Demonstratie van Proteolytische Activering van de epitheliale natrium kanaal (ENaC) door het combineren Huidige Metingen met de Opsporing van splitsingsfragmenten

Samenvatting

Proteolytische activering van het epitheliale natriumkanaal (ENaC) heteroloog tot expressie gebracht in Xenopus laevis oöcyten kan worden aangetoond door het combineren stroommetingen met een biotinylering benadering om het uiterlijk van ionkanaal splitsingsproducten op het celoppervlak te onderzoeken. Functioneel belangrijke knipplaatsen kunnen worden geïdentificeerd door plaatsgerichte mutagenese.

Samenvatting

De beschreven methoden kunnen worden gebruikt om het effect van proteasen op ionenkanalen, receptoren en andere plasmamembraaneiwitten die heteroloog worden tot expressie gebracht in Xenopus laevis eicellen, te onderzoeken. In combinatie met plaatsgerichte mutagenese biedt deze aanpak een krachtig hulpmiddel om functioneel relevante splitsingsplaatsen te identificeren. Proteolytische activering is een karakteristieke eigenschap van het amilorid-gevoelige epitheliale natriumkanaal (ENaC). De laatste activerende stap omvat de splitsing van de α-subeenheid van het kanaal in een kritische regio die mogelijk door verschillende proteasen wordt aangevallen, waaronder chymotrypsine en plasmine. Om het stimulerende effect van deze serineproteasen op ENaC te bepalen, werd de amilorid-gevoelige volledige-celstroom (I_ami) twee keer gemeten in dezelfde eicel vóór en na blootstelling aan de protease, met behulp van de techniek van spanningsklem met twee elektroden. Parallel aan de elektrofysiologische experimenten werd een biotinyleringsaanpak gebruikt om de verschijning van αENaC-splitsingsfragmenten op het celoppervlak te monitoren. Met behulp van de beschreven methoden werd aangetoond dat de tijdsverloop van proteolytische activering van ENaC-gemedieerde volledige-celstromen correleert met de verschijning van een αENaC-splitsingsproduct op het celoppervlak. Deze resultaten suggereren een oorzakelijk verband tussen kanaalsplitsing en kanaalactivering. Bovendien bevestigen ze het concept dat een splitsingsgebeurtenis in αENaC vereist is als laatste stap in de proteolytische kanaalactivering. De hier beschreven methoden kunnen zeer goed toepasbaar zijn om vergelijkbare vragen te beantwoorden voor andere typen ionenkanalen of membraaneiwitten.

Inleiding

Proteasen zijn enzymen betrokken bij verschillende fysiologische reacties variërend van de bekende proteolytische afbraak van eiwitten in het kader van de spijsvertering, zeer geavanceerde protease cascades betrokken bij complexe regulerende signaalroutes. Proteasen worden onderverdeeld in zeven groepen volgens hun katalytische actieve plaats: aspartaat, asparagine, cysteïne, glutaminezuur, metallo, serine en threonine proteasen. Verschillende proteasen richten verschillende knipplaatsen die niet altijd gemakkelijk te voorspellen van de primaire structuur van een eiwit. De MEROPS databank ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) geeft gedetailleerde informatie over een breed scala van proteasen en hun preferentiële klievingsplaatsen. Functioneel relevante knipplaatsen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van plaatsgerichte mutagenese.

Het staat vast dat de proteolytische verwerking van ENaC is een belangrijk mechanisme van de activering van this bijzonder ionkanaal ^1,2. Interessant is er bewijs dat de functie van de verwante zure sensing ionkanaal 1a (ASIC1a) ook door proteasen ^3-5 kan worden gewijzigd. Momenteel blijft een open vraag of proteolytische splitsing kanaal speelt een relevante fysiologische rol in het reguleren van de activiteit van andere ionkanalen of transporteurs. Het is echter bekend dat proteolytische splitsing activeert een groep van G-proteïne gekoppelde receptoren, de protease-geactiveerde receptoren (PAR) ^6. Verschillende serine proteasen (bijv. kanaal activerende proteasen (CAP1-3), chymotrypsine, trypsine, furine, plasmine, neutrofiel elastase en kallikreïne) is aangetoond dat proteolytisch activeren ENaC ^2. Naast serineproteasen, kunnen andere groepen proteasen betrokken bij proteolytische ENaC activatie. Inderdaad, recente gegevens blijkt dat de metalloproteïnase meprin-β ⁷ en de cysteïne protease cathepsine-S ⁸ kan ook activate ENaC. De (patho-) fysiologisch relevante proteasen ENaC activering nog worden bepaald en kunnen van weefsel tot weefsel.

Proteasen zijn bekend voorkeur splitsen op bepaalde plaatsen in de aminozuursequentie. Bijvoorbeeld, de serine protease chymotrypsine toont een specifieke splitsingsplaats patroon klieven na het aromatische aminozuur residuen fenylalanine en tyrosine. In tegenstelling, het serine protease trypsine voorkeur splitst na de basische resten lysine of arginine. Met mutante menselijke γENaC constructen gegenereerd door plaatsgerichte mutagenese kan functioneel relevant splitsingsplaatsen in ENaC heteroloog tot expressie in de eicel expressiesysteem worden geïdentificeerd ^8-13.

Door het injecteren van cRNA voor de drie ENaC subeenheden (αβγ) in geïsoleerde oöcyten kunnen ENaC functioneel tot expressie worden gebracht in deze cellen en de activiteit van de kanalen bij het plasmamembraan kan worden gemetenmet de twee-elektrode voltage-clamp techniek. Door het diureticum amiloride, een specifieke remmer ENaC, het amiloride-gevoelige ENaC gemedieerde gehele celstroom component (A I _ami) kan worden gescheiden van onspecifieke lekstromen of stromen die door andere ionkanalen. Aldus Alf _ami waarden weerspiegelen algemene ENaC activiteit kan worden bepaald door het aftrekken van hele cellen stromen gemeten in aanwezigheid van amiloride uit de overeenkomstige hele-cel stromen opgenomen in afwezigheid van amiloride. Nagaan protease heeft een stimulerend effect op ENaC wordt Alf _ami tweemaal gemeten in dezelfde eicel, dus voor en na incubatie van de eicel in een protease bevattende oplossing. Een toename van A I _ami van de eerste naar de tweede meting geeft ENaC proteolytische activatie. Chymotrypsine of trypsine bekend maximaal te stimuleren ENaC in de eicel expressiesysteem ^2,14 en kan worden gebruikt om vertrouwerm dat proteolytische ENaC activering detecteerbaar is in een bepaalde batch van eicellen.

Parallel aan hele cellen stroommetingen, een biotinylering benadering ⁹ werd gebruikt om te onderzoeken of de verhoging van Alf _ami waargenomen bij blootstelling van de eicellen proteasen correleert met de verschijning van ENaC splitsingsfragmenten op het celoppervlak. Eiwitten aan het celoppervlak gelabeld met biotine en kan van intracellulaire eiwitten worden gescheiden door binding van het gebiotinyleerde eiwitten neutravidine-gemerkte agarose kralen. De gebiotinyleerde eiwitten kunnen worden geanalyseerd door western blot. γENaC splitsingsfragmenten op het celoppervlak kan worden gedetecteerd met een specifiek antilichaam gericht tegen een epitoop in de C-terminus van de γENaC. Functioneel relevante splitsingsplaats (en) te identificeren, voorspelde knipplaatsen kunnen worden gemuteerd met behulp van plaatsgerichte mutagenese. Wildtype en mutante kanalen worden vergeleken in parallel experimenten met oöcyten van de same batch.

Met deze methodiek werd aangetoond voor de eerste keer dat proteolytische activering van ENaC gemedieerde hele cellen stromen correleert met het tijdsafhankelijke verschijnen van ENaC splitsingsfragmenten op het celoppervlak. Deze resultaten wijzen op een causaal verband tussen kanaal decollete en kanaalactivering. Bovendien Via plaatsgerichte mutagenese van potentiële splitsingsplaatsen in combinatie met de twee-elektroden-voltage clamp techniek, functioneel relevant splitsingsplaatsen voor plasmine, ¹³ chymotrypsine en cathepsine-S ⁸ werden geïdentificeerd.

Protocol

1. Isolatie van Xenopus Eicellen en micro-injectie van cRNA

1. Bekomen eicellen van volwassen vrouwelijke Xenopus laevis. Verdoven dieren in 0,2% MS222 en resect ovariële lobben via een kleine incisie in de buik.
2. Isoleer oöcyten uit het ovariële lobben door enzymatische digestie op 19 ° C gedurende 3-4 uur bij 600-700 U / ml collagenase type 2 uit Clostridium histolyticum opgelost in calciumvrije OR2 oplossing (recept in tabel 1).
3. Voor de selectie, plaatst de defolliculated eicellen in een petrischaal onder een binoculair microscoop in een hoge natrium bevattende oplossing (ND96: recept in tabel 1).
4. Selecteer stadium V-VI eicellen en plaats ze in een andere petrischaal met een Pasteur pipet. OPMERKING: Blunt Pasteur pipet door vlammende om eicel letsel te voorkomen.
5. Injecteren eicellen met cRNA (bv. 0,2 ng per αβγENaC subeenheid). Ontbinden cRNA in RNase-vrij water. OPMERKING: Totalevolume geïnjecteerd in elke eicel is 46 nl.
6. WINKEL geïnjecteerde oöcyten bij 19 ° C in een laag natriumgehalte oplossing natrium laden van de oöcyten te voorkomen (ND9: recept in tabel 1). Supplement oplossing met 100 U / ml natrium-penicilline en 100 ug / ml streptomycine sulfaat om bacteriële groei te voorkomen. Zorgvuldig omgaan met de eicellen tot het bedrag van beschadigde of dode eicellen te beperken en ze te handhaven in individuele kleine groepen in een 12-well-plaat putten gevuld met bad oplossing tijdens de twee dagen na cRNA injectie.

2. Uitvoeren van twee-elektrode Voltage-clamp experimenten

1. Meet de eicellen twee dagen na injectie.
2. Vul een spuit van een zwaartekracht gevoed perfusie-systeem met ND96 oplossing en een andere spuit met ND96 oplossing die amiloride (2 pm). Mount spuiten 50 cm boven de eicel bad kamer. Opmerking: De concentratie van de remmer ENaC amiloride werd gekozen om 20 keer hoger dan de _IC50 te (100 nM).
3. Zet op een koude lichtbron 150 W halogeen en aanpassen tot 10 cm boven de eicel bad kamer waarmee een goede visualisatie met de binoculair microscoop. Draai vervolgens aan de zuig-en stel de zuigbuis aan het einde van de eicel bad kamer. Zoek zuigbuis tegenover buizen superfusie 'adapter invoeren van de eicel bad. OPMERKING: Zuigkracht moet voldoende zijn om continue stroom van de oplossing superfusing de eicel te ondersteunen.
4. Pas superfusieapparaat snelheid van elke oplossing tot 3-5 ml / min door de zwaartekracht iv stromingsregelinrichting. Sluit de superfusie buizen met een adapter om de eicel bad kamer.
5. Trek glazen capillairen met een micropipet trekker om tip diameter van <1 micrometer te verkrijgen. Vul dan haarvaten tot ~ 1/4 met 3 M KCl. OPMERKING: Zorg ervoor dat de gechloreerde deel van de zilveren draad van de houder elektrode wordt ondergedompeld in KCl oplossing. Controleer luchtbellen in het uiteinde van de capillair. Luchtbellen afbreuk doen aan de meetbare meting door toenemende resistentie strooicapaciteit.
6. Plaats de capillairen in de elektrode houders van de stroom en de spanning elektrode en plaats ze in ND96 met amiloride (2 uM) oplossing met de micro-manipulatoren.

3. Meting van amiloride-gevoelige Whole-cell Currents

1. Nul de elektrode potentiaal van de elektrode spanning _(Vm) en de huidige electrode (V _e) door aanpassing van de V _m V _e offset _toetsen. OPMERKING: De weerstand moet 1-2 MQ voor de elektrode _Vm en 0,5 meten -1 MQ voor de huidige injectie elektrode.
2. Plaats de eicel in het bad kamer in de nabijheid van de spanningsdetectie-elektrode. OPMERKING: Sluit de eicel niet bij een van deze overdracht stappen beschadigen. Met een Pasteur pipet om de eicel overbrengen. Om beschadiging van de eicel de randen van de pipet te voorkomen dient te worden ondermijnd door vlammen.
3. Spietsen oocyten voorzichtig met beide micro-elektroden.
4. Stel het bedrijf potentieel op de versterker tot -60 mV en zet de grafiek recorder. Zet de amiloride (2 uM) bevattende oplossing. OPMERKING: De huidige moet ongeveer 0 ± 0.5 uA. Grotere lekstromen duiden op een lekkende impalement. Daarom dienen deze eicellen worden afgewezen. Bovendien moet de lekstroom gemeten in aanwezigheid van amiloride (2 uM) vergelijkbaar αβγ-WT expressie eicellen die gemeten αβγ-mutant ENaC expressie eicellen zijn. Dit betekent dat de mutaties geen invloed op de amiloride-gevoeligheid van het kanaal.
5. Start de opname. Indien nodig de versterking aanpassen.
6. Na de gemeten stroom een ​​stabiel plateau bereikt, veranderen in-amiloride oplossing. OPMERKING: Neerwaartse stroom doorbuiging van de huidige sporen corresponderen naar binnen stromen, namelijk beweging van positieve lading (Na ⁺⁾ van de extracellulaire kant in de cel.
7. After een huidige plateau is bereikt (na ~ 60 sec), schakelt de superfusie terug naar de amiloride bevattende oplossing. Nadat de stroom van de eicel de nulmeting huidige bereikt, schakelt de spanning klem en voorzichtig de elektroden trekken.
8. Om nieuwe sluiting van het plasmamembraan toestaan ​​op de sites van impalement, plaatst de eicel in een putje van een 96-wells plaat met 100-150 pi protease gratis ND96 oplossing.
9. Na 5 minuten, breng eicel een protease bevattende oplossing of een controleoplossing zonder protease gedurende 30 minuten incubatietijd. OPMERKING: De incubatietijd afhankelijk van de protease en de bestudeerde kanaal.
10. Na de incubatie stap herhaal de huidige meting (zie 3.2 en volgende). OPMERKING: Het is mogelijk om> 90% van de eicellen te meten na incubatie in protease oplossing.

4. Biotinylatie Assay

1. Selecteer en gooi defecte eicellen onder de binoculair microscoop. OPMERKING: Gebruik injected oöcyten uit dezelfde partij van de stroommetingen en de biotinylering experimenten.
2. Houd biotine bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20 minuten voordat het bij het experiment.
3. Bereid de oplossingen: ND96 en ND96 die de geschikte protease. Bereid pasteurpipetten door ze te labelen en door kort vlammend hun tips om letsel van de eicellen te voorkomen. OPMERKING: Hier, het protease chymotrypsine 2 ug / ml in ND96 wordt gebruikt. Behandel elke groep met een aparte pipet om kruisbesmetting van oplossingen te vermijden.
4. Vul elke well van een 6-wells plaat met 2,5 ml controle ND96 of ND96 met een protease bij RT. Vervolgens stort 30 eicellen per putje en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: Voor de volgende procedures is het belangrijk om de monsters te houden op het ijs te allen tijde. Alle centrifugatie stappen op uitgevoerd bij 4 ° C.
5. Vul elke well van een nieuwe 6-wells plaat met 2,5 ml ND96 (elke groep heeft 3 putten voor de stappen wassen) en wegen van de biotine. OPMERKING: 2,5 mg biotine per goed (1 mg / ml) vereist. Los het biotine in de biotinylering buffer (bijvoorbeeld 25 mg biotine (10 groepen) in 25 ml biotinylering buffer (recept in tabel 1).
6. Breng elke groep van eicellen om een ​​goed gevuld met 2,5 ml ND96. Transfer eicellen achtereenvolgens in twee extra putten met ND96 te wassen resterende protease. Incubeer de eicellen gedurende 5 min in ND96.
7. Breng de eicellen in een putje met 2,5 ml biotine-oplossing en incubeer ze zacht schudden (schudder) gedurende 15 minuten. OPMERKING: Minimaliseer het overgedragen ND96 met de pipet om verdunning van de biotine-oplossing te voorkomen.
8. Overdracht elke groep eicellen in een putje met 2,5 ml buffer quench (recept in tabel 1) aan de biotinylering reactie te stoppen. Vervolgens breng elke groep van eicellen in een tweede put ook die 2,5 ml lessen buffer en incubeer gedurende 5 minuten onder zacht schudden.
9. Verwijder beschadigde of dode eicellen. OPMERKING:Kies hetzelfde aantal eicellen per groep de volgende procedure.
10. Breng elke groep van eicellen om een ​​1,5 ml plastic microcentrifugebuisje. OPMERKING: Minimaliseer de hoeveelheid afschrik buffer die wordt overgebracht.
11. Vervolgens lyseren de eicellen door ze door een 27 G naald in 1 ml lysis buffer (recept zie tabel 1), aangevuld met proteaseremmers.
12. Centrifugeer de lysaten gedurende 10 minuten bij 1500 x g.
13. Zuig supernatant en overgebracht naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met 0,5% Triton-X-100 en 0,5% NP40. Gooi de resterende pellet. Opmerking: De bovenstaande vloeistof gebiotinyleerde plasmamembraan eiwitten en niet-gebiotinyleerde intracellulaire eiwitten.
14. Incubeer de microcentrifugebuizen gedurende 20 minuten op ijs. Herhaaldelijk vortex de buizen gedurende deze periode volledig de eiwitten in NP40 en Triton-X-100 lossen.
15. Centrifuge 100 pl agarose korrels per oöcyt groep gedurende 3 min bij 1500 x g. Nadat decentrifugeren verwijderd supernatant van de bolletjes oplossing en was driemaal met lysisbuffer om de kralen equilibreren met buffer.
16. Pipetteer 100 ul van de gewassen korrels in elke microcentrifugebuis met de eiwit-detergens-oplossing bereid in 4.13 om binding van de gebiotinyleerde eiwitten aan de korrels toe.
17. Incubeer microcentrifugebuizen met overhead rotatie O / N bij 4 ° C.
18. Centrifugeer de microcentrifugebuizen gedurende 3 min bij 1500 x g. Overdragen dan de supernatant naar een nieuwe buis. OPMERKING: Intracellulaire eiwitten niet gemerkt met biotine. Supernatans bij -20 ° C worden bewaard Niet aspireren de kralen.

Detectie van ENaC splitsingsfragmenten op het celoppervlak door Western Blot analyse 5.

1. Was de korrels drie maal met lysisbuffer en voeg 100 ul 2x SDS-PAGE monsterbuffer. OPMERKING: Monsters kunnen bij -20 ° C bewaard of onmiddellijk klaar voor western blot analyse.
2. Kook samples gedurende 5 min bij 95 ° C en daarna buizen plaats op ijs.
3. Centrifugeer de monsters gedurende 3 minuten bij 20.000 xg en de pipet supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis. OPMERKING: Dit supernatant bevat het gebiotinyleerde plasmamembraan eiwitten van het celoppervlak van de eicel.
4. Analyseer 30 ul van dit supernatant door western blot splitsing fragmenten onderzoeken op het celoppervlak.
5. Scheid de gebiotinyleerde eiwitten door SDS-PAGE (natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese) met een geschikt gel (8%, 10%, 12%, afhankelijk van het molecuulgewicht van de splitsing fragmenten onderzocht).
6. Breng de eiwitten polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan door halfdroge blotting.
7. Probe het membraan met een specifiek antilichaam tegen humaan γENaC gericht tegen een epitoop in de C-terminus (zie figuur 3 en ^13).
8. Gebruik mierikswortel-peroxidase gemerkt geit-anti-konijn-antilichaam als secundaire antilichaam.
9. Detecteren chemoluminescerende signalen.

Resultaten

Om te onderzoeken of het serineprotease plasmine ENaC-gemedieerde activeren, Alf _ami individuele ENaC-oöcyten tot expressie werd bepaald voor en na 30 minuten incubatie van de oöcyten in protease-free (controle) (Figuur 2A) of plasmine bevattende oplossing (figuur 2B) met de twee-elektrode voltage-clamp techniek (zie figuur 1). Blootstelling aan plasmine toegenomen Alf _ami in elke eicel gemeten. Daarentegen, in controle-experimenten, 30 min incubatie van ENaC-expressie eicellen in protease-free oplossing had een verwaarloosbaar effect (figuur 2 C, D). Dus met deze methode een stimulatiekanaal van ENaC gemedieerde stroom door plasmine kunnen worden gedetecteerd.

Om de effecten van het muteren vermeende splitsingsplaatsen op de activatie van ENaC gemedieerde stromen, evenals bestuderen op kanaal splitsing, het effect van chymotrypsine voor WT-ENaC werd vergeleken met die vaneen mutant ENaC met gemuteerde prostasin en plasminesplitsing sites (γ _{RKRK178AAAA; K189A).} Het tijdsverloop van kanaal activering door chymotrypsine en het uiterlijk van ENaC splitsingsproducten op het celoppervlak werd onderzocht door verschillende protease incubatietijden (Figuur 4A). Er werd aangetoond dat mutant kanaal vertragingen en vermindert de activering van ENaC gemedieerde stroom door chymotrypsine. Dit wordt gepaard met een vertraagd optreden van een lager molecuulgewicht γENaC splitsing fragment van 67 kDa die overeenkomt met de volledig gesplitste subeenheid. Splitsing fragmenten werden gedetecteerd met een γENaC antilichaam gericht tegen een epitoop in de C-terminus (figuur 3). Deze methodische benadering demonstreert dat het tijdsverloop van proteolytische activatie van ENaC gemedieerde stromen correleert met de verschijning van een 67 kDa γENaC splitsingsproduct op het celoppervlak (fig. 4 B, C). Dit ondersteunt het idee van eenoorzakelijk verband tussen proteolytische kanaal splitsing en kanaalactivering ^13. Bovendien, door het combineren stroommetingen en detectie van fragmenten γENaC op het celoppervlak werd aangetoond dat de gemuteerde knipplaatsen zijn functioneel belang voor proteolytische kanaalactivering.

Figuur 1. Procedure bepalen het stimulerende effect van een protease op ENaC heteroloog tot expressie gebracht in Xenopus laevis oocyten. ENaC activiteit wordt bepaald door meting van het amiloride-gevoelige gehele celstroom component Alf _ami.

Figuur 2. Plasmine stimuleert ENaC-gemedieerde valutats in oöcyten uiten ENaC. (AD) oöcyten die menselijke ENaC werden gedurende 30 min in-protease-free oplossing (controle) of in oplossing met plasmine (10 ug / ml). Voor Alf _ami bepalen voor (-) en na (+) incubatie werden de oöcyten vastgeklemd met een potentiaal van -60 mV (A, B) Vier representatieve gehele celstroom sporen afgeleverde partij eicellen.. Amiloride (ami) was aanwezig in de badoplossing specifiek remmen ENaC aangegeven door zwarte balken. (C) Gegevenspunten verkregen uit een individuele oöcyt zijn verbonden door een lijn. (D) Samenvatting van soortgelijke experimenten zie C. Kolommen vertegenwoordigen relatieve stimulerend effect op Alf _ami berekend als de verhouding van Alf _ami gemeten na 30 minuten incubatie (Alf _ami 30 min) om de eerste Alf _ami (Alf _ami initiële) gemeten voor de incubatie. Getallen in de kolommen geven deaantal individuele eicellen gemeten. N geeft het aantal verschillende partijen van eicellen. (Dit cijfer is gewijzigd van [Haerteis et al. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])

Figuur 3. Model van de γENaC subeenheid geeft splitsingsplaatsen voor proteolytische activering en de bindingsplaats van het antilichaam gebruikt. Proteolytische splitsing door het Golgi-geassocieerde convertase furine is belangrijk voor ENaC rijping in de biosynthetische route voor het kanaal de plasmamembraan bereikt. Na splitsing door furine een 76 kDa fragment worden gedetecteerd op het celoppervlak met een biotinylering benadering en een antilichaam tegen een epitoop in de C-terminus van de γ-subeenheid. De cruciale laatste stap in proteolytische NLaC activering vindt waarschijnlijk plaats op het plasmamembraan waar γENaC wordt gesplitst door extracellulaire proteasen (bijv. plasmine en chymotrypsine) in een gebied distaal van de furineplaats resulteert in een 67 kDa fragment decollete. (Dit cijfer is gewijzigd van [Haerteis et al. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])

Figuur 4:. Muterende beide plasmine (K189) en prostasin splitsingsplaats (RKRK178) vertraagt ​​de activatie van ENaC gemedieerde stromen en de verschijning van een 67 kDa splitsingsproduct van γ-subeenheid van het kanaal oöcyten tot expressie WT (open symbolen) en γ _{RKRK178AAAA; K189A} ENaC mutant kanaal (gesloten symbolen) werden gedurende 30 min in-protease-free oplossing (controle) of 5, 30 of 60 min in een oplossing die chymotrypsine (2 ug / ml). (A) Alf _ami bepalen voor en na incubatie werden de oöcyten vastgeklemd met een potentiaal van -60 mV. Cirkels geven de verhouding van Alf _ami gemeten na 5, 30 of 60 minuten incubatie (Alf _ami min) om de eerste Alf _ami (Alf _ami initiële) gemeten voor de incubatie. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde Alf _ami gemeten 22-24 afzonderlijke eicellen vier verschillende batches. (BD) Terwijl de detectie van Alf _ami expressie van gebiotinyleerde γENaC op het celoppervlak werd geanalyseerd door SDS-PAGE. γENaC werd gedetecteerd met een antilichaam tegen een epitoop in de C-terminus van humaan γENaC. Representatieve Western blots ve lading oöcyten weergegeven. (CE) Densitometrische analyse van drie western blots vergelijkbaar met die getoond in B of D. elke baan, de signals gedetecteerd in de regio van 76 kD (open kolommen) en 67 kD (grijze kolommen) werden bepaald en genormaliseerd tot de som van de totale gedetecteerde signaal. N geeft het aantal verschillende partijen van eicellen. Klik hier voor grotere afbeelding.

Discussie

In dit manuscript een methodologische aanpak die met succes werd toegepast op de mechanismen die ten grondslag liggen aan de activering van ENaC door proteasen studie wordt beschreven ^8,13. De gevestigde Xenopus laevis oöcyten expressie systeem werd gebruikt om functioneel uitdrukkelijke ENaC. ENaC functie werd beoordeeld met de conventionele twee-elektrode voltage-clamp techniek. Plaats-gerichte mutagenese werd gebruikt om functioneel relevante protease splitsingsplaatsen identificeren. Biotinylering experimenten uitgevoerd parallel met de elektrofysiologische metingen mogelijk correleert het uiterlijk van ENaC splitsingsproducten op het celoppervlak met proteolytische actuele activering. Een correlatie tussen het tijdsverloop van de huidige activering en de verschijning van proteolytische splitsing fragmenten aan het celoppervlak ondersteunt het concept van proteolytische activatie kanaal.

Twee-elektrode voltage-clamp opnamen vereisen de impalement van een oocyte met twee micro-elektroden. Deze procedure wordt gewoonlijk slechts een keer uitgevoerd bij een individu eicel. Het was echter mogelijk om de micro-elektroden verwijderen na een eerste volledige-celstroom opname zonder zichtbare beschadiging van de eicel. Inderdaad, lijkt het plasmamembraan op de sites van impalements om opnieuw te verzegelen binnen een paar minuten. Aldus, na een eerste twee-elektrode voltage-clamp meting, is het mogelijk om de eicel overbrengen van de experimentele stroom kamer van de twee-elektroden-voltage clamp opstart een microcentrifugebuis of een putje van een plaat met 96 putjes vol een klein volume test of controleoplossing. Daarna kan dezelfde eicel overgedragen naar de stroomkamer en kan weer worden gespietst een tweede twee-elektrode voltage-clamp meting uit te voeren. Opmerkelijk was ENaC gemedieerde stromen niet veel verschillen tussen de eerste en tweede meting bij de eicel controle oplossing werd gehandhaafd. Daarentegen incubatie van de eicel in een protease bevattende solution na de eerste meting in verhoogde ENaC gemedieerde stroom in de tweede meting (figuur 2). Deze bevinding geeft aan proteolytische kanaalactivering.

Performing twee stroommetingen in een eicel biedt het voordeel dat de eicel kan worden blootgesteld aan proteasen of andere farmacologische middelen tussen beide metingen van een variabele tijdsduur in een klein volume testoplossing. Dit is belangrijk bij het ​​gebruik van middelen die dure en / of niet beschikbaar in grote hoeveelheden, bijv. gezuiverde protease preparaten. De beperkte beschikbaarheid van middelen kan het onmogelijk (en onbetaalbaar) daarmee bij continue twee-elektrode voltage-clamp vanwege de grote hoeveelheden testoplossing die voor continu superfusing de eicellen met debieten van enkele milliliters per minuut. Bovendien worden continu twee-elektroden-voltage clamp metingen beperkt door de bekende fenomeenEnon van spontane kanaal vervallen ook beschreven voor ENaC ^15. Daarentegen blootstellen eicellen oplossingen van twee afzonderlijke metingen testen tot een uur of meer in het algemeen niet een probleem (zie figuur 4A). Tenslotte twee opeenvolgende metingen uitgevoerd op dezelfde eicel mogelijk gepaarde waarnemingen effecten van geneesmiddelen. Dit heeft een voordeel boven ongepaarde metingen van twee groepen eicellen (protease behandelde en met hulpmiddel behandelde), omdat het probleem van de hoge variabiliteit tussen oöcyten, meestal waargenomen in ionkanaal expressie vermindert. Met gepaarde waarnemingen en de mogelijkheid om de gegevens te normaliseren om de eerste meting zijn er minder eicellen nodig per experimentele groep een significant effect van een farmacologisch middel aantonen. Normalisatie van de gegevens maakt het ook eenvoudig om gegevens van verschillende partijen van eicellen met verschillende ion kanaal expressie niveaus en dus andere basislijn stromen (Figuur 2D vatten). Uiteraard controle-experimenten nodig om deze benadering te tonen dat het ionkanaal van belang is stabiel in-vehicle behandelde controle eicellen van de eerste naar de tweede meting (zie figuur 2).

Om aan te tonen dat proteolytische huidige activatie correleert met de verschijning van ENaC splitsingsproducten op het celoppervlak, een biotinylering benadering oorspronkelijk beschreven door Harris et al.. ⁹ worden gebruikt. Deze procedure (zoals beschreven in de paragraaf protocol en getoond in figuur 4) is aangepast om blootstelling van kanalen proteasen en daaropvolgende activatie van ENaC-gemedieerde wordt parallel met het tijdsafhankelijke verschijnen van splitsingsfragmenten tonen. De biotinylering werkwijze maakt ook de analyse van een algehele verhoging of verlaging van membraaneiwitten naar het celoppervlak. Aldus is deze methode geschikt om het effect van proteasen en andere farmaceutische onderzoekenmacological instantie bij kanaal inbrengen in het plasmamembraan of op kanaal ophalen. Bovendien western blot analyse van de gebiotinyleerde plasmamembraaneiwitten maakt detectie van eiwitfragmenten (bv. proteolytische fragmenten ENaC) of veranderingen in het glycosyleringspatroon die functioneel relevant kunnen zijn.

Concluderend, de combinatie van methoden om het stimulerende effect van proteasen op ENaC gemedieerde hele cellen stromen onderzoeken en tonen een correlatie met het optreden van ENaC splitsingsproducten op het celoppervlak kan nuttig zijn voor een breed scala van toepassingen. In het bijzonder kan deze methoden geschikt zijn om soortgelijke vragen met betrekking tot de regulering van andere ionen kanalen, transporters of transmembraanreceptoren (bijv.-protease-geactiveerde receptoren PAR's) aan te pakken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Equipment
Bath clamp headstage for OC-725C-V	Warner Instrument Corporation
Cold light source - Schott KL 1500 LCD	Schott	#SCOC150200EU	brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3,000 K
E Series electrode holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)	ADinstruments	#ESW-F10v
Left micromanipulator; MM-33L	Warner Instrument Corporation	#64-0055
LIH 1600 - computer interface	HEKA
Magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)	ALA Scientific Instruments, HEKA
OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings	Warner Instrument Corporation
P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller	Sutter Instruments		heat = 550; velocity = 22; time = 200
Right micromanipulator; MM-33R	Warner Instrument Corporation	#64-0056
Series electrode holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)	ADinstruments	#E45w-f10vh
STAT 2 IV gravity flow controller	Conmed	#P-S2V-60
Vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution	Schmalz
INFUJECT 60 ml pump syringes for solutions	Braun	#22050
Injekt-F for lysing the oocytes	Braun	#9166033V
Standard wall borosilicate tubing with filament	Sutter Instruments	#BF150-86-10	outside diameter: 1.5 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm
Complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Applied Science	#11836170001
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	#21217
Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody	Santa Cruz Biotechnology	#sc-2004
NeutrAvidin Agarose	Thermo Scientific	#29200	Neutravidin-labeled agarose beads
NP40 (Nonidet P-40)	Sigma-Aldrich	#I8896
Roti-Load 1 (2x SDS-PAGE sample buffer)	Carl Roth	#K929.2
SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals	Thermo Scientific	#34095
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	#T8787