Motorische controle en balans prestaties is bekend dat ze verslechteren met de leeftijd. Dit document presenteert een aantal standaard-invasieve gedragstesten met de toevoeging van een eenvoudige roterende stimulans voor het evenwichtsorgaan maken en veranderingen in balans prestaties uitdagen in een muismodel van de vergrijzing.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Behavioral Assessment van de Aging Mouse evenwichtsorgaan
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Leeftijd gerelateerde daling in balans prestaties wordt geassocieerd met verslechterende spierkracht, motorische coördinatie en vestibulaire functie. Terwijl een aantal studies tonen de veranderingen in balans fenotype met de leeftijd bij knaagdieren, zeer weinig isoleren van de vestibulaire bijdrage in evenwicht onder zowel normale omstandigheden of tijdens veroudering. We maken gebruik van twee standaard gedragstesten om de balans prestaties van muizen te karakteriseren op bepaalde leeftijd punten over de levensduur: de rotarod test en de schuine evenwichtsbalk test. Belangrijker nog, is een custom-built rotator ook gebruikt om het evenwichtsorgaan van muizen (zonder het induceren van openlijke tekenen van reisziekte) te stimuleren. Deze tests zijn om aan te tonen dat veranderingen in vestibulaire gemedieerde saldoprestaties onderhavige via murine levensduur zijn. Voorlopige resultaten tonen aan dat zowel de rotarod test en de gewijzigde balk test kan worden gebruikt om wijzigingen in saldoprestaties identificeren tijdens veroudering als alternatief meer difficult en invasieve technieken zoals vestibulo-oculaire (VOR) metingen.
Inleiding
Ons gevoel van evenwicht is misschien wel een van de nog meest over het hoofd vitale onderdelen van zelfs de meest elementaire motorische activiteiten zoals wandelen en draaien. Balans wordt beïnvloed door tal van factoren, waaronder spierkracht, motorische coördinatie en vestibulaire functie, en het is alleen in de aanwezigheid van vestibulaire neuropathieën of tijdens normale veroudering dat het belang van een volledig functionerende balans systeem wordt gewaardeerd. Verstoringen van het evenwichtsorgaan worden vaak geassocieerd met ervaringen van vertigo of duizeligheid en onevenwichtigheid leidt tot een verhoogde kans op vallen en daaropvolgende verwondingen 1. Dit is bijzonder kritisch bij oudere bevolkingsgroepen waar watervallen zijn een van de belangrijkste oorzaken van letsel 2.
Vestibulaire functietests zijn gewoonlijk gebaseerd op de vestibulaire reflexen met name de vestibulo-oculaire (VOR) of de vestibulo-Collic reflex (VCR). De VOR en videorecorder zijn essentieel voor de stabilisatie van afbeeldingen ophet netvlies en de positie van het hoofd tijdens bewegingen van het hoofd en lichaam respectievelijk. Gewoonlijk VOR metingen vereisen invasieve implantatie van zoekspoelen oogbewegingen of video volgen van oogbewegingen meten 3. Dit is een uitdaging bij muizen vanwege de kleine aard van de muis oog en de moeilijkheid om de pupil voor video analyse 3 detecteren. Als alternatief is de videorecorder gebruikt om stabilisatie van het hoofd te meten in reactie op bewegingen in muizen zonder de noodzaak van invasieve chirurgie 4. Ondanks dit, weinig studies richten zich specifiek op hoe het evenwichtsorgaan presteert als geheel en wat nog belangrijker is hoe het verandert tijdens het ouder worden.
Om de algehele balans prestaties te beoordelen gewoon en niet-invasief gemodificeerde we twee veelgebruikte gedragstesten. De rotarod en hellende balk proeven te beoordelen verschillende aspecten van de motorprestaties in knaagdieren en voorgaande studies zijn gebruikt in een test batterij volledig verwervenprofiel van de motor vermogen. Deze mogelijkheid kan worden aangetast door ziekte of genetische modificatie, en is ook gevoelig voor processen geassocieerd met een normale ontwikkeling en veroudering 5-7. Eerder werk met behulp van de rotarod is gebleken dat de motorische coördinatie bij muizen af na 3 maanden 8 leeftijd. Bovendien, ratten blijkt merkbaar evenwicht tekorten met toenemende leeftijd op de evenwichtsbalk proef 9.
Dit document beschrijft het gebruik van de rotarod en evenwichtsbalk testen in combinatie met een vestibulaire prikkel om het evenwichtsorgaan uitdagen en karakteriseren de daaropvolgende impact op de balans prestaties bij jonge en oudere muizen. Terwijl de eenvoudige en niet-invasieve werkwijzen beschreven niet zijn bedoeld als stand-alone maatregelen van perifere vestibulaire functie zij een nuttig en gemakkelijk gedragsmaat cellulaire en subcellulaire veranderingen te vergelijken op verschillende stadia van vestibulaire verwerking tijdens normale veroudering bij muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Dieren
- Muizen (C57/BL6) van de leeftijd van 1, 9 en 13 maanden oud werden verkregen van de Animal Resources Centre (Perth, Australië). Deze muizen werden gehuisvest in standaard muis kooien in de Bosch Knaagdieren faciliteit aan de Universiteit van Sydney op een 12/12 uur licht / donker cyclus met toegang tot voedsel en water ad libitum. De hieronder beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Sydney Animal Ethics Committee.
- Breng muis kooien in de testkamer voorafgaand aan elke test voor 10 minuten, zodat muizen om te acclimatiseren aan de testomgeving.
2. Rotarod
- Stel de rotarod apparaat (Figuur 1A):
- Installeer de deuvels in elke baan van de rotarod.
Opmerking: In dit geval rat pennen (70 mm in diameter) worden gebruikt in plaats van de muis pluggen (32 mm diameter) aan de muizen van vasthouden aan de plug en het uitvoeren van "passieve rotaties" 10 ontmoedigen. - Ponerenion de magnetische landingsplatforms op de draad zich onderaan elke baan van de rotarod ervoor te zorgen dat zij niet kantelen aan de vloer van de rotarod raken en worden zo dicht mogelijk bij de magnetische rechterwand van elke baan zonder raken.
Opmerking: Tijdens rotarod testen muizen zijn nodig om te lopen in een voorwaartse richting te blijven op de roterende en versnellen pluggen. Wanneer een muis is niet meer in staat om te verblijven op de plug, ze vallen en verdringen de landing platform, dat vervolgens een magnetische sensor activeert. De tijd tussen de roterende deuvel, de plug tpm bij tijdstip vallen en de afgelegde afstand wordt automatisch berekend voor elke muis en vastgelegd op het scherm aan de voorzijde van de rotarod vallen. - Schuif 2 plastic panelen in de voorzijde van elke rotarod laan met boven de kortere panelen aan de onderkant en de langere panelen.
- Ingang de test parameters via het toetsenbord aan de voorkant van de rotarod. Volg steps 2.1.4.1 naar 2.1.4.6 voor de versnellende rotarod testparameters en stappen 2.1.4.7 tot 2.1.4.12 voor de vaste snelheid rotarod testparameters.
- Geef de maximale duur van de test tot 60 sec.
- Stel het aantal rijstroken te gebruiken (of het aantal muizen te testen).
- Stel de startsnelheid van de test tot 5 rpm.
- Stel de topsnelheid van de test tot 44 rpm.
- Stel de oprit snelheid van de test tot 60 sec.
- De grootte van de gekozen pluggen en de draairichting aan ratten pluggen roteert in voorwaartse richting.
- Geef de maximale duur van de test tot 240 sec.
- Stel het aantal rijstroken te gebruiken om 1 als muizen individueel getest.
- Stel de startsnelheid van de test tot 15 rpm.
- Stel de topsnelheid van de test tot 15 rpm.
- Stel de oprit snelheid van de test op 0 sec.
- De grootte van de gekozen deuvel en de draairichting een rat deuvel roteert in een forward richting.
Opmerking: De bovenstaande instellingen kunnen worden gewijzigd volgens de behoeften van verschillende experimenten passen.
- Plaats een camera voor het rotarod de vaste snelheid rotarod test, waardoor het gedrag van de muis tijdens proeven kunnen worden opgenomen en de video voor latere analyse om de tijdsduur de muizen konden verblijven op de rotarod bepalen.
- Installeer de deuvels in elke baan van de rotarod.
- Volg de stappen 2.2.1 tot en met 2.2.4 voor de versnellende rotarod-test:
- Plaats een muis op elke stationaire plug gedurende 5 minuten om muizen te acclimatiseren aan de rotarod.
- Zachtjes duwen de muizen om de achterkant van de rotarod gezicht en start de rotarod proef als alle proefpersonen geconfronteerd in deze richting (zie figuur 1B).
- Terug alle muizen naar hun kooien als ze zijn gevallen van de roterende pluggen en laat ze rusten gedurende 10 minuten met toegang tot voedsel en water.
- Herhaal de stappen 2.2.1 tot 2.2.3 tot een totaal van 8 proeven en zorg ervoor om schoon te voltooiende pluggen, lanen, en de landing platforms van de rotarod voor urine en ontlasting, en verplaats de landing platformen terug naar zijn uitgangspositie TUSSEN elke proef.
Opmerking: De eerste 3-5 experimenten worden gebruikt als training proeven om de muizen om zich vertrouwd te maken met de taak. De tijd dalen, afgelegde afstand en eind toerental van de plug ten tijde van de val voor elke volgende proef wordt genoteerd voor latere analyse (Figuur 2).
- Volg de stappen 2.3.1 tot en met 2.3.8 voor de vaste snelheid rotarod-test:
- Plaats een muis op een deuvel gedurende 5 minuten om deze te wennen aan de rotarod. De terugkeer van de muis terug naar zijn kooi.
- Start video-opnamen op de camera en druk op start op de rotarod. Plaats de muis op de roterende pluggen zorgen voor het naar de achterkant van de rotarod.
- Stop video-opname op de camera wanneer de muis valt uit de roterende pluggen, en de terugkeer van de muis om de kooien voor 10 min met toegang tot voedsel en water.
- Herhaal de stappen 2.3.2 en 2.3.3 tot een totaal van 8 proeven wordt verworven en zorg ervoor dat de pluggen, lanen, en de landing platforms van de rotarod voor uitwerpselen en urine schoon, en verplaats de landing platformen terug naar zijn uitgangspositie tussen elke proef .
- Schakel de custom-built rotator bij 3 Hz gedurende 20 seconden om de muizen om vertrouwd te raken met het geluid geworden. Stop de rotator na 20 sec door uitschakelen van de boor en handen aan weerszijden van het loopwiel om te voorkomen blijven draaien voorbij de eerste 20 sec.
Opmerking: De rotator zelf bestaat uit een knaagdier loopwiel is bevestigd aan een boor (figuur 3A). In het midden van het loopwiel is een kleine kamer met een maaswijdte deksel wanneer de muis wordt geplaatst (figuur 3B). De rotator draait in een richting tegen de klok om de verticale as. De grootte van de stimulus is in overeenstemming met eerdere studies die aantonen roterende prikkeling variërend 0,2-3 Hz voldoende om algeaten VOR en VCR reacties 4,11,12. - Plaats de muis in de kamer in het midden van de rotor en plaats het deksel.
- Schakel de rotator op de laagste stand van 3 Hz tot 20 sec. Start de rotarod en beginnen video-opname de camera gedurende deze tijd ter voorbereiding van het komende proces. Schakel de boor aan het einde van de 20 seconden en plaats de handen aan weerszijden van het loopwiel te stoppen met draaien. Test de muis in de rotarod onmiddellijk na overdracht door het zo snel mogelijk op de roterende plug.
- Stop video-opname op de camera wanneer de muis valt uit de plug en zet de muis zijn kooi.
- Reinig de doorzichtige plastic panelen met een mild wasmiddel / water mengsel en de cilindrische pluggen, lanen en metalen landing platforms van de rotarod met 70% ethanol bij alle muizen zijn getest.
3. Evenwichtsbalk met Vestibular Challenge
- Het opzetten van de balance bundel apparaat zien in figuur 4A.
Opmerking: De balk inrichting werd aangepast van een inrichting Carter et al (2001) 13.. Voor deze test muizen lopen van het ondereinde van de balk, die 52,5 cm boven de grond, een donkere doel doos (13 x 22 cm, met een 5 x 6 cm deuropening) zich 60 cm boven de grond (figuur 4A ). Muizen natuurlijk proberen uit de duisternis en de bescherming van het doel doos in het voordeel van de zichtbare balken en worden verder aangemoedigd om de balk te doorlopen door de lichte helling die hun natuurlijke ontsnapping mechanisme om te draaien in een opwaartse richting 14 uitbuit. De balk zelf is 1 m lang en heeft een cirkelvormige dwarsdoorsnede met een diameter van 14 mm. Een adequaat reeks bundel diameters worden gebruikt waarmee de onderzoeker de gevoeligheid van de test te passen of geschikt voor grotere onderwerpen. Aan de onderkant van de balk een witte lijn geeft de startlijn. Een andere lijn is geweestgetrokken 60 cm van de startlijn aan de bovenkant van de balk naar de finish (Figuur 4A) te geven.- Positie 2 camera's, een aan elke zijde van de balk, aan de onderkant van de balk (figuur 4B).
Opmerking: Deze camera onder een hoek aan de gehele lengte van de balk vangen en zorgen dat start en finish lijnen op de balk zijn duidelijk zichtbaar. Deze camera's worden gebruikt om video opname het gedrag van muizen als ze doorkruisen de balk, met resulterende video gebruikt voor latere analyse. - Bekleed de bodem van het doel doos met papieren handdoek, om eenvoudige reiniging van urine en ontlasting in staat na het testen van elke muis, en plaats de koepel behuizing van de onderwerpen kooi binnen het doel doos.
- Plaats voldoende schuim of ander opvulmateriaal onder de verhoogde balk om alle onderwerpen die uit het apparaat vallen te beschermen. Muizen die vallen, zal direct worden opgepikt door het experimentER en geplaatst in het doel doos om te rusten.
- Positie 2 camera's, een aan elke zijde van de balk, aan de onderkant van de balk (figuur 4B).
- Plaats een muis in het doel doos voor 2 minuten, zodat het vertrouwd zijn met deze omgeving wordt. Dek de opening naar het doel doos met een gehandschoende hand voor 5 seconden als de muis probeert te lopen op de balk in deze tijd om dit gedrag te ontmoedigen.
- Train de muis door het op de balk net buiten de openstelling voor het doel vak en te laten lopen in het doel in. Blijven om de muis te trainen door het te plaatsen op de balk steeds verder weg van het doel vak totdat de muis is in staat om te lopen vanaf de startlijn naar het doel doos met geen hulp en minimale aarzeling. Laat de muis om te rusten in het doel doos voor 1 min na elke run.
- Beginnen met het testen van de muis tijdens de training is voltooid.
- Start video-opname op camera's.
- Plaats de muis op de startlijn van de balk en wachten terwijl het doorkruist de balk in de richting van het doel in.
- Stop video-opname op cameras wanneer de muis het vak wordt bereikt.
- Laat de muis om te rusten in het doel doos voor 1 min. Verwijder eventuele urine of ontlasting die kunnen zijn afgezet tijdens de proef tijdens het wachten.
- Herhaal de stappen 3.4.1 tot 3.4.4 tot een totaal van 5 proeven zijn afgerond.
- Schakelaar op de custom-built rotator bij 3 Hz gedurende 20 seconden (zoals in de vaste snelheid rotarod test) om de muizen om vertrouwd te raken met het geluid geworden. Stop de rotator na 20 sec door uitschakelen van de boor en plaats de handen aan weerszijden van het loopwiel te stoppen met draaien.
- Plaats de muis in de kamer in het midden van de rotor en plaats het deksel.
- Schakel de rotator op de laagste stand van 3 Hz tot 20 sec. Begin video opname op de camera gedurende deze tijd, als voorbereiding op het komende proces. Schakel de boor aan het einde van de 20 seconden en handen aan weerszijden van het loopwiel om te voorkomen blijven draaien voorbij de eerste 20 sec. Transfer de muis naar het begin van de evenwichtsbalk zo snel mogelijk en wacht terwijl de muis doorkruist de bundel naar het doel in.
- Stop video-opname op camera's als de muis het doel vak wordt bereikt en de terugkeer van de muis zijn kooi.
- Reinig de evenwichtsbalk apparaat met 70% ethanol en verander de papieren handdoek in het doel doos na elke muis is getest.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Rotarod
De motorprestaties van muizen werd beschreven als de Time To Fall (TTF) geboekt bij elke muis over 8 proeven. Met behulp van deze metingen van TTF kan training curves voor elke muis worden uitgezet. Figuur 2 toont voorbeelden van de motorische prestatie van een 1 maand oude muis en een 9 maanden oude muis in de loop van 8 proeven. Deze training curven tonen een toename van TTF in de eerste 3-5 proeven gevolgd door een volgende plateau. Metingen van TTF opgenomen voordat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritische stappen in het protocol
Vorige werk heeft aangetoond dat het gemakkelijk is om muizen ondertraint op zowel de rotarod en evenwichtsbalk apparaat en als gevolg daarvan, kan de overname van nauwkeurige metingen zijn uitdagende 15. Bijvoorbeeld, overtraining op de rotarod kan leiden tot muizen opzettelijk springen uit de pluggen zowel tijdens de acclimatisatie en proefperiodes, terwijl overtraining op de evenwichtsbalk kan leiden tot vaker stoppen (verkennend gedrag) en reizen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs willen The Garnett Passe and Rodney Williams Memorial Foundation en het Bosch Institute Animal Behavioural Facility graag erkennen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Rotarod | IITC Life Science Inc. | #755 | "Rat dowels" = 70 mm diameter. Laat ethanol niet in contact komen met perspex. |
| iPhone | Apple | Kan elk type camera gebruiken. Velcro bevestigd aan de achterkant voor bevestiging aan de 3D scharnierarm. | |
| 3D scharnierarm | Fisso/Baitella | Classic 3300-28 | Elk type stabiele verticale stand zou voldoende zijn. Velcro is bevestigd aan het apicale uiteinde van de arm voor iPhone-bevestiging. |
| Houten loopbalk: 1 m lange strook glad hout met een cirkelvormige doorsnede van 14 mm diameter | Een reeks diameters en doorsnedevormen kan worden gebruikt om aan experimentele parameters te voldoen | ||
| Houten doos (130 x 140 x 220 mm) gemaakt van 11 mm dikke planken | |||
| Steunstatief gemaakt van 41 x 41 mm balken: 2 verticale balken 525 en 590 mm vanaf de grond aan de start- en doelkant respectievelijk; 803 mm horizontale balk die langs de grond direct onder de loopbalk loopt; twee 20 mm lange balken fungeren als "voeten", die de horizontale en verticale balken aan elk uiteinde verbinden; een 21 x 21 x 36 mm blok gehouwen aan het apicale uiteinde van de "startende" verticale balk; een 13 x 13 mm opening uitgesneden uit het midden van dit blok, waardoor een tunnel ontstaat die loodrecht op de loopbalk loopt. | Verstevig alle verbindingen met kleine stalen beugels. | ||
| Zwarte verf (op waterbasis) | Handycan | Acrylic Mat Zwart | 2-3 lagen voor alle houten oppervlakken van het balansbalkapparaat |
| Klare afwerking | Wattle Estapol | Polyurethaan Mat | Enkele laag voor alle balken. Dubbele laag voor alle andere oppervlakken van het balansbalkapparaat |
| Schuim, verpakkingsmateriaal | Om eventuele valpartijen van de balansbalk te dempen | ||
| 70% Ethanol, papieren handdoeken | Reinig balk en doos tussen elk dier in. | ||
| Gaaskussens/papieren handdoeken | Om de bodem van de doos te bekleden | ||
| Muizenhuis (van thuiskooi) |
Referenties
- Agrawal, Y., et al. Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004. Arch. Intern. Med. 169, 938-944 (2009).
- Schwab, C. W., Kauder, D. R. Trauma in the geriatric patient. Arch. Surg. 127, 701-706 (1992).
- Stahl, J. S., et al. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. J. Neurosci. Methods. 99, 101-110 (2000).
- Takemura, K., King, W. M. Vestibulo-collic reflex (VCR) in mice. Exp. Brain Res. 167, 103-107 (2005).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J. Neurosci. 19, 3248-3257 (1999).
- Wallace, J. E., et al. Motor and reflexive behavior in the aging rat. J. Gerontol. 35, 364-370 (1980).
- Ingram, D. K., et al. Differential effects of age on motor performance in two mouse strains. Neurobiol. Aging. 2, 221-227 (1981).
- Serradj, N., Jamon, M. Age-related changes in the motricity of the inbred mice strains 129/sv and C57BL/6j. Behav. Brain Res. 177, 80-89 (2007).
- Gage, F. H., et al. Spatial learning and motor deficits in aged rats. Neurobiol. Aging. 5, 43-48 (1984).
- Rustay, N. R., et al. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behav. Brain Res. 141, 237-249 (2003).
- Xiaocheng, W., et al. Expression of calcitonin gene-related peptide in efferent vestibular system and vestibular nucleus in rats with motion sickness. PloS One. 7, (2012).
- Beraneck, M., et al. Ontogeny of mouse vestibulo-ocular reflex following genetic or environmental alteration of gravity sensing. PloS One. 7, (2012).
- Carter, R. J., et al. Motor coordination and balance in rodents. Curr. Protoc. Neurosci. , (2001).
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat. Rev. Neurosci. 10, 519-529 (2009).
- Luong, T. N., et al. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- McFadyen, M. P., et al. Differences among eight inbred strains of mice in motor ability and motor learning on a rotorod. Genes Brain Behav. 2, 214-219 (2003).
- Shiga, A., et al. Aging effects on vestibulo-ocular responses in C57BL/6 mice: comparison with alteration in auditory function. Audiol. Neurootol. 10, 97-104 (2005).
- Stahl, J. S. Eye movements of the murine P/Q calcium channel mutant rocker, and the impact of aging. J. Neurophysiol. 91, 2066-2078 (2004).
- Fahlstrom, A., et al. Behavioral changes in aging female C57BL/6 mice. Neurobiol. Aging. 32, 1868-1880 (2011).
- Bâ, A., Seri, B. V. Psychomotor functions in developing rats: ontogenetic approach to structure-function relationships. Neurosci. Biobehav. Rev. 19, 413-425 (1995).
- Yu, X., et al. A novel animal model for motion sickness and its first application in rodents. Physiol. Behav. 92, 702-707 (2007).
- Tung, V. W., et al. An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
