Dit protocol beschrijft qPCR-detectie van cytomegalovirus in formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed biopsieweefsel, wat snel, gevoelig, specifiek is en nuttig voor het interpreteren van twijfelachtige hematoxyline en eosine of immunohistochemische kleuringspatronen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het is cruciaal om cytomegalovirus (CMV) hebben bij het gastro-intestinale (GI) stelsel van immunogecompromitteerde patiënten, gezien hun grotere kans op het ontwikkelen van ernstige infecties. Veel laboratoriummethoden voor de detectie van CMV-infectie ontwikkeld, waaronder serologie, virale cultuur en moleculaire methoden. Vaak zijn deze methoden reflecteren systemische betrokkenheid met CMV en niet specifiek identificeren lokale betrokkenheid weefsel. Daarom wordt de detectie van CMV-infectie in het maag-darmkanaal vaak gedaan door traditionele histologie van biopsie weefsel. Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring in combinatie met immunohistochemie (IHC) zijn de pijlers van onderzoek van deze biopten gebleven. H & E en IHC soms resulteren in atypische (dubbelzinnige) vlekken patronen, waardoor de interpretatie bemoeilijkt. Er werd aangetoond dat kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) voor CMV succes kan worden uitgevoerd op formaline-gefixeerd, paraffine-ingebedde (FFPE) weefsel voor biopsie zeerhoge gevoeligheid en specificiteit. Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe qPCR testen uit te voeren voor de detectie van CMV in FFPE biopsie weefsel in een klinisch laboratorium setting. Deze werkwijze is waarschijnlijk van groot voordeel voor patiënten in gevallen van twijfelachtig kleuring CMV GI biopsieën.
Inleiding
Interpretatie van cytomegalovirus (CMV) in klinische monsters is van cruciaal belang. CMV is een lid van de subfamilie van betaherpesvirinae herpesvirussen. Net als andere herpesvirussen, CMV heeft de mogelijkheid om hardnekkige of latente infectie te vestigen gekenmerkt door een gebrek aan actieve virale replicatie 1. Reactivering virus kan optreden in tijden van stress of andere immunosuppressie, waardoor actieve virale replicatie gekenmerkt door virion afgifte, eventueel vergezeld ziektemanifestaties 2-4. Gastro-intestinale (GI) CMV ziektesymptomen vaak buikpijn en / of bloederige ontlasting 1.
De diagnose van CMV gastro door histologie gebruikt hematoxyline en eosine (H & E) CMV virale insluitsels identificeren. In gevallen waarin klinisch vermoeden wordt hoog nog geen duidelijke insluitingen worden waargenomen, is immunohistochemie (IHC) vaak gebruikt als aanvulling testmethode. Echter, IHCkan ook worden belemmerd door zeldzame niet-klassieke verschijnen cellulaire kleuringspatronen (dubbelzinnig), waardoor de interpretatie moeilijk (figuur 2) 5. Er werd getracht DNA geëxtraheerd uit in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) GI biopsie weefsel en kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) CMV detecteren GI biopsieën gebruiken. Deze techniek is gebleken waardevol bij de detectie van CMV in GI biopsieën, en is bijzonder nuttig in gevallen onduidelijke IHC 5,6. Ook is qPCR ook aangetoond goed correleren met aanvullende klinische CMV testgegevens wanneer het beschikbaar 6. Gebruik van qPCR opsporen CMV kan leiden tot een vroegere diagnose en behandeling wanneer klinisch vermoeden CMV is hoog, maar H & E en CMV IHC negatief.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Met de goedkeuring van de Institutional Review Board, werd een onderzoek van de elektronische databank laboratorium uitgevoerd om in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) blokken die gevallen van cytomegalovirus (CMV)-infectie bij gastro-intestinale (GI) biopten gediagnosticeerd door histopathologie (hematoxyline en identificeren eosine (H & E) en / of immunohistochemie (IHC)).
1. Weefsel bewerken van FFPE GI biopsieweefsel
- Verzamel FFPE GI biopsieweefsel blokken voor het cytomegalovirus (CMV) kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR). Deze blokken worden opgeslagen bij kamertemperatuur.
- Pre-label 1,7 ml microfugebuizen met het blok uniek identificatienummer.
- Blokkeer de microtoom handwiel.
- Seat het weefsel blok in de cassette klem.
- Met behulp van een nieuwe, ongebruikte blad, lijn de blok aan het mes hoek op de microtoom.
- Pas de microtoom tot 10 micrometer dikke secties gesneden.
- Unlock the handwiel en vooraf het blok in de richting van het blad.
- Snijd 5 delen van het blok bij 10 micrometer dik intervallen, waardoor elke snede te rollen in een rol van weefsel. Zorg ervoor dat elke scroll bevat een adequate vertegenwoordiging van de gewenste biopsie weefsels.
- Blokkeer de microtoom handwiel.
- Met een pincet, plaats alle 5 rollen van weefsel in de pre-gelabelde centrifugebuis, terwijl u alleen manipuleren van de scroll door de paraffine om mogelijke kruisbesmetting te verminderen. Snap de dop op de tube en plaats het terug op het rek.
- Verwijder het weefsel blok van het microtoom.
- Verwijderen en het blad verwijderen.
- Ontsmet elk oppervlak of instrumenten die mogelijk in contact zijn gekomen met de vorige weefsel.
- Zet een nieuwe, ongebruikte mes in de meshouder.
- Herhaal stap 1,4-1,14 per extra blok te verwerken. De microfuge buizen die het weefsel rollen kan worden bewaard bij kamertemperatuur totdat de time van DNA-extractie.
2. DNA-extractie van Scrolls van FFPE GI biopsieweefsel
OPMERKING: Dit protocol is een bewerking van de bijsluiter van de FFPE weefsel DNA-extractie kit (LET OP: zie Material Safety Data Sheet (MSDS)).
- Voeg 1 ml xyleen (LET OP: Raadpleeg MSDS) aan elk monster microfugebuis. Sluit het deksel en vortex krachtig gedurende 10 sec.
- Ga verder met de DNA-extractie zoals specifiek in product insert van de fabrikant beschreven met de volgende wijzigingen.
- Voeg eerst 6 pl van de interne controle (IC) aan elk microfugebuis.
- Na de ATL / proteinase K lysis incubatie bij 56 ° C gedurende 1 uur incuberen bij 99 ° C gedurende 30 min, dan 90 ° C gedurende 1 uur.
- Tijdens de uiteindelijke DNA elutiestap, open de deksel van de kolom DNA zuivering en 50 pl gedestilleerd DNAse / RNAse-vrij water toegepast in het midden van het membraan, in plaats buffer ATE.
OPMERKING: Raadpleeg de bijsluiter voor de juiste opslag en de bereiding van reagentia. DNA moet worden geëxtraheerd uit alle 5 FFPE scrolls. Voer alle centrifugatiestappen bij kamertemperatuur (15-25 ° C).
3. QPCR voor CMV
- Polymerase Chain Reaction (PCR) procedure
- Genereer een Excel-PCR werkblad voor de CMV-test run. Dit Excel-werkblad berekent de totale hoeveelheid van elk reagens dat nodig is om de master mix met Mg. Het vermenigvuldigt de hoeveelheid van elk reagens dat nodig is per monster (zie hieronder) maal het aantal monsters en controles plus een (om te compenseren voor verliezen als gevolg van pipetteren).
- Neem de volgende reagentia in elke PCR-reactie in de hoeveelheid aangegeven:
Reagens0; Bedrag per Sample
CMV LC master mix flacon 12,5 ul
Mg Oplossing gele flacon 2,5 pl
Totale volume 15,0 ul
- Neem de volgende reagentia in elke PCR-reactie in de hoeveelheid aangegeven:
- Opnemen in elke test, lopen een water of geen doel controle (NTC), negatieve controle, een lage positieve controle, een hoge positieve controle, en ofwel QS3 of QS4, en alle patiënten monsters. De haarvaten moeten worden opgezet in deze volgorde.
- Haal het koelblok specifiek voor de real-time PCR instrument wordt bewaard bij 4 ° C. Plaats de geschikte capillaire buisjes in het koelblok. Raak het oppervlak van de capillaire buizen niet aan. Gebruik altijd handschoenen bij het hanteren van de haarvaten.
- Stel alle polymerase kettingreacties in een schone kap niet verontreinigd zijn met versterking productiets.
- Verwijder het juiste aantal master flacons uit de PCR-kit om alle monsters van patiënten, plus 5 controles te testen. Laat de meester flesjes, Mg-oplossing, en PCR kwaliteit water dooi in het koelblok. Elke meester flacon bevat voldoende reagentia voor 12 testen.
- Voorzichtig vortex de meester flesjes en ze snel draaien in de centrifuge bij de maximale snelheid.
- Combineer de inhoud van elke master flacon in een flesje, en opnieuw voorzichtig geschud.
- Combineer de master mix en Mg oplossing in de op de PCR-werkblad aangegeven in een enkele steriele microfugebuis bedragen.
- Meng voorzichtig en aliquot 15 pi master mix met Mg in de capillaire buisjes, met uitzondering van de capillaire op positie 5 die voor de kwantificatie standaard (QS).
- Verplaats het koelblok met de capillaire buizen en master mix met Mg van het schone kap naar een verwerkingsbedrijf kap.
- Voeg 2 pi van interne controle (IC) om de resterende 30 ul van meestermengen met Mg. Meng voorzichtig en aliquot 15 pi in het capillaire op positie 5 (positie voor de QS).
- Pipetteer 10 ul water, controle DNA of DNA-monster in de juiste capillaire buis. Cap de capillaire buizen met behulp van de aftopping tool.
- Neem koelblok / monsters naar de real-time PCR-instrument.
- Genereer een Excel-PCR werkblad voor de CMV-test run. Dit Excel-werkblad berekent de totale hoeveelheid van elk reagens dat nodig is om de master mix met Mg. Het vermenigvuldigt de hoeveelheid van elk reagens dat nodig is per monster (zie hieronder) maal het aantal monsters en controles plus een (om te compenseren voor verliezen als gevolg van pipetteren).
- Programmeer de real-time PCR-instrument (zie tabel 1)
- Amplificatie en detectie uitgevoerd op de real-time PCR-instrument
- Log in op de computer
- Dubbelklik op het pictogram instrument en log in op de software.
- Schakel de real-time PCR-instrument
- Klik op "CMV / EBV" van de voorruit.
- Volg de aanwijzingen van de macro-wizard.
- Selecteer het vakje om een zelf-test uit te voeren wanneer hierom wordt gevraagd door de software. Er moet een zelftest worden uitgevoerd eenmaal per dag het apparaat in gebruik is.
- Noem de run.
- Pas het aantal monster zich in de bovenste LEFt hoek van de pagina om de som van de controles en patiënten die in de run en voer het identificatienummer van elke patiënt monster.
- Klik op het tabblad "Abs Quant".
- Onder "Sample type ', kent u de juiste monster type voor de standaard.
- Typ in de verwachte concentraties voor de kwantificatie standaard (QS).
- Verwijder de capillaire buisjes van de koeler blok en plaats ze in de overeenkomstige positie in de carrousel (koelblok monster # 1 in positie # 1 moet worden geplaatst op de carrousel, enz.).
- Plaats de carrousel in de centrifuge en druk op start het instrument.
- Open centrifuge en verwijder de carrousel.
- Plaats de carrousel in de real-time PCR-instrument. Sluit het deksel.
- Druk op "Start Uitvoeren".
- De real-time PCR-instrument zal elke positie controleren of er een monster. Loop niet weg van het instrument lopen totdat deze controle is voltooid, BWSwannneer een van de capillairen niet in de carrousel. Het instrument zal deze mee en vragen of de run wordt voortgezet. Antwoord ja voor vertrek.
- Zodra de run is voltooid, sluit u het rapport dat werd gegenereerd.
- Klik op "Absolute Kwantificering".
- Klik op de pijl naast Kleur compensatie.
- Klik op "Selecteer Kleur compensatie" van de drop-down box.
- Kies de meest recente kleurcompensatie bestand toe te passen op de run.
- Klik op OK wanneer de doos opduikt.
- Klik op de pijl door Standard Curve.
- Selecteer "gebruik maken van externe" uit het drop-down menu.
- Selecteer de meest recente externe standaardcurve bestand en klik op OK.
- Kijk naar elke bocht onder de absolute kwantificatie menu om ervoor te zorgen dat de bochten aanwezig zijn en niet vlakke lijn, als een concentratie wordt toegewezen. De absolute kwantificatie van de 705/Back 530 wordt automatisch geanalyseerd.
- Quliteit controle
- Genereer een nieuwe standaard curve na elk nieuw lotnummer reagentia wordt ontvangen, of om de zes maanden, wat vaker is.
- Voeg 10 ul van elke norm voor de master mix met Mg. Denk aan de normen die bij de kit zoals eerder uitgepakte DNA.
- Voeg 1 ul van de interne controle voor elke standaard tot de master mix met Mg gebruikt bij het genereren van de standaard curve om nauwkeurige kwantificering te verzekeren. Heeft IC niet toe te voegen aan de master mix met Mg voor de No Template Controle (NTC).
- Bereid een NTC en drie herhalingen van Kwantificering Standards QS 4, 3, 2, 1, en een 1:10 verdunning van QS4 voor de run naar de standaard curve te genereren, in totaal in 16 datapunten.
- Selecteer "repliceren van" in het drop down menu voor herhaalde normen
- Kies kanaal 530/back niets en zet kleurcompensatie bij het analyseren van de run,
- Onder "Standard Curve (In Run)", selecteert u 'opslaan als exexterne "en de naam van de curve. Voer de opmerking in "toegepast als standaard curve" bij het opslaan.
- Grafiek van het resultaat. De resulterende lineariteit coëfficiënt moet ≥ 0,81.
- Voor de dagelijkse runs, onder meer een kopie van QS3 of QS4 als een controle in de aanloop. De huidige externe standaardcurve kunnen in de aanloop worden ingevoerd tijdens de analysefase.
- Run Controls: geen DNA controle, negatieve controle, lage en hoge positieve controles. Verwachte viral load wordt bepaald en aangepast voor elke verkoper en lotnummer.
- Voeg een IC aan elk monster en controle tijdens de DNA-extractie.
- Als een van de controles vallen buiten bereik, noteer de onaanvaardbare resultaten en verwijzen de test voor het oplossen van problemen.
- Frequentie van de controles
- Opnemen in elke run: een NTC, negatief, lage positieve, hoge positieve, en de standaard controle.
Opmerking: acceptabele grenzen voor de controles. Geen pieken moeten worden in achtd voor de no template (NTC) en negatieve controles. Pieken moet aanwezig zijn in het 530 kanaal en verwachte virale ladingen worden bepaald en aangepast voor elke verkoper en lotnummer voor de lage en hoge positieve controles.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een totaal van 228 weefselblokken werden getest door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), die bestond uit 91 cytomegalovirus (CMV) positieve gevallen op basis van histologie en positieve immunohistochemie (IHC), 18 met dubbelzinnige CMV IHC en 79 negatieve controles. Zoals geïllustreerd in figuur 2, zou CMV positieve gevallen aangetoond typische CMV virale insluitingen (A) en / of positief IHC kleuring (B). Dubbelzinnige gevallen zou hebben aangetoond zeldzame...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Veel laboratoria methoden beschikbaar zijn voor de diagnose van cytomegalovirus (CMV), waaronder serologie, virale cultuur, moleculaire viremie testen histologie biopsie materiaal en, zoals onlangs aangetoond moleculaire analyses van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) biopsie weefsel 5,6. Serologie, ooit een steunpilaar van de diagnose, alleen betrouwbaar identificeert blootstelling en niet goed correleert met een acute CMV-infectie 7. Viruskweek, zowel conventionele als vroege antige...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij erkennen Amy Thomasson voor haar hulp bij de voorbereiding van dit manuscript, en Fredrik Skarstedt en Ryan Christy voor hun inspanningen bij de voorbereiding van de cijfers.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.7 ml Microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| Serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μl Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| Blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
Referenties
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
