Methodenartikel

Methode voor het verkrijgen van Primary eierstokkankercellen Van Solid Exemplaren

DOI:

10.3791/51581

⸱

4 februari 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Heath, University of Minnesota, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Maricopa Medical Center and St Josephs Hospital and Medical Center, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft een gedetailleerde methode voor de isolatie en karakterisering van primaire eierstokkanker cellen van vaste klinische monsters. Eierstokkanker klinische monsters worden onderworpen aan enzymatische vertering om levensvatbare, fibroblast gratis ovariumcarcinoom (EOC) cellen zeer geschikt voor verdere toepassingen te verkrijgen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Betrouwbare instrumenten voor het onderzoeken van eierstokkanker initiatie en progressie zijn dringend nodig. Hoewel het gebruik van eierstokkanker cellijnen een waardevol hulpmiddel voor het begrijpen van eierstokkanker, het gebruik ervan heeft vele beperkingen. Deze omvatten het gebrek aan heterogeniteit en de overvloed aan genetische veranderingen geassocieerd met uitgebreide in vitro passage. Hier beschrijven we een werkwijze die zorgt voor een snelle vaststelling van primaire eierstokkanker cellen vormen vaste klinische monsters verzameld op het moment van de operatie. De methode worden klinische specimens enzymatische digestie gedurende 30 minuten. De geïsoleerde celsuspensie wordt toegestaan ​​om te groeien en kan worden gebruikt voor stroomafwaartse toepassing waaronder drug discovery. Het voordeel van primaire eierstokkanker cellijnen vastgesteld eierstokkanker cellijnen is dat ze representatief zijn voor de oorspronkelijke specifieke klinische monsters die afkomstig zijn van en kunnen worden afgeleid van verschillende locaties of primary of uitgezaaide eierstokkanker.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks de relatief lage incidentie, eierstokkanker is de dodelijkste van de gynaecologische aandoeningen en de vijfde belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker onder vrouwen 1,2. Dit is voornamelijk te wijten aan het gebrek aan betrouwbare instrumenten en modellen die trouw recapituleren de initiatie en progressie van de ziekte 3. De meeste van onze huidige kennis over eierstokkanker is mogelijk door het gebruik van geïmmortaliseerde ovariële oppervlak epitheelcellen (IOSEs), eierstokkanker cellijnen en primaire eierstokkanker cellen gewonnen uit ascitisvloeistof 4-7. Helaas is het gebruik ervan heeft verschillende beperkingen waaronder een aantal genetische en fenotypische veranderingen in verband met immortalisatie proces of in vitro passages en de heterogeniteit van de bevolking voortvloeien uit ascitisvloeistof bereiding.

Daarom primaire eierstokkanker cellen afkomstig van herkenbare en specifieke stevige exemplaren van eierstokkanker vertegenwoordigen een unique hulpmiddel voor het bestuderen van de eierstokken progressie van kanker.

De belangrijkste moeilijkheden bij het verkrijgen van deze kwaadaardige cellen zijn te wijten aan een overmatige groei van stromale cellen of fibroblasten, samen met het verlies van levensvatbaarheid en voortijdige gebrek aan proliferatieve capaciteit in de cultuur van deze EOC cellen. Verschillende methoden om eencellige suspensies Om vanaf solide tumoren bestaat, door mechanische middelen of enzymatische dissociatie, maar bepaalde technieken leveren een grotere hoeveelheid van de gewenste uitkomst 8. Hier laten we zien dat enzymatische digestie met dispase II resulteert in een effectief herstel van levensvatbare,-fibroblast gratis EOC cellen. De aldus verkregen EOC culturen zeer gevoelig voor genetische manipulatie en zijn ook bruikbaar in drug tests; die EOC culturen zijn geschikt voor vele verdere toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring
Solid exemplaren van eierstokkanker werden verkregen van de Universiteit van Minnesota Tissue Procurement Facility (TPF) na Institutional Review Board Committee: Human Onderwerp Board (IRB) goedkeuring.

1. Reagens Setup

  1. Bereid volledige DMEM medium aan te vullen DMEM met 10% FBS en 100 eenheden penicilline-streptomycine. Bewaar het bij 4 ° C en opwarmen tot 37 ° C vóór gebruik.
  2. Aliquot dispase II in afzonderlijke volumes van 5-10 ml meerdere bevriezing te voorkomen ontdooit en bewaar bij -20 ° C in een nonfrost gratis vriezer.

2. Tissue Collection

  1. Verzamel vaste specimens van eierstokkanker (~ 5 g in grootte) en het moment van de operatie uit gebieden macroscopisch aangeduid als kanker door een patholoog. Klinische monsters-en, worden geïdentificeerd en geregistreerd volgens de institutionele protocollen.
  2. Plaats exemplaren in een steriele, screw deksel, polypropyleen exemplaren container gevuld met 30 ml ijskoude PBS. Vervoer de monsters uit de chirurgische pathologie laboratorium naar het onderzoekslaboratorium voor verwerking op ijs, en binnen 30 minuten van specimeninzameling (figuur 1).

3. Weefsel bewerken

  1. Werken onder steriele omstandigheden, breng de monsters op een petrischaal (60 mm x 60 mm) met 10 ml verse ijskoude PBS en met een steriel scheermesje, verder gesneden in de kleinst mogelijke (2 mm of minder) delen ( Figuren 2A en 2 B).
  2. Breng het gehakt weefsel in een 15 ml conische buis met 10 ml voorverwarmde (37 ° C gedurende 30 min) dispase II (2,4 U / ml) in DMEM en incubeer bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 30 minuten. Om optimale vertering van de specimens waarborgen handmatig roeren de cel suspensie elke 5 minuten.
  3. Na 30 min incubatie, overdracht (met behulp van10 ml serologische pipet) de cel suspensie op een cel zeef (70 um mesh) bovenop een 50 ml conische buis en een lichte druk tegen het gaas met een zuiger toepassen. Gooi niet gedissocieerde weefsel (nog op de bovenkant van de mesh) en verzamel de verkregen celsuspensie in 50 ml steriele conische buis. Centrifugeer bij 320 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C (Figuur 3).
  4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml DMEM met 10% FBS.
  5. Incubeer de celsuspensie in een petrischaal op 5% CO2 en 37 ° C (Figuur 4).
  6. Verander het medium na 24 uur van de eerste plateren. Dit maakt het verwijderen van celafval en de meerderheid van de aanwezige cultuur erytrocyten.
  7. Vervang het medium elke drie dagen de volgende twee weken, waarna de culturen van primaire EOC klaar voor verdere toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verse klinische monsters van eierstokkanker verzameld na operatie (figuur 1) en in stukjes (Figuren 2A en 2B) die de cel suspensie. Dit zorgt voor een optimale belichting van de specimens aan de enzymatische behandeling. Cel suspensie wordt blootgesteld aan enzymatische digestie en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Tijdens de incubatietijd de suspensie steeds troebel (vooral na elke roeren) en dit is een teken van weefsel disaggregatie. Aan het einde van de i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een beter begrip van eierstokkanker etiologie en ontwikkeling is cruciaal voor het verbeteren van de uitkomst van de vrouwen die door deze verwoestende ziekte. In deze context is het gebruik van gevestigde en "commercieel verkrijgbaar" eierstokkanker cellijn ongetwijfeld enorm nuttig. Echter, vandaag weten we dat kanker cellijnen zijn niet representatief voor de menselijke tumor ze afkomstig zijn uit in vele aspecten, waaronder het gebrek aan heterogeniteit 9,10.

Hier me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zouden graag de medewerkers van de Tissue Procurement Facility van de Universiteit van Minnesota bedanken voor hulp met de patiënt weefselmonsters collectie. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Defensie eierstokkanker Research Program (OCRP) OC093424 naar MB, door Randy Shaver Kankeronderzoek en de communautaire Fonds MB, door de Minnesota eierstokkanker Alliance MB en door de Gynaecologische Oncologie Departementale fonds MB. De financiers hadden geen rol in onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x PBS, steriel Invitrogen14190-144
Schroefdop, polypropyleen specimen container, sterieelThermo Scientific02 1090
DMEM medium, sterieel Invitrogen11995-065
Fetaal bovien serum, sterieelThermo Scientific HycloneSH30396.03
100x Penicilline-streptomycine, vloeibaarInvitrogen15140-122
Dispase II, sterieelRoche04942 078 001
Kleine pincet met fijne punt en scalpelmesje, sterieelFisher Scientificpincet: 08-953E, mesjes: 08-927-5D
Kleine dissectiescharen, sterieelFisher Scientific08-945
15 ml Conische kappenbuizen, sterieelBD Falcon352097
50 ml Conische kappenbuizen, sterieelBD Falcon352027
10 ml Serologische pipet, sterieel Corning13-678-11E
6 ml Spuitpomp, sterieel Tyco Healthcare8881516911
Nylon filter (70 μm ) cel zeef, sterieelBD Falcon352350
5 cm Petri schotel, sterieel Corning430166
10 cm Petri schotel, sterieel Corning430167

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
  2. Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
  3. Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
  4. Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
  5. Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
  6. Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
  7. Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
  8. Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
  9. Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
  10. Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Eierstokkanker cellijnenenzymatische digestiecelisolatieweefseldigestiecelkweekdrugscreeningepitheliaal eierstokkankercelsuspensie

Gerelateerde artikelen