deze beperkte toepasbaarheid waarschijnlijk vanwege de moeilijkheid die de dubbele sonde naar het orgaan, cel of gen van belang, aangezien de SIQDs niet genetisch gecodeerd kunnen worden en daarom zou een tweede wijziging van de polymeermantel vereist. De toepassing ervan beter, alternatief SIQDs, waarbij de luciferasen rechtstreeks zijn gebonden aan de luminescerende kern, zijn onlangs toegepast 15. Voortbouwend op de SIQD concept werd een meer toepasselijke BRET systeem bereikt door het aanbrengen van Cypridina luciferase een indocyanine kleurstof 16, die specifiek kunnen richten op tumoren in muizen terwijl de productie een aanzienlijke roodverschuiving van 460 nm tot 675 nm. Om niet-stralende energieoverdracht ondergaan, BRET volgt dezelfde primaire beperkingen als de tl-tegenhanger: er moet een sterke spectrale overlap tussen de donor emissie en de acceptor excitatiespectra en de werkafstand tussen de twee groepen zijn, moeten in de orde van de Förster radius (5-14 nm afhankelijk van de donor-acceptor paren, met een effectieve maximale afstand tweemaal de Förster radius 17). Deze afstand afhankelijkheid sterk beperkt de typen gebeurtenissen die kunnen worden waargenomen met behulp BRET als middel om detectie te verbeteren.

Onlangs werd een nieuwe benadering geïdentificeerd en aangetoond onder zowel in vitro als in vivo omstandigheden. Voortbouwend op het fundament van BRET, Fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) 18, 19 vereist ook een sterke spectrale overlap tussen de luminescerende en fluorescerende componenten. In tegenstelling BRET, FUEL is een volledig radiatieve proces waarbij het uitgezonden foton uit het luminescerende bron wordt geabsorbeerd door een optisch toegankelijke fluorofoor, die vervolgens zendt een rood-verschoven foton volgens de fluorofoor quantum opbrengst. Verwant aan BRET Deze benadering kan ook worden gebruikt om de beperkingen van beeldvorming in aanwezigheid van optisch absorberende overwinnen. De verkregen rode verschuiving geeft een algemene toename en specificiteit van het gedetecteerde signaal door een afname in demping en een vermindering van optische verstrooiing effecten. FUEL is gemeld optreden tussen bioluminescentie Escherichia coli uiting van de lux operon en QD's 18, 19. Terwijl experimenteel vergelijkbaar met de SIQDs, een fundamenteel verschil bestaat: brandstof, is het niet noodzakelijk dat de luminescerende bron fysiek gebonden aan de fluorofoor, waardoor fo zijnr genetische codering van de luminescerende probe. Door de succesvolle detectie van FUEL tussen lichtgevende bacteriën en QD, is het mogelijk dat deze techniek kan worden toegepast op zowel oppervlakkige (huid) en diepe weefsels (long, lever) infecties zoals Staphylococcus aureus en Klebsiellia pneumoniae.

Sinds het verslag van de experimentele betekenis heeft FUEL ontwikkeld tot een robuust wiskundig model 20 dat kan worden gebruikt om aanvaardbare luminescentie en fluorescentie paren voorspellen bevatten en de toepassingen uitgebreid met gebruik omvatten identificatie van fotofysische eigenschappen zoals quantum opbrengst. We beschrijven hieronder een aantal van de basistechnieken van FUEL. Ten eerste, laten we zien bewijs voor dit fenomeen dan zowel de korte (micrometer) en lange (cm) werkafstanden, die fundamenteel onderscheidt brandstof uit BRET. Ten tweede, bij eventuele FUEL paren vergroten zo door behandeling van een breed scala aan fluoroforen en fluorescente nanodeeltjes. Third, worden FUEL toepassingen onderzocht door het vergelijken van gerichte en ongerichte FUEL paren.

Protocol

1. Reagentia

  1. Aankoop of lichtgevende bacteriën en passende cultuur media zoals gewijzigd Escherichia coli uiting van de lux ABCDE 21 ontwikkelen, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22.
  2. Bereid fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl) en kweekmedia oplossingen volgens standaard recepten. E. coli en K. pneumoniae werden gekweekt in Luria Bertani (LB) bij 37 ° C en V. fischeri en Photobacterium sp in LB aangevuld met 0,5 M NaCl bij 22 ° C.
  3. Aankoop of verkrijgen fluorescente probes zoals Q-tracker 705 (40 nm diameter, aangeduid als QD705), Q-tracker 800 (40 nm diameter, aangeduid als QD800), fluorescent (40 nm diameter) en niet fluorescerende polystyreen microsferen ( 48 nm diameter), en conventionele fluorescerende kleurstoffen.
  4. Bereid de benodigde reagentia voor bacteriële etikettering.
  5. Zorgen voor toegang totgeheel dier bioluminescentie imager, zoals een IVIS Spectrum, dat in staat detectiesignaal onder uiteenlopende emissiegolflengten en blootstellingstijden. Een plaat lezer kan bioluminescentie metingen voldoende voor de meeste van de hier beschreven experimenten.

2. Basis Recapitulatie van FUEL

  1. Uitgaande van individuele kolonies op standaard cultuur platen, beginnen 's nachts culturen van lichtgevende bacteriën. Hier V. fischeri werden gebruikt.
  2. De dag van experimenteren, initiëren verse subculturen en hen in staat stellen om de vooruitgang tot een OD 600 van 1-1,5 wordt bereikt. Om vergelijkbare resultaten te produceren is het het beste om bacteriën te gebruiken in een gelijkaardige groei staten waarin zij produceren intense signalen. Dit kan worden gewaarborgd door het houden van de OD 600 constant.
  3. Combineer fracties van 100 pi van elk met 5 pl QD705 of fysiologische zoutoplossing (PS), en vervolgens aan 895 ul van PS in Standard spectroscopische cuvetten. Plaats de gevulde cuvetten in de IVIS Spectrum en neem de metingen onder de juiste filter sets. Hier werd de emissie filter 710-730 nm gebruikt.

3. FUEL over verschillende afstanden

  1. Vul twee kleiner volume (1 ml) kunststof fotometrische cuvetten met ofwel 50 pl QD705 of 97,2 ul van niet-fluorescerende 48 nm polystyreen microbolletjes in een totaal volume van 1 ml PS. Hierdoor dergelijke vaste oppervlak per totaal volume tussen de twee entiteiten.
  2. Bereid een lichtbron cuvette door bekisten een derde cuvet met standaard zwarte tape of ander ondoorzichtig materiaal kunnen blokkeren licht. Bereiden voorzichtig twee identieke optische vensters aan weerszijden van de cuvette.
  3. Plaats de eerder gevulde cuvetten direct op beide zijden van de lichtbron cuvet. Voeg 1 ml van V. fischeri of andere cultuur (dwz lichtgevende E. coli of Photobacterium sp) van een frisse subcultuur in de lichtbron cuvette en bedek het met een ondoorzichtig materiaal, zoals zwart papier om geen licht vervuiling te verminderen.
  4. De interne drie cuvetten onder de corresponderende emissie filters zoals het totale licht en 710-730 nm emissie filters met belichtingstijden van 10, 30 en 30 seconden respectievelijk.
  5. Herpositioneren zowel externe cuvetten bij equivalente verdere afstanden van de centrale cuvette, en dan weer te visualiseren. Herhaal dit totdat een definitieve face-to-face (centraal gereduceerd volume cuvette) afstand van 3 cm is bereikt. Bij elke stap, een fluorescentiebeeld (450-480 nm excitatie, 710-730 nm emissie) aan de QD705 locatie valideren verwerven.

4. Onderzoek naar potentiële brandstofbesparing Pairs

  1. Vul twee gereduceerd volume cuvetten met 1 ml oplossingen die hetzij een fluorofoor of een fluorescente nanodeeltjes plaats in een en PS en PS met niet-fluorescerende nanodeeltjes als de negatieve controle in de andere. In the werk toonde hier diverse potentiële handel verkrijgbare brandstof fluoroforen en fluorescente nanodeeltjes onderzocht zoals aangegeven in tabel 1.
  2. Voeg een 1 ml van verse V. fischeri of andere lichtgevende bacteriën een geblindeerde derde cuvette met twee fysiek gelijke optische vensters aan weerszijden. Bedek de cuvet met een ondoorzichtige stof, zoals een stukje zwart papier.
  3. Bij een korte maar gelijke afstand plaats de twee verlaagde volume cuvetten aan weerszijden van de verduisterde cuvette en visualiseren onder de juiste filters. Hier afstand 0,7 cm gebruikt. Herhaal dit met de andere fluoroforen.

5. Gerichte FUEL

  1. Bereid gebiotinyleerde antilichamen die specifiek zijn voor de lichtgevende bacteriën. Bijvoorbeeld, hier primaire antilichamen specifiek K. pneumoniae (α-Kp) werden gebiotinyleerd met behulp van een oplossing die EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotine.
  2. Overtollig reagens uit de antilichamen middels ontzouten kolommen onder centrifugeren (1500 x g) gedurende 2 minuten.
  3. Gebruik een standaard Bradford assay de eiwitconcentratie te bepalen en bepalen de mate van biotinylering antilichaam door HABA assay.
  4. Haal de α-Kp-biot gebiotinyleerd antilichaam (Ab) batches door menging van 100 ui (10 mM, opgelost in 1 x PBS) met 40 ul α-Kp-antilichaam, hetgeen uiteindelijk een substitutiegraad van 16 biotine residuen per Ab en een definitieve eiwitconcentratie van 10 mg ml-1.
  5. Het gebruik van meerdere nachtelijke repliceren culturen, richten de gewassen bacteriën met voornoemde antilichamen na de geschikte protocol.
    1. In het bijzonder, was het K. pneumoniae in 1x PBS en resuspendeer in 1 x PBS tot een buitendiameter van 4 (ca. 4 x 10 8 CFU ml -1 -1 OD).
    2. Voor elke replicaat, incubeer 100 pl PBS, α -Kp antilichamen (10 pl α-Kp-biotB of 10 ul PBS controle) en 100 ul cellen gedurende 90 min bij 30 ° C. Was de cellen drie keer in 1x PBS en resuspendeer in 196 pi PBS.
  6. Label de cellen met de QD705 streptavidineconjugaat en verdeel ze in twee gelijke volumes.
  7. Was een oplossing drie keer en dan resuspendeer het in het juiste volume.
  8. Verdeel 100 pi van de gewassen en ongewassen oplossingen in afzonderlijke putjes van een zwarte plaat met 96 putjes. Meet de resulterende luminescentie onder de Total Light, 490-510 nm en 710-730 nm filters. Fluorofoor concentratie kan worden bepaald middels 450-480 nm excitatie en 710-730 nm emissie.

Resultaten

Resonance Energy Transfer (RET) is een niet-radiatieve interactie tussen een luminescerend donor en een acceptor fluorescente, waarbij de energie van het verlaten donor kan induceren een fluorescentie reactie van de acceptor door een sterke dipool-dipool interactie 13. RET, die is beschreven met fluorescerende 23, 24 chemiluminescente, bioluminescente en 13 donoren, vereist hoofdzakelijk: 1 sterke spectrale overlap tussen de donor emissie en accepter excitatie spectra. 2 Passende rotatie uitlijning tussen de twee entiteiten.; en 3. een werkafstand niet groter dan 0,5 tot 2 maal de Förster straal R 0, tussen de donor en acceptor 17. Tegenover RET, FUEL treedt op wanneer een luminescerende bron, zoals een bioluminescente bacteriën, een foton uitzendt die wordt geabsorbeerd en opnieuw uitgezonden door een tweede entiteit, zoals een fluorofoor of een fluorescente nanodeeltjes, rood-verschuiving van de emissie spectrum van de oorspronkelijke lichtgevende bron. Aldus FUEL volgens een standaard excitatie-emissie proces vergelijkbaar met standaard epifluorescerende omstandigheden maar zonder het gebruik van een gerichte excitatie. Bewijs hiervan kan gemakkelijk worden waargenomen door het eenvoudig mengen van lichtgevende bacteriën en hoog-fluorescerende quantum dots. In aanwezigheid van de Vibrio sp, wordt een aanzienlijke toename rood signaal waargenomen wanneer QD705 ook in oplossing in vergelijking met een niet-fluorescerende polystyreen microsfeer (fig. 1A). De componenten noodzakelijk bioluminescentie wezen het aldehyde substraat luciferase en ATP maken allemaal geproduceerd zijn en binnen het cytoplasma. Ook de enzymatische luminofoor productie vindt in het bacteriële cytoplasma (Figuur 1B). Zoals elders vermeld, de afstand tussen de binnenste en buitenste membraan van bacteriën is typisch groter dan 30 nm 25-27, een afstand die niet mogelijk aanzienlijke REToptreden. Eveneens, kan het fluorescente nanodeeltjes niet kruisen in het bacteriële cytoplasma aangezien er geen endocytose of ander opname. Samen vormen deze beperkingen geven aan dat FUEL is de dominante excitatie-emissie fenomeen dat optreedt wanneer lichtgevende bacteriën worden gemengd met fluorescerende nanodeeltjes.

Zoals eerder aangetoond, bestaat FUEL buiten het bereik van de RET. De FUEL afhankelijkheid Afstanden onderzoeken, kunnen standaard gereduceerd volume spectrofotometrische cuvetten gebruikt met een met een fluorofoor oplossing, een tweede met een passende controle waarmee controle voor verstrooiing en de derde met een hoeveelheid verse luminescerende oplossing. Het is essentieel dat de centrale cuvet worden omhuld met zwarte tape of een ander ondoorzichtig materiaal, met uitzondering van ten minste twee identieke optische vensters op tegenoverliggende vlakken, om eventuele lichtvervuiling van de luminescerende bron te verminderen. Verder dienen de twee resterende cuvetten teworden equidistant op beide zijden van de centrale cuvet geplaatst. Tenslotte een nieuwe luminescerende oplossing met bacteriën of chemiluminescentie, dient met elke proef maximale lichtopbrengst garanderen. Bij juiste plaatsing, het verwerven van de luminescentiesignaal onder de gewenste filters. De totale licht en 710-730 nm filters werden in dit geval, hoewel slechts de gegevens van het laatste weergegeven. Na elke overname, verhoogt stapsgewijs de face-to-face afstand van 1,0 cm tot 3 cm (figuur 2). Tot slot, normaliseren van de data aan de helderste punt. In de voorbeelden gebruikte gebeurde dit op de kortste afstand (D = 1 cm) tussen de luminescerende bron en de cuvet met het QD705. Met deze aanpak kan levensvatbare FUEL signaal worden waargenomen aan de uiteindelijke overname suggereert dat, bij het ontbreken van een optische absorber, kan FUEL optreden bij afstanden boven elke mogelijke resonantie energie-overdracht en kan alleen worden verklaard een puur stralingsbalans te zijneffect. Montage van de gegevens blijkt een afname in signaal als functie van de afstand D na een D -1 D -2 afhankelijkheid. Afhankelijk van de geometrische configuratie, de voormalige overeen met de condensator afstand afhankelijkheid en de laatste om de kwadratenwet voor puntbronnen. Dit resultaat is derhalve in overeenstemming met onze algehele overname setup, gezien de omvang van de cuvet diafragma en de afstand tussen de lichtgevende bron en de fluorofoor.

FUEL geldt niet alleen voor quantum dots, maar ook kan worden waargenomen met behulp van een breed scala van fluoroforen variërend van de Alexa serie fluorescerende microsferen (tabel 2). Om vergelijkbaar met de controle zijn, gelijke concentraties van de verschillende fluoroforen worden gebruikt en het totale oppervlak van de nanodeeltjes constante (tabel 1) gehouden. Door het vergelijken van de fluoroforen en nanodeeltjes om hun adequate controles (PS of PS met niet-fluorescerendepolystyreen microbolletjes), wordt een aanzienlijke toename van het signaal waargenomen bij het emissiemaximum van elke fluorescerende entiteit. De grootste relatieve stijging van signaal werd op te treden waar de tl maximale emissie was het verst van de maximale lichtgevende emissie. Dit komt waarschijnlijk door de verhoogde specificiteit van het fluorescentiesignaal vergeleken met het brede emissiespectrum van de luminescerende bron. Integendeel, is het minst betrouwbaar FUEL signaal gevonden wanneer de twee emissiemaxima niet goed werden gescheiden. Interessant is dat een waarneembaar signaal FUEL vond de gele microsferen hoewel het spectrale verschil minimaal omdat waarschijnlijk de aanzienlijke hoeveelheid van de fluorofoor onderhavige per kraal (350 fluoresceïne equivalenten). De hier getoonde resultaten tonen dat onder bepaalde omstandigheden FUEL kan worden bereikt met verschillende fluoroforen, die de afstemming van probes onder beide i gekozen meest relevante toepassingen kunnenn vitro en in vivo omstandigheden. De significantie van de waargenomen FUEL signaal werd bepaald met een standaard tweezijdige Student's t-test. Als zodanig was alleen de Alexa555 onverenigbaar met de lichtgevende bron gebruikt te worden.

Om de effecten van concentratie op FUEL staand, werden gebiotinyleerde antilichamen gebruikt om lichtgevende bacteriën en streptavidine gekoppelde QDs richten. Belangrijk is dat de bacteriën of luminescentie bron bieden een laag dik genoeg is om de mogelijkheid van RET tussen de luminofoor en de bijbehorende fluorofoor minimaliseren. Na incubatie en wassen om ongebonden antilichamen te verwijderen, worden de biotine-gelabelde bacteriën vervolgens blootgesteld aan streptavidine geconjugeerd QD705 of niet-gefunctionaliseerd QD705 als controle, de verdeelde oplossingen en een set blootgesteld aan verdere wassingen om verwijderen van niet-gehecht QD705. Hier, voor alle vier de voorwaarden, werd de resulterende luminescentie waargenomen onder de totale licht, 490-510 nm, eend 710-730 nm filters, maar alleen de laatste twee filters worden gebruikt voor gegevensanalyse. De aanwezigheid van de QD705 vergeleken met 450-480 nm excitatie en 710-730 nm emissiefilters. Bij onderzoek hebben we weinig tot geen verschil in het rood-verschoven signaal gevonden wanneer de oplossingen werden achtergelaten in een ongewassen toestand (figuur 3). De resulterende fluorescentie signaal onder deze voorwaarde is ook te vinden vrij gelijkaardig te zijn, wat suggereert dat een gelijk aantal QD705 zowel onder de gerichte en ongerichte toestand aanwezig was. Echter, het wassen van de monsters ongebonden QD705 verwijderen biedt een bijna tweevoudige toename in relatieve rood signaal voor de beoogde bacteriën in vergelijking met hun niet-gerichte controle. Onderzoek door fluorescentie kan worden gebruikt om de aanwezigheid of afwezigheid van de QD705 controleren. Relatief, de beoogde gewassen toestand tot een fluorescentie-intensiteit die bijna drie keer minder dan de ongewassen toestand, maar de resulterende roodverschuiving daalde alleen was30%, wat suggereert dat onder zuiver gebonden omstandigheden de gerichtheid van de bacteriën tot een toename in rood-verschoven emissie. Dit impliceert sterk het nut van gerichte FUEL voor toekomstige toepassingen.

figure-results-1
Figuur 1. BRANDSTOF interactie tussen lichtgevende bacteriën en commercieel verkrijgbaar quantum dots leidt tot een toename van rode fotonproductie. Spectrofotometrische twee cuvetten werden gevuld met oplossingen die 100 ul aliquots vers V. fischeri cultuur met een OD 600 van 1-1,5, 895 ul van PS, en ofwel 5 pl QD705 of fysiologische zoutoplossing (PS), alvorens in een IVIS Spectrum en het emissiespectrum verworven wordt geplaatst. Een significante toename in rood signaal verkregen door de aanwezigheid vande QD705, zoals kan worden opgemerkt door de toename van gedetecteerde fotonen • sec -1 • cm -2 (p • s • -1 -2 cm) vergeleken met de controle in het 710-730 nm emissiefilter (A). Hier, de dubbele membraan van de bacteriën sluit de interactie van de luminescerende groepen (blauwe cirkels) en QD705 (zwarte cirkels). De eerstgenoemde zijn alleen in het bacteriële cytoplasma terwijl deze vrij wordt verspreid in de bulk oplossing (B). N = 3 voor elke bacteriële oplossing. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Sporen van brandstof die zich over afstanden completely uitzondering resonantie energieoverbrenging. Spectrofotometrische cuvetten werden gevuld met oplossingen die hetzij 50 ui QD705 en 950 ul fysiologische zoutoplossing (PS) of 97,2 ul van niet-fluorescerende 48 nm polystyreen microbolletjes en 902,8 ul van PS en gelijke afstand tegenover elkaar geplaatste een centrale zwarte cuvet 1 ml verse luminescerende Photobacterium sp bij een OD 600 van 1-1,5. De centrale cuvette had twee identieke optische vensters zodat de uitgezonden fotonen vrij verspreiden. Het verwerven van beelden bij afstanden (D) van 1,0 cm tot 3 cm, de waargenomen productie van rood licht af als functie van de afstand wordt aangetoond dat FUEL kan op afstand niet haalbaar door resonantie energieoverbrenging. De intensiteit bleek D -2 afhankelijkheid, vergelijkbaar met het kwadraat (links) hebben. Hetzelfde protocol werd gevolgd E. coli (rechts). De resulterende trendlijnen vasthouden vorm aan het concept that de bacteriën worden als puntvormige lichtbronnen. Een totaal van drie onafhankelijke metingen afstand werden verworven met elk een unieke subcultuur. Error bars aanwezig zijn op elk punt. In sommige gevallen waren de fout bars kleiner dan de gebruikte symbolen die de genormaliseerde intensiteit te geven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Vergelijking van gerichte (specifiek) en ongerichte (bulkoplossing) de brandstof. K. pneumoniae werden gefunctionaliseerd met gebiotinyleerde antilichamen en vervolgens blootgesteld aan met streptavidine gemerkt (gerichte) of niet-gemerkte (ongerichte) QD705. De verkregen oplossingen werden even diviDED en een set drie keer gewassen met PBS alvorens te worden gesuspendeerd in zijn oorspronkelijke volume in PBS. De oplossingen werden vervolgens verdeeld in afzonderlijke putjes van een zwarte 96-putjesplaat en de bioluminescentie waargenomen onder de emissie filters 490-510 nm (500 nm) en 710-730 nm (720 nm) (aangeduid als blauwe staven). De p • sec -1 • cm -2 gevonden van de 720 nm filter voor elk putje werd genormaliseerd door de respectieve p • sec -1 • cm -2 bioluminescentie intensiteit van de 500 nm van dezelfde put. De relatieve fluorescentie-intensiteit als gevolg van een epifluorescerende excitatie werd bepaald middels 450-480 nm excitatie en 710-730 nm emissie filters (aangeduid als rode staven). Weinig tot geen verschil in bioluminescente of fluorescerend signaal werd waargenomen onder de ongewassen voorwaarden (ongerichte Ongewassen en Gerichte Ongewassen). Dit suggereert dat de gebonden en vrij zwevende QD705 waren even enthousiast over de bioluminescentie fotonen. Na wassen, nvroeg twee-voudig verschil in relatieve rode signaal werd waargenomen voor de QD705-gemerkte bacteriën (Targeted gewassen) vergeleken met de controle (niet-gerichte Gewassen). Aangezien QD705 in de ongerichte Gewassen werd bevestigd door het ontbreken van fluorescentiesignaal en geverifieerd QD705 etikettering in de gerichte Gewassen staat. De gegevens van vier onafhankelijke kweken van K. pneumoniae. Voor de duidelijkheid, de legende geeft de bron van de QD705 excitatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Fluorofoor Concentratie pl PS (pl) λ max ex / em (nm) Emissie Filter (n m)
Alexa 555 37,2 uM 4.77 995,23 555/565 570-590
Alexa 568 37,2 uM 4.77 995,23 578/603 590-610
Alexa 633 37,2 uM 4.77 995,23 632/637 650-670
37,2 uM 4.77 995,23 702/723 710-730
Niet-fluorescerende 2,62% vaste stof 9.72 990,28
μSph Pink 5% vaste stof 4.77 995,23 580/605 610-630
μSph Geel 5% vaste stof 4.77 995,23 505/515 510-530
QD705 2 uM 5 995 465/705 710-730
2 uM 5 995 465/705 790-810
width: 108px; "> Alexa 700 height: 22px; width: 108px; "> QD800

Tabel 1. Eigenschappen van fluoroforen gebruikt in de FUEL demonstraties.

Controle filter fluorofoor Controle p-waarde
p · sec · cm -1 -2 SD p · sec · cm -1 -2 SD
A555 PS 580 1,08 x 10 7 3,31 x 10 6 9,09 x 10 6 1,75 x 10 6 0.233
A568 PS 600 8,47 x 10 6 4,23 x 10 6 4.49 x 10 6 9,71 x 10 5 0.094
A633 PS 660 2.40 x 10 6 1.25 x 10 6 7.85 x 10 5 2.39 x 10 5 0.046
A700 PS 720 5.53 x 10 5 2.46 x 10 5 1,54 x 10 5 6.05 x 10 4 0.026
MSPH Geel niet-fluorescerende μspheres 520 1,19 x 10 8 4.85 x 10 7 5.79 x 10 7 1,99 x 10 7 0.057
MSPH Pink niet-fluorescerende μspheres 620 2,37 x 10 7 1.36 x 10 7 2,16 x 10 6 8.00 x 10 5 0.026
QD705 niet-fluorescerende μspheres 720 1,76 x 10 7 7.33 x 10 6 2,08 x 10 5 7.16 x 10 4 0.007
QD800 niet-fluorescerende μspheres 800 7,79 x 10 6 4,72 x 10 6 3.60 x 10 4 1,52 x 10 4 0.023

Tabel 2. Identificatie van fluoroforen en fluorescerende nanodeeltjes compatibel met brandstof.

Discussie

De fundamentele demonstratie van FUEL kan eenvoudig worden bereikt door het mengen van lichtgevende bacteriën met fluorescerende nanodeeltjes of QD's. De twee entiteiten fysiek gescheiden zijn en blijven zonder enige efficiënte RET afstand. Moeilijker is de brandstof signaal optimalisatie zowel in vitro als in vivo. Onder in vitro omstandigheden, zowel met als zonder optische absorptie aanwezig, gewoonlijk de toevoeging van overmaat fluorofoor zal volstaan ​​om de FUEL respons te maximaliseren. Bij hoge concentraties verschijnselen zoals statische of botsing quenching kan leiden tot een verlies van fluorescerend signaal. Het uitvoeren van een verdunningsreeks van onafhankelijk variëren van de concentratie van de luminescerende bron en de fluorofoor zal helpen om de gewenste concentraties te optimaliseren. De oprichting en optimalisatie van FUEL onder in vivo concentraties is veel moeilijker en moet van geval tot geval moeten worden aangepakt. Het kan moeilijk zijn om een ​​co creërenndition waar de fluorescerende entiteit kan optisch worden benaderd door de lichtgevende bron. Als zodanig, te beginnen met directe co-injecties van de twee groepen kan informatie met betrekking tot het succes van FUEL onder optimale omstandigheden.

Standaard protocollen bestaan ​​voor het labelen van bacteriën en eukaryote cellen met fluorescerende entiteiten zoals de Alexa-serie en QD's. Vaak moet oppervlak functionalisering of activering met antilichamen, wat kan leiden tot ongewenste effecten zoals verminderde cellevensvatbaarheid of gewijzigde metabolische activiteit. Om dit te overwinnen, is het belangrijk om te bepalen van de optimale hoeveelheid antilichaam of activatie agens nodig die cellulaire minimaliseert verstoringen tegelijkertijd de fluorescente labeling. Het gebruik van QDs is voordelig vanwege hun kenmerkende brede excitatiespectra, smal en afstembare emissiespectra en de mogelijkheid van een grote Stokes verschuiving. Echter, QDs cytotoxisch en niet gewenst zijn in sommige gevallen.

FUEL is een verschijnsel dat in veel BRET experimenten 13 is en is toepasbaar op een verscheidenheid van luminescentie en fluorescerende bronnen. Tot nu toe werden de fotonen gevolg van BRANDSTOF als het product van niet-specifieke interacties of een ongelukkige achtergrondsignaal gevolg van slecht ontworpen BRET experimenten. Het is alleen met de aard van de experimenten hier laten zien dat we in staat waren om het nut van deze ongewenst signaal te identificeren. In de getoonde voorbeelden, de lichtgevende bacteriën fungeren als een diffuse excitatiebron staat tot het opwekken van een standaard fluorescente reactie van een grote verscheidenheid van fluorescente eenheden. Bovendien, als gevolg van de aanzienlijke werkafstand, is het veilig om te concluderen dat terwijl FUEL kan worden gebouwd zonder het optreden van Bret in het algemeen BRET kan niet worden waargenomen zonder een bijdrage van FUEL. Belangrijk is door het ontbreken van een targeting vereiste brandstof worden gebruikt om de ruimtelijke kloof tussen BRET en Conventional hele dier beeldvormende technieken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren concurrerende financiële belangen. JD, SB, KLR en SLS bijgedragen aan Europees octrooi EP10290158.4 en World Intellectual Property Organization octrooiaanvrage WO/2011/117847.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag hun dankbaarheid voor financiële ondersteuning uit het Pasteur Stichting van New York uit te breiden (JD, CS, CS), de EU-FP7 programma "Automation" (SLS), het Institut Carnot Programma 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) en Project IMNOS (RT, SLS), de Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), de European Masters in Molecular Imaging (IT), het programma Regio Ile de France MODEXA (SLS), SESAM (SLS) en DimMalInf (SLS, RT), de ANR Programma Grandes Investissement de l'avenir Infrastructures Nationales en Biologie-Sante: Frankrijk LifebioImaging (FLI) Frankrijk Life Imaging (RT, SLS), Frankrijk Bioimaging (JD, SLS) en de Institut Pasteur, Parijs. Verder zou de auteurs willen bedanken, Jose Bengoechea en Herbert Schweizer voor reagentia. Verder zou De auteurs willen Cindy Fevre die de antilichamen gegenereerd bedanken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Escherichia coli die het luxABCDE operon tot expressie brengt vriendelijk ter beschikking gesteld door José A. Bengoechea met toestemming van Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145 52145 is een serotype K2-referentiestam
Luria Bertani (LB) standaard groeimedium
Q-Tracker 705 Life SciencesQ21061MP
Q-Tracker 800Life SciencesQ21071MP
Alexa 555Life SciencesS21381
Alexa 568Life SciencesS11226
Alexa 633Life SciencesS21375
Alexa 700Life SciencesS21383
Niet-fluorescerende microspheresPolysciences, Inc15913
Roze microspheresLife SciencesF888740 nm diameter
Gele microspheresLife SciencesF888840 nm diameter
Ivis SpectrumPerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific Pierce21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCOThermo Scientific Pierce21425
HABA assay kit Thermo Scientific Pierce28005
Bradford assayBio-Rad500-0201

Referenties

  1. Hu, K., et al. A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer. J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).
  2. Contag, C. H., et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
  3. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  4. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).
  5. Condeelis, J., Weissleder, R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).
  7. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. 10, (2010).
  8. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).
  9. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. Luminescent probes and visualization of bioluminescence. Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).
  10. Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light. Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).
  11. Saito, K., et al. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging. Nat Commun. 3, 1262(2012).
  12. Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).
  13. Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. The BRET technology and its application to screening assays. Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).
  14. So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).
  15. Wu, Q., Chu, M. Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes. Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).
  16. Wu, C., et al. In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
  18. Dragavon, J., et al. in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. , 790210-790219 (2011).
  19. Dragavon, J., et al. In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).
  20. Holland, A. D., et al. In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer. Methods. , (2013).
  21. Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).
  22. Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect Immun. 31, 71-77 (1981).
  23. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247, 119-136 (2012).
  24. Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).
  25. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).
  26. Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles. Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).
  27. Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods. Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Bioluminescentie resonantie energietransferradiatieve excitatie emissiebioluminescente bacteri nquantum dotsfluorescente nanodeeltjesantilichaam gerichte FUELwhole animal bioluminescentie imager
Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL)
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.